回復(fù)引導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白Kazal基元、基質(zhì)金屬蛋白酶-14、內(nèi)皮抑素及血管內(nèi)皮生長因子在喉癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

左文娜（河北省滄州市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北滄州061001）

回復(fù)引導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白Kazal基元、基質(zhì)金屬蛋白酶-14、內(nèi)皮抑素及血管內(nèi)皮生長因子在喉癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

左文娜
（河北省滄州市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北滄州061001）

摘要：目的觀察回復(fù)引導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白Kazal基元（RECK）、基質(zhì)金屬蛋白酶-14（MMP-14、）、內(nèi)皮抑素（Endostatin）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在喉癌中的表達(dá)，并對其相關(guān)性進(jìn)行分析。方法應(yīng)用流式細(xì)胞檢測儀檢測40例喉癌患者的喉癌組織（喉癌組）、癌旁組織（癌旁組）及喉部正常黏膜組織（對照組）中RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF的表達(dá)水平，并統(tǒng)計分析其表達(dá)與喉癌臨床病理因素的關(guān)系及其之間的相關(guān)性。結(jié)果在喉癌組織中，RECK、Endostatin的蛋白FI表達(dá)量顯著低于癌旁組及對照組（P<0.05）；MMP-14及VEGF蛋白的FI表達(dá)量顯著高于癌旁組及對照組（P<0.05）。喉癌組織中RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF蛋白的FI表達(dá)量與喉癌組織的轉(zhuǎn)化程度、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期病理組織學(xué)分級密切相關(guān)（P<0.05），但與年齡的關(guān)系不密切（P>0.05）。表達(dá)相關(guān)性結(jié)果顯示，喉癌組織中RECK與MMP-14表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r= -0.765，P<0.03），喉癌組織中Endostatin與VEGF蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r =-0.563，P<0.04）。結(jié)論RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF有可能參與喉癌的發(fā)生、發(fā)展、分化及轉(zhuǎn)移，并呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，聯(lián)合檢測RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF的表達(dá)，可能有利于臨床對喉癌的診斷。

關(guān)鍵詞：喉癌；回復(fù)引導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白Kazal基元；基質(zhì)金屬蛋白酶-14；內(nèi)皮抑素；血管內(nèi)皮生長因子

近年來，喉癌的發(fā)病率持續(xù)升高，成為耳鼻喉科最常見的腫瘤之一，約占全身惡性腫瘤的1.2%～1.6%。隨著現(xiàn)代技術(shù)的進(jìn)步，對喉癌的癌基因、抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)控因子、表面受體等變化及其涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和效應(yīng)都有進(jìn)一步的認(rèn)識，為喉癌的臨床診斷及治療提供新的思路。本文采用流式細(xì)胞儀檢測與腫瘤密切相關(guān)的癌癥基因[回復(fù)引導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白Kazal基元（reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs，RECK）]、基質(zhì)金屬蛋白酶-14（matrix metalloproteinase-14，MMP-14）、內(nèi)皮抑素（Endostatin）及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）]在喉癌組織中的表達(dá)，并與癌旁組織及喉部正常黏膜組織比較，探討其與喉癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并進(jìn)行相關(guān)性分析，為臨床喉癌的診斷提供新思路。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2010年2月-2013年9月在河北省滄州市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科手術(shù)切除，并經(jīng)病理檢測證實為喉鱗癌的患者40例，包括該患者的喉癌組織（喉癌組）、癌周圍組織（癌旁組）及喉部正常黏膜組織（對照組）。其中喉癌組中男性28例，女性12例；年齡（51.25±4.83）歲；高分化25例，中分化10例，低分化5例；其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。根據(jù)國際抗癌協(xié)會TNM分類臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ、Ⅱ期17例，Ⅲ、Ⅳ期23例；所有患者術(shù)前經(jīng)過放療、化療。本研究所有入選患者簽署知情同意書，并經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2實驗方法

1.2.1制備單細(xì)胞懸液將0.5 g組織放置于120目的不銹鋼網(wǎng)上剪碎，用0.9%氯化鈉溶液及鑷子輕輕搓洗至其自然沉淀，收集細(xì)胞懸液?；鞈乙哼^濾，除去細(xì)胞團塊。1 000 r/min離心3 min，棄上清液。加入1 ml磷酸鹽緩沖液制成單細(xì)胞懸液，記數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個/ml，此液為單分散細(xì)胞懸液。1.2.2細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記取1×106個細(xì)胞約0.1ml上述液體，按1∶100的濃度分別加入0.1 ml的 RECK、MMP-14、Endostatin、VEGF抗體工作液（購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司），加入磷酸鹽緩沖液10 ml，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液。加入羊抗兔FITC-IgG二抗工作液，常溫孵育30 min，避光，熒光染色。去除未結(jié)合熒光二抗。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測條件及參數(shù)采用Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀（美國Beckerman Coulter公司），15 mW氬離子激光器激光源，激發(fā)波長為488 nm，應(yīng)用Expo 32ADC軟件進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，檢測前以flow-check TMF lour Pheres（10μm）熒光微球作為標(biāo)準(zhǔn)樣品調(diào)整儀器CV值<2%。

1.2.4結(jié)果判定RECK、MMP-14、Endostatin、VEGF表達(dá)的定量分析，按照Morkve提出的熒光指數(shù)（propidium iodide，PI）表示RECK、MMP-14、Endostatin、VEGF表達(dá)的相對含量，PI=實驗樣品的均道值/正常組織樣品的均道值（均道值=logx-Mode× 340）。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析；RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF蛋白中FI表達(dá)量與臨床因素的關(guān)系用直線相關(guān)及回歸分析，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF蛋白的FI表達(dá)量比較

對不同組織進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。喉癌組織RECK、Endostatin蛋白中FI表達(dá)量顯著低于癌旁組及對照組（P<0.05）；MMP-14及VEGF蛋白中FI表達(dá)量顯著高于癌旁組及對照組（P<0.05）。見圖1～4和表1、2。

2.2喉癌組織中RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF蛋白的FI表達(dá)量與臨床因素的關(guān)系

通過分析喉癌組織中RECK、MMP-14、Endostatin 及VEGF蛋白的FI表達(dá)量與臨床因素的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF蛋白的FI表達(dá)量與喉癌組織的轉(zhuǎn)化程度、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)（P<0.05），但與年齡無明顯相關(guān)性（P>0.05）。見表3、4。

2.3喉癌組織中RECK、MMP-14、Endostatin及 VEGF表達(dá)的相關(guān)性分析

圖1　各組Endostatin的表達(dá)

圖2　各組MMP-14的表達(dá)

圖3　各組RECK的表達(dá)

圖4　各組VEGF的表達(dá)

喉癌組織中RECK、MMP-14、VEGF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r1=-0.765，P1<0.03；r2=-0.661，P2<0.04），喉癌組織中RECK與Endostatin的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.765，P<0.01）；喉癌組織中MMP-14與Endostatin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.365，P<0.03）；MMP-14與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r =0.335，P<0.03），喉癌組織中Endostatin與VEGF表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.563，P<0.04）。

表1　各組RECK、MMP-14蛋白中FI表達(dá)量的比較（n=40±s）

表1　各組RECK、MMP-14蛋白中FI表達(dá)量的比較（n=40±s）

注：與癌旁組和對照組比較，P<0.05

組別　RECK蛋白中FI表達(dá)量　P值　MMP-14蛋白中FI表達(dá)量　P值喉癌組　0.698±0.109　0.017　1.775±0.165　0.024癌旁組　0.889±0.155　0.034　1.246±0.157　0.037對照組　0.963±0.114　0.021　1.097±0.276　0.017

表2　各組Endostatin、VEGF蛋白中FI表達(dá)量的比較（n=40±s）

表2　各組Endostatin、VEGF蛋白中FI表達(dá)量的比較（n=40±s）

注：與癌旁組和對照組比較，P<0.05

組別　Endostatin蛋白中FI表達(dá)量　P值　VEGF蛋白中FI表達(dá)量　P值喉癌組　1.115±0.113　0.011　3.179±0.154　0.024癌旁組　2.987±0.215　0.031　2.243±0.221　0.041對照組　3.336±0.112　0.013　2.067±0.189　0.032

表3　喉癌組織中RECK、MMP-14的FI表達(dá)量與臨床因素的關(guān)系（±s）

表3　喉癌組織中RECK、MMP-14的FI表達(dá)量與臨床因素的關(guān)系（±s）

組別　年齡/歲≤50（n=15）>50（n=25）　低（n=5）　否（n=11）分化程度高（n=25）　中（n=10）是否轉(zhuǎn)移是（n=29）臨床分期Ⅰ、Ⅱ期（n=17）Ⅲ、Ⅳ期（n=23）RECK中FI表達(dá)量　1.113±0.154 1.212±0.123 1.3778±0.215 1.263±0.123 1.106±0.111 1.341±0.212 1.032±0.017 1.034±0.013 0.712±0.021 P值　0.678　0.023　0.035　0.023 MMP-14中FI表達(dá)量　3.156±0.114 3.179±0.115 3.389±0.322 3.287±0.213 3.018±0.117 3.372±0.116 3.008±0.113 1.432±0.112 1.811±0.121 P值　0.677　0.043　0.043　0.012

表4　喉癌組織中Endostatin、VEGF的FI表達(dá)量與臨床因素的關(guān)系（±s）

表4　喉癌組織中Endostatin、VEGF的FI表達(dá)量與臨床因素的關(guān)系（±s）

組別年齡/歲≤50（n=15）>50（n=25）　低（n=5）　否（n=11）分化程度高（n=25）　中（n=10）是否轉(zhuǎn)移是（n=29）臨床分期Ⅰ、Ⅱ期（n=17）Ⅲ、Ⅳ期（n=23）Endostatin中FI表達(dá)量　0.613±0.134 0.712±0.122 0.778±0.015 0.663±0.123 0.606±0.111 0.734±0.212 0.632±0.016 1.027±0.117　1.332±0.218 P值　0.678　0.034　0.045　0.011 VEGF中FI表達(dá)量　1.756±0.114 1.789±0.115 1.889±0.322 1.789±0.223 1.698±0.112 1.897±0.116 1.698±0.112 1.734±0.011　1.332±0.117 P值　0.677　0.033　0.013　0.016

3　討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，在喉癌組織中，RECK、Endostatin的FI表達(dá)量顯著低于癌旁組及對照組（P<0.05）；而MMP-14及VEGF蛋白中FI表達(dá)量相反（P<0.05）；且RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF的FI表達(dá)量與喉癌組織的轉(zhuǎn)化程度、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期、病理組織學(xué)分級密切相關(guān)（P<0.05）；喉癌組織中RECK與MMP-14、Endostatin與VEGF表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r1=-0.765，r2=-0.563，P<0.05）。

RECK可以抑制腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移和血管生成，并有抑制基質(zhì)金屬蛋白表達(dá)與活性的功能。多項研究發(fā)現(xiàn)，RECK蛋白在癌組織中低表達(dá)，表明該組織具有較嚴(yán)重的浸潤性，患者的生存率更低[1-2]。而XU 等[3]證實RECK基因在骨肉瘤的高轉(zhuǎn)移組中低表達(dá)，在低轉(zhuǎn)移組中高表達(dá)。結(jié)果提示，RECK蛋白表達(dá)的變化可能與腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

MMPs家族為降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移過程中具有重要意義。而MMP-14蛋白可以啟動細(xì)胞表面多個蛋白級聯(lián)反應(yīng)，直接降解與破壞腫瘤患者的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，打破阻擋腫瘤細(xì)胞因子浸潤的屏障[4-5]。ULASOV 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，運用替莫唑胺與紫外療法治療后，膠質(zhì)瘤模型老鼠的MMP-14蛋白表達(dá)量顯著降低，提示臨床上可以通過抑制MMP-14表達(dá)量來治療膠質(zhì)瘤。

VEGF是最具有特異性的腫瘤血管形成因子，可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管生長，增加微血管通透性，為腫瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移提供良好的內(nèi)環(huán)境[7-8]。YOKOYAMA等[9]研究證實胃癌組織中VEGF-A及VEGF-C呈現(xiàn)高表達(dá)，其表達(dá)降低則會抑制腫瘤的增殖及擴散，這與本研究結(jié)果相一致。

Endostatin因具有抑制血管內(nèi)皮因子生長的作用而受到眾多學(xué)者青睞。Endostain可以特異性地作用于血管內(nèi)皮因子，顯著抑制其增殖和遷移，阻滯血管內(nèi)皮因子的細(xì)胞周期，引起凋亡，進(jìn)而抑制癌癥的發(fā)展及擴散[10]。諸多研究表明腫瘤的發(fā)生與Endostain的低表達(dá)密切相關(guān)[11-12]。

綜上所述，RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF與喉癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，臨床上可聯(lián)合檢測其表達(dá)水平，為喉癌的診斷治療提供新思路。

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（童穎丹編輯）

·新進(jìn)展研究·

Expressions of RECK, MMP-14, endostatin and VEGF in laryngeal cancer and their correlations

Wen-na ZUO
(Department of Otolaryngology, Cangzhou Central Hospital, Cangzhou, Hebei 061001, P.R. China)

Abstract:【Objective】To investigate RECK, MMP-14, endostatin and VEGF expressions in laryngeal cancer, and to analyze their correlations.【Methods】Using flow cytometry, the laryngeal cancer tissue (cancer group), tissue adjacent to carcinoma (pericancer group) and normal laryngeal mucosa tissue (control group) were detected in 40 laryngeal cancer patients for the expression levels of RECK, MMP-14, endostatin and VEGF. The relations between their expressions and the clinical pathologic factors of laryngeal cancer were statistically analyzed.【Results】Flow cytometry showed the FI expression levels of RECK and endostatin in the cancer group were significantly lower than those in the pericancer group and control group (P< 0.05); the FI expression levels of MMP-14 and VEGF proteins in the cancer group were significantly higher than those in the pericancer group and control group (P < 0.05). The FI expression levels of RECK, MMP-14, endostatin and VEGF in laryngeal cancer tissues were closely correlated with differentiation of laryngeal cancer, occurrence of lymphatic metastasis and clinicopathological stage (P< 0.05), but not correlated with the age (P> 0.05). In the laryngeal cancer tissue, RECK expression was negatively correlated with MMP-14 (r = -0.765, P< 0.05), andbook=72,ebook=78endostatin expression was negatively correlated to the expression of VEGF (r = -0.563, P<0.05).【Conclusions】RECK, MMP-14, endostatin and VEGF are likely to be involved in the occurrence and development of laryngeal cancer, in the process of differentiation and metastasis, and have certain correlations. The joint detection of RECK, endostatin, VEGF and MMP-14 may help clinical diagnosis of laryngeal cancer.

Key words:laryngeal cancer; RECK; MMP-14; endostatin; VEGF

收稿日期：2014-11-11

文章編號：1005-8982（2015）23-0071-05

中圖分類號：R739.65

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A