雙向薄層色譜法分析混合糖組分

劉秀花, 崔孟岐, 王莉, 張淑紅，宋兆齊,，梁峰

(1.商丘師范學(xué)院 生物精煉河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 商丘， 476000;2.商丘師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 商丘， 476000)

雙向薄層色譜法分析混合糖組分

劉秀花1,2, 崔孟岐2, 王莉2, 張淑紅1,2，宋兆齊2,1，梁峰1

(1.商丘師范學(xué)院 生物精煉河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 商丘， 476000;2.商丘師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 商丘， 476000)

薄層色譜法分析糖類(lèi)混合物的組分簡(jiǎn)便快速，但是并不能將甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖進(jìn)行徹底分離.本文采用雙向?qū)游龅姆椒ǚ謩e以V乙腈∶V水=85∶15為第一向展層劑，以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1為第二向展層劑優(yōu)化層析.結(jié)果顯示，得到了較好的分離效果，可以定性檢測(cè)出糖類(lèi)組分.對(duì)比國(guó)內(nèi)外研究，此方法簡(jiǎn)單，因此雙向薄層色譜法可以作為一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、清晰、便利的方法定性檢測(cè)糖類(lèi)混合物的組分.

薄層色譜法；生物質(zhì)；展層劑；糖類(lèi)；

近年來(lái)，為應(yīng)對(duì)國(guó)際能源供需矛盾，全球氣候變化等挑戰(zhàn)，越來(lái)越多的國(guó)家將發(fā)展生物質(zhì)能作為替代化石能源、保障能源安全的重要戰(zhàn)略措施，積極推進(jìn)生物質(zhì)能開(kāi)發(fā)利用.隨著國(guó)際石油市場(chǎng)供應(yīng)緊張和價(jià)格上漲，發(fā)展生物燃料乙醇和生物柴油等生物液體燃料已成為替代石油燃料的重要方向.目前，以甘蔗、玉米和薯類(lèi)作物為原料的燃料乙醇和以植物油脂為原料的生物柴油在歐洲已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用.我國(guó)生物質(zhì)能利用技術(shù)和裝備處于起步階段，仍未掌握關(guān)鍵技術(shù)而且生物柴油生產(chǎn)技術(shù)應(yīng)用水平還不高，生物質(zhì)能利用水平低，轉(zhuǎn)化效率有待提高.

生物質(zhì)利用的一個(gè)主要障礙是缺乏對(duì)植物細(xì)胞壁有效的預(yù)處理，以便碳水化合物可以隨后被水解成糖來(lái)發(fā)酵成燃油或化學(xué)品[1].糖類(lèi)是自然界存在數(shù)量最多的有機(jī)化合物，不僅是生物體的結(jié)構(gòu)成分，也是生物體內(nèi)的主要能源物質(zhì)，跟植物體內(nèi)的新陳代謝有密切聯(lián)系，分離檢測(cè)各種生物質(zhì)降解液可溶性糖的種類(lèi)，有助于對(duì)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物柴油的工藝優(yōu)化研究.

對(duì)比國(guó)內(nèi)外研究，糖類(lèi)的分離一般采用高效液相色譜或是離子交換色譜，薄層層析，展開(kāi)劑種類(lèi)雖然很多，在多展層劑的薄層色譜測(cè)定中，雖然大多數(shù)糖能被一次性分離[2-6]，但是像D-葡萄糖，L-阿拉伯糖這樣的分解液中常有的糖類(lèi)卻總是因?yàn)镽f值相近而無(wú)法分離完全.因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比多種展層劑的展層效果，運(yùn)用雙向?qū)游?，增加展距，提高了分離能力，從而得以分析出糖類(lèi)混合物組分.

1 材料和方法

1.1 材料

薄層層析硅G型、乙酸乙酯，正丁醇，丙酮，無(wú)水乙醇，乙腈，磷酸，苯胺，二苯胺，D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖，D-蔗糖，七葉苷，L-鼠李糖，麥芽糖，α-乳糖均為分析純級(jí)試劑，蒸餾水.

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)糖液的配制

分別配制D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-蔗糖、七葉苷、L-鼠李糖，麥芽糖、α-乳糖等1%的乙醇溶液.選取D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-葡萄糖等5種溶液，配制0.25%的混合糖液A.選取上述10種溶液配制0.25%的混合糖液B，保存于4℃冰箱中待用.

1.2.2 展層劑的配制

按照展層劑的配方，將量取好的各種展層液混合在一起，置于層析缸中，溫度控制在4～9 ℃左右.展層劑高度不超過(guò)1cm.讓展開(kāi)劑的蒸氣充滿層析缸，為防止邊沿效應(yīng)，飽和時(shí)間在0.5 h左右. 使用的展層劑如表1：

表1 糖的薄層色譜使用的展層劑體系

注:展層劑體系的試劑的比例均是體積比

1.2.3 薄層層析

選取20 cm×20 cm和10 cm×20 cm層析板，0.25%羧甲基纖維素鈉水溶液作為黏合劑，取硅膠 4 g與12 mL的0.25%羧甲基纖維素鈉水溶液混合研磨涂布制板，過(guò)程采用自然流動(dòng)混合均勻法，水平靜置自然風(fēng)干. 使用前將薄層板置于105℃烘箱內(nèi)活化30 min，置于干燥器中備用.

第一向展開(kāi)，把配制好的展層劑1倒入層析缸中，放在4～9℃層析柜中進(jìn)行飽和30 min，點(diǎn)好樣層析，當(dāng)溶劑前沿?cái)U(kuò)展到層析板上端約1～2 cm處時(shí)，取出板并晾干.第二向展開(kāi)，待層析板晾干后，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°，放在展層劑2進(jìn)行第二步層析，當(dāng)溶劑前沿?cái)U(kuò)展到距薄層板上端約1～2 cm處時(shí)，取出板并晾干.

1.2.4 顯色

苯胺-二苯胺-磷酸顯色劑：取50 mL丙酮置于燒杯中，依次加入5 mL 85%磷酸，1 mL苯胺和1 g二苯胺，磁力攪拌器加熱，直至均勻無(wú)顆粒.將顯色劑均勻噴灑板上， 85 ℃烘箱加熱10 min左右顯色.

2 結(jié)果與分析

2.1 單向?qū)游鰧?duì)單糖分離的效果

本實(shí)驗(yàn)以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1為展層劑，以單向?qū)游鰧?duì)D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖這5種單糖及其混合液進(jìn)行分離，結(jié)果如下圖1：

點(diǎn)樣：1.D-甘露糖，2.L-阿拉伯糖，3. D-半乳糖，4.D-木糖，5.D-葡萄糖，6.混合糖液1

Figure 1 developing solvent 2 on the separation of sugar Sample point sequence: 1.D-mannose, 2 .L- Arabia sugar, 3.D- galactose , 4.D- xylose , 5. D- glucose , 6.solution 1圖2 展層劑1對(duì)糖分離效果圖譜(展層劑為V乙腈∶V水=85∶15)

點(diǎn)樣：1.D-甘露糖，2.L-阿拉伯糖，3. D-半乳糖，4.D-木糖，5.D-葡萄糖

Figure 2 developing solvent 1 on the separation of sugar Sample point sequence: 1.D-mannose, 2 .L- Arabia sugar, 3.D- galactose , 4.D- xylose , 5. D- glucose .

從圖1可以看出，在展層劑為：V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1進(jìn)行分離的結(jié)果較為清晰，但是由于D-葡萄糖，L-阿拉伯糖的Rf值相近，L-阿拉伯糖和D-葡萄糖層析結(jié)果顯示重合在一條水平層析帶上，并不能將D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖通過(guò)單向?qū)游鲆淮涡詮氐追蛛x.這為薄層層析分析糖類(lèi)混合物的組分帶來(lái)不便，不能有效對(duì)各種糖類(lèi)降解液、混合糖液進(jìn)行組分分析優(yōu)化研究.

為了將D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖通過(guò)薄層層析徹底分開(kāi)，反復(fù)對(duì)比不同展層劑的分離效果，以V乙腈∶V水=85∶15為展層劑進(jìn)行層析分離時(shí)，結(jié)果如圖2.

從圖2可以看出，在以V乙腈∶V水=85∶15為展層劑對(duì)D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖進(jìn)行薄層層析分離時(shí)，可以將L-阿拉伯糖和D-葡萄糖分開(kāi)，但是D-甘露糖和D-葡萄糖層析結(jié)果在水平方向有重合，因此，V乙腈∶V水=85∶15這種展層劑液不能將D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖分離完全.

2.2 雙向?qū)游鰧?duì)單糖混合物分離的效果

從圖1可以看出，L-阿拉伯糖和D-葡萄糖因?yàn)镽f值太近在單向?qū)游鰰r(shí)，很難分開(kāi)；從圖2可以看出，L-阿拉伯糖和D-葡萄糖雖然Rf值較為接近，但是仍然是可以通過(guò)特定展層劑層析分離開(kāi).這是由單向?qū)游稣咕嗟木窒扌詻Q定的，為了擴(kuò)大展距，增強(qiáng)分離能力，需要以雙向?qū)游鲞M(jìn)行分離.

因此，為了薄層層析將D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖這5種糖徹底分離，以V乙腈∶V水=85∶15為第一向展層劑，在展層結(jié)束后，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°，又以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1為第二向展層劑，進(jìn)行了雙向?qū)游觯鐖D3.

從圖3，可以看出，在以V乙腈：V水=85∶15為第一向展層劑，以V正丁醇：V乙酸乙酯：V水=7∶2∶1第二向展層劑雙向?qū)游鰰r(shí)，展距擴(kuò)大，增強(qiáng)了分離能力，D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖得以徹底分離，從而達(dá)到了通過(guò)薄層層析對(duì)混合糖進(jìn)行分離的效果，對(duì)于定性研究糖類(lèi)混合物的組分有重大的意義，木糖因?yàn)閷游龅淖饔脧?qiáng)，經(jīng)過(guò)雙向?qū)游鑫挥谟疑辖?，而半乳糖位于左下角，阿拉伯糖則能夠與葡萄糖分開(kāi)，略微靠右.

相對(duì)于國(guó)內(nèi)之前的研究，雙向?qū)游鰧-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖這5種單糖混合物徹底分開(kāi)，得到了清晰、直觀的層析結(jié)果，準(zhǔn)確定性糖類(lèi)混合物的組分.

2.3 雙向?qū)游鰧?duì)多種混合糖的分離效果

從圖3可以看出，雙向?qū)游鰧?duì)單糖混合物分離結(jié)果比較清晰，由于具備較強(qiáng)的展開(kāi)能力，雙向?qū)游隹梢詫翁堑幕旌衔镞M(jìn)行分離，為了驗(yàn)證雙向?qū)游龅膶?shí)用性，本次試驗(yàn)共采用D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖，D-蔗糖，七葉苷，L-鼠李糖，麥芽糖，α-乳糖共10種糖，以V乙腈∶V水=85∶15為第一向展層劑，以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1第二向展層劑雙向?qū)游?，結(jié)果如圖4.

如圖4所示，以V乙腈∶V水=85∶15為第一向展層劑，以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1第二向展層劑雙向?qū)游鰧?duì)10種糖類(lèi)混合物進(jìn)行分離，得到了較好的分離結(jié)果，相對(duì)于同類(lèi)研究，雙向?qū)游鍪且环N簡(jiǎn)單快速的層析方法，由于混合糖的組分復(fù)雜以及雙向展開(kāi)時(shí)薄層板的活度急劇下降等因素的影響，雖然可以成功分離開(kāi)，但是未能獲得清晰圖像，后續(xù)還有待研究，繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化.

3 結(jié) 論

前人研究表明，糖類(lèi)混合物的組分鑒定一般采用高效液相色譜或是離子交換色譜，對(duì)技術(shù)要求較高、成本較高，但結(jié)果比較精確.薄層層析方法較簡(jiǎn)便，效果顯現(xiàn)快，對(duì)較為粗略的測(cè)定是一種可選的方法.但有些糖類(lèi)，比如像D-葡萄糖，L-阿拉伯糖等在植物降解液常有的糖類(lèi)卻總是因?yàn)镽f值相近而無(wú)法完全分離.通過(guò)對(duì)比研究不同展層劑的分離效果，本實(shí)驗(yàn)最終確立以V乙腈∶V水=85∶15為第一向展層劑，以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1為第二向展層劑的雙向?qū)游龇蛛x體系，同時(shí)以苯胺-二苯胺-磷酸為顯色劑，效果比較理想，不僅將D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖組成的單糖混合物徹底分開(kāi).在增加多種糖的前提下，雙向?qū)游鰧?duì)D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖，D-蔗糖，七葉苷，L-鼠李糖，麥芽糖，α-乳糖這10種混合糖液進(jìn)行分離，也得到了較好的分離效果.因此，雙向?qū)游隹梢赃x定為快速分析糖類(lèi)混合物、植物水解液、微生物發(fā)酵液糖類(lèi)組分的比較理想的分離體系.

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)多種糖類(lèi)混合物的層析分離，為糖類(lèi)混合物、植物水解液、微生物發(fā)酵液的層析分離鑒定奠定了基礎(chǔ)，適合于大規(guī)模生物質(zhì)降解液的快速定性鑒定.通過(guò)對(duì)比薄層色譜的展層劑對(duì)糖類(lèi)的分離效果建立的雙向?qū)游?，可作為一種快速、準(zhǔn)確、便捷的測(cè)定方法快速分析糖類(lèi)混合物組分.

[1] Ke J,LaskarDD,Gao D,Chen S. Advanced biorefinery in lower termite-effect of combined pretreatment during the chewing process [J]. Biotechnol Biofuels.2012 Mar 5;5(1):11. doi: 10.1186/1754-6834-5-11.

[2] 劉秀花，王莉，張淑紅，等. 玉米芯降解液糖類(lèi)成分薄層色譜法分析技術(shù)優(yōu)化[J].商丘師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2014,30(9):55-59.

[3] 張桂，李俊英，陳學(xué)武，等.薄層層析法測(cè)定纖維素材料水解液中混合糖的研究[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)，2002,38(2)：81-82,84.

[4] 方琳.姚帥.崔亞君，等. 二維薄層色譜技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中成藥，2014，36(3)：589-592.

[5] 張麗芝.單糖組成分析方法的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2013,41(1)：77-81.

[6] 姜曉滿，田衛(wèi)，張海霞，等，糖類(lèi)物質(zhì)的色譜分析[J].藥物分析雜志，2006,26(8)：1181-1186.

[責(zé)任編輯：徐明忠]

·學(xué)術(shù)動(dòng)態(tài)·

湖南師范大學(xué)博士生導(dǎo)師謝青季教授蒞臨我校講學(xué)

2015年4月14日，應(yīng)我?；瘜W(xué)化工學(xué)院邀請(qǐng)，湖南師范大學(xué)“化學(xué)生物學(xué)及中藥分析”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任、博士生導(dǎo)師謝青季教授來(lái)到我校，在文化路校區(qū)化學(xué)實(shí)驗(yàn)樓311室作了題為“金屬標(biāo)記的高敏安培生物分析”的學(xué)術(shù)報(bào)告.報(bào)告會(huì)由化學(xué)化工學(xué)院院長(zhǎng)趙文獻(xiàn)教授主持，化學(xué)化工學(xué)院部分師生聆聽(tīng)了報(bào)告.

謝青季教授首先從“核外電子運(yùn)動(dòng)”、“價(jià)電子轉(zhuǎn)移的有效距離”和“金屬標(biāo)記型生物電化學(xué)分析”三個(gè)方面介紹了他的課題組開(kāi)展相關(guān)科研工作的研究背景.隨后，謝教授分別介紹了他的課題組在“納米硫化鎘標(biāo)記的免疫和核酸適體高敏分析”、“基于金標(biāo)銀染和原電池置換反應(yīng)的高敏免疫分析”以及“基于金標(biāo)金染的高敏免疫分析”方向的最新研究成果，并與化學(xué)化工學(xué)院的教師們進(jìn)行了深入的學(xué)術(shù)交流.

謝教授語(yǔ)言幽默、邏輯清晰，研究背景貼近生活，研究?jī)?nèi)容新穎前沿.本場(chǎng)精彩的學(xué)術(shù)報(bào)告讓大家受益匪淺，博得了與會(huì)師生的陣陣掌聲，尤其謝教授的課題組在阻抗分析式石英晶體微天平方面的創(chuàng)新性研究工作博得了在場(chǎng)師生的一致贊許.會(huì)后，謝教授與我?！吧锓肿幼R(shí)別與傳感重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”的科研人員就研究生培養(yǎng)及專(zhuān)業(yè)方向的一些學(xué)術(shù)問(wèn)題進(jìn)行了討論和交流.

謝青季，博士，教授，湖南師范大學(xué)博士生導(dǎo)師、武漢大學(xué)分析化學(xué)專(zhuān)業(yè)校外博士生導(dǎo)師，化學(xué)生物學(xué)及中藥分析省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任(湖南師范大學(xué))、湖南省分析化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科學(xué)術(shù)帶頭人.主持國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重大基礎(chǔ)研究計(jì)劃前期研究專(zhuān)項(xiàng)、全國(guó)高校優(yōu)秀青年教師教學(xué)科研獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃、教育部骨干教師資助計(jì)劃和湖南省杰出青年基金等課題.已在Anal. Chem.、Adv. Funct. Mater.、J.Phys.Chem.B等學(xué)術(shù)期刊發(fā)表SCI收錄論文90余篇.曾獲首屆全國(guó)高校優(yōu)秀青年教師獎(jiǎng)、中國(guó)化學(xué)會(huì)青年化學(xué)獎(jiǎng)、省部級(jí)科技進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)和湖南省教學(xué)成果獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)等獎(jiǎng)勵(lì)，享受?chē)?guó)務(wù)院政府特殊津貼.

Two-step thin layer chromatography for saccharides analysis of mixed saccharides liquid

LIU xiuhua1,2,CUI mengqi2, WANG li2, ZHANG Shuhong1,2，SONG Zhaoqi2,1， LIANG feng1

(1.Biorefinery Engineering Lab of Hena Province, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China;2.Department of Life Science, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)

The thin layer chromatography(TLC)analysis of the mixed saccharides liquid composition effect is good, simple and rapid, but it doesn′t put the mannose, arabinose, galactose, xylose, glucose separately. This paper using the two step-TLC, the first step byVacetonitrile∶Vwater=85∶15，and the second step byVn-butanol∶Vethyl acetate∶VWater=7∶2∶1 as developing solvent for optimization of chromatography. Results show that using the above method to analyze saccharides mixture, got the good separation effect, can the qualitative detection of saccharides components, comparative research both at home and abroad, the use effect of the method is very simple and intuitive. Therefore, the two step thin layer chromatography(TLC)can be used as a simple, accurate, clear and convenient method of qualitative detection of saccharide mixture components.

TLC;biomass;developing solvent;saccharides;

2015-03-16

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(132102310039,142102310044);河南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(13A180830)

劉秀花(1963-),女，河南新鄉(xiāng)人，商丘師范學(xué)院教授，主要從事微生物資源、酶制劑、生物能源方面的研究.

O657.7

A

1672-3600(2015)06-0069-05