糖痹康對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響

易文明 孫文 郭翔宇 呂翠巖 劉銅華

糖尿病性周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病經(jīng)常出現(xiàn)的慢性并發(fā)癥之一，它很容易造成糖尿病足及截肢，有癥狀的發(fā)病率波動(dòng)在50% ～70%，甚至更高，由于診斷方法不統(tǒng)一，有的報(bào)道發(fā)病率可高達(dá)90%以上［1-2］，基于DPN非常高的發(fā)病率和致殘率，DPN的預(yù)防和治療已經(jīng)成為學(xué)科內(nèi)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。目前西藥治療DPN尚缺乏有效手段，而中醫(yī)藥治療DPN積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，療效確切，但作用機(jī)制亟待闡明。中藥復(fù)方糖痹康經(jīng)過了多年的臨床應(yīng)用，療效較好，目前已獲發(fā)明專利(專利申請(qǐng)?zhí)?200810167551.1)。本實(shí)驗(yàn)研究是在既往研究的基礎(chǔ)上，選用SPF級(jí)SD大鼠，通過高脂飼料喂養(yǎng)后，采用小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射誘發(fā)2型糖尿病，構(gòu)建DPN動(dòng)物模型［3］，緊緊圍繞DPN核心發(fā)病機(jī)制——氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡，觀察與其密切相關(guān)的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、超氧化歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、Caspase-3蛋白酶等與 DPN的關(guān)系，探討糖痹康治療DPN的作用機(jī)理，為臨床推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)，為以改善神經(jīng)病變?yōu)槟康牡男滤幯邪l(fā)探索新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只純系SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，7周齡，從北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購買，生產(chǎn)許可證:SCXR(京)2004-0006。

1.2 材料及儀器

糖痹康(黃芪30 g、女貞子15 g、桂枝10 g、赤芍10 g、黃芩 10 g、黃連 10 g、水蛭 6 g，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供);α-硫辛酸購自Puritan’s Pride公司(100 mg×60粒，生產(chǎn)批號(hào):250597-09 EXP 10/17);高脂飼料，購自北京華阜康生物科技有限公司;羅氏活力型血糖儀(購自美國羅氏公司，型號(hào):ACCU-CHEK);丙二醛(MDA)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所);超氧化物岐化酶(SOD)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所);活性氧簇(ROS)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所);VC-10(日本光電)記憶示波器，PowerLab多功能生理信號(hào)采樣分析系統(tǒng)，SEN-3201電刺激器(購自日本光電);TUNEL試劑盒(購自美國Upstate公司);大鼠Caspase-3試劑盒(購自美國GBD公司);熒光顯微鏡(購自德國Zeiss公司)等。

1.3 模型建立及分組

大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)選擇10只為正常組，采用普通飼料飼養(yǎng)，其它組大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)，8周后，禁食12小時(shí)后準(zhǔn)備造模，造模藥物鏈脲霉素用0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH 4.4)配成1%的濃度，劑量以35 mg/kg進(jìn)行腹腔注射，72小時(shí)后檢測大鼠血糖值(尾部血管取血)，血糖≥16.7 mmol/L以上者視為造模成功，按大鼠體重隨機(jī)分為模型組，α-硫辛酸組，糖痹康低、中、高劑量組，每組10只。

1.4 給藥方法

模型復(fù)制成功3天后開始大鼠灌胃，劑量為糖痹康低劑量組4.175g/(kg·d)，糖痹康中劑量組8.35 g/(kg·d)，糖痹康高劑量組 16.7 g/(kg·d)，α-硫辛酸組灌服 α-硫辛酸20 mg/(kg·d)，每天1次，連續(xù)給藥16周。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠均自由取食、飲水。

1.5 指標(biāo)檢測及方法

1.5.1 體重、血糖檢測 灌胃前和灌胃后的第4、8、12、16周末，禁食6小時(shí)，大鼠稱重及檢測血糖。1.5.2 神經(jīng)電生理 檢測大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity，MNCV)。大鼠麻醉后，以俯臥位固定好，開始將刺激針電極放置在跺關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)面，其次放置在坐骨切跡處，波寬為0.1 ms，強(qiáng)度為超強(qiáng)刺激，用針電極記錄，保持每2個(gè)刺激之間的間隔時(shí)間在5 s以上，反復(fù)測定7～10次，算出平均值。掃描速度保持在2 ms/cm，記錄頻率3～10000 Hz，放大倍數(shù)2 mv/cm。使大鼠后肢以自然狀態(tài)與后背脊柱成45°夾角，然后向斜后方拉直，順著坐骨神經(jīng)方向，測出大鼠體表兩個(gè)刺激點(diǎn)之間的長度，從而計(jì)算出MNCV。

1.5.3 黃嘌呤氧化酶法測定SOD含量 第16周末，用10%水合氯醛以0.4 mg/100 g劑量腹腔注射麻醉大鼠，大鼠固定于鼠板上，先切開雙側(cè)后腿中外1/3處皮膚，接著鈍性分離出肌肉組織，將坐骨神經(jīng)充分暴露，旁邊肌肉去除，取出盡可能長的坐骨神經(jīng)，用0.9%的生理鹽水沖洗干凈，天平稱其質(zhì)量后放入凍存管內(nèi)，于冰壺內(nèi)冷凍，最后放入－80℃冰箱保存。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD含量(按照試劑盒提供的操作流程進(jìn)行)。

1.5.4 硫代巴比妥酸法測MDA含量 16周末，取材方法同上，按照試劑盒提供的操作流程進(jìn)行。

1.5.5 比色法檢測ROS含量 16周末，取材方法同上，按照試劑盒提供的操作流程進(jìn)行。

1.5.6 酶聯(lián)免疫吸附法測定坐骨神經(jīng)caspas-3蛋白表達(dá)水平 16周末，取材方法同上，按照試劑盒提供的操作流程進(jìn)行。

1.5.7 TUNEL法測定細(xì)胞凋亡 16周末，取材方法同上，按照試劑盒提供的操作流程進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方差齊，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

造模72小時(shí)后，大鼠表現(xiàn)出多食多尿，體質(zhì)量下降，精神萎靡，體毛色澤干枯，活動(dòng)變得遲緩，在14周后還出現(xiàn)了身體潰瘍等情況，而在α-硫辛酸組和中藥糖痹康高劑量組以上情況出現(xiàn)的較少。

2.2 體質(zhì)量稱量

和正常組相比，從8周開始，模型組大鼠的體質(zhì)量較前輕度下降(P＜0.05);在16周后，模型組大鼠體質(zhì)量明顯下降(P＜0.01)。和模型組比較，16周后，糖痹康低、中劑量及α-硫辛酸組體質(zhì)量明顯增加(P＜0.01)。見表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組DPN大鼠體質(zhì)量的比較(g，n=10，±s

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組DPN大鼠體質(zhì)量的比較(g，n=10，±s

注:與正常組比較，aP ＜0.05，cP ＜0.01;與模型組比較，bP ＜0.01

組別 干預(yù)前干預(yù)后4周 8周 12周 16周正 常 組 409.11 ±16.10 429.48 ±33.45 459.67 ±57.32 481.22 ±64.84 446.59 ±78.76.13 ±17.66 512.34 ±9.98模 型 組 434.20 ±15.19 423.32 ±14.67 412.69 ±31.46a 406.12 ±35.34a 349.34 ±23.39c α-硫辛酸組 425.07 ±49.69 427.79 ±31.94 427.13 ±35.66 433.24 ±28.68 464.57 ±29.67ab糖痹康低 426.03 ±19.03 437.12 ±20.99 447.38 ±35.87 456.33 ±37.74 481.76 ±35.95b糖痹康中 415.97 ±45.06 422.62 ±46.97 441.35 ±58.67 449.37 ±69.31 483.45 ±31.37b糖痹康高 408.91 ±55.96 426.38 ±62.24 428.16 ±62.93 443

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組DPN大鼠血糖的比較(mmol/L，n=10，±s)

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組DPN大鼠血糖的比較(mmol/L，n=10，±s)

注:與正常組比較，aP ＜0.01;與模型組比較，bP ＜0.05，cP ＜0.01

組別 干預(yù)前干預(yù)后4周 8周 12周 16周39 ±0.41模型組 20.13 ±1.57a 21.09 ±1.61a 21.01 ±1.58a 22.34 ±0.98a 22.97 ±0.79a α-硫辛酸組 20.99 ±1.78a 20.78 ±1.72a 18.74 ±2.15a 19.92 ±1.98a 20.84 ±1.74ab糖痹康低 22.85 ±1.51a 20.47 ±0.86a 19.46 ±2.29a 19.43 ±2.07a 18.97 ±2.17ac糖痹康中 20.99 ±1.88a 18.36 ±2.13ac 15.67 ±1.74ab 15.87 ±1.74ab 14.69 ±1.67ac糖痹康高 21.27 ±1.14a 18.65 ±1.19ac 11.78 ±1.82ab 9.98 ±2.18ac 9.24 ±2.19正常組 5.68 ±0.52 5.82 ±0.79 5.99 ±0.29 6.17 ±0.64 6.ac

表3 各組DPN大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較(m/s，n=10，±s)

表3 各組DPN大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較(m/s，n=10，±s)

注:與正常組比較，aP ＜0.01;與模型組比較，bP ＜0.05

組別 4周 8周 12周 16周08模型組 15.09 ±1.08a 13.99 ±1.31a 14.08 ±0.97a 13.14 ±1.35a α-硫辛酸組 15.42 ±1.51b 16.75 ±1.43b 16.65 ±1.21b 16.94 ±1.21b糖痹康低 15.23 ±1.23b 15.09 ±1.07b 15.67 ±1.74b 15.89 ±1.48b糖痹康中 16.47 ±1.24b 17.09 ±1.65b 17.88 ±1.91b 18.49 ±1.52b糖痹康高 16.91 ±1.87b 19.72 ±1.27b 19.46 ±1.76b 20.56 ±1.53正常組 19.98 ±1.41 20.32 ±1.04 21.09 ±0.99 20.88 ±1.b

2.3 血糖檢測

和正常組比較，模型組大鼠血糖明顯升高(P＜0.01);和模型組比較，干預(yù)以后各組大鼠血糖較前都有所改善，其中α-硫辛酸組(P＜0.05)和糖痹康低劑量組(P＜0.01)在16周后有明顯差異，而糖痹康中、高劑量組在4、8、12、16周都有明顯下降(P ＜0.01)。見表2。

2.4 右側(cè)坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度測定

和正常組比較，模型組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著減慢;和模型組比較，糖痹康各劑量組及α-硫辛酸組都能提高糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度(P＜0.05)，組間比較，糖痹康高劑量組的效果優(yōu)于α-硫辛酸組(P＜0.05)，糖痹康各劑量組間相對(duì)比，高劑量組改善效果更加顯著(P＜0.05)，提示糖痹康能夠提高糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。見表3。

2.5 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織 ROS、MDA、SOD含量測定

與正常組比較，各組大鼠坐骨神經(jīng)ROS、MDA含量顯著升高，而SOD含量顯著降低(P＜0.01)，說明糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠存在氧化應(yīng)激狀態(tài)，與模型組比較，α-硫辛酸組和糖痹康中、高劑量組ROS、MDA含量明顯著減少，SOD含量顯著增加(P＜0.05)，α-硫辛酸組和糖痹康高劑量組相比，ROS、MDA、SOD含量無明顯差異，提示糖痹康可能具有抗氧化應(yīng)激的作用。見表4。

表4 各組DPN大鼠ROS、SOD、MDA濃度(n=10，±s)

表4 各組DPN大鼠ROS、SOD、MDA濃度(n=10，±s)

注:與正常組比較，aP ＜0.01;與模型組比較，bP ＜0.05

組別 ROS(U/mgprot)SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot 160.74 ±17.97 65.89 ±8.63 3.91 ±0.48模型組 221.31 ±22.08a 44.34 ±6.74a 8.67 ±129a α-硫辛酸組 167.65 ±16.76b 59.61 ±7.12b 4.45 ±0.37b糖痹康低 219.98 ±17.43 43.74 ±5.76 8.36 ±0.53糖痹康中 193.76 ±19.32b 52.67 ±4.58b 5.82 ±0.33b糖痹康高 175.87 ±18.92b 58.99 ±5.46b 5.01 ±0.62)正常組b

2.6 TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡

正常組坐骨神經(jīng)組織TUNEL檢測沒有找到陽性細(xì)胞，表明正常組坐骨神經(jīng)神經(jīng)元未發(fā)生凋亡。與模型組相比，α-硫辛酸組和糖痹康高劑量組發(fā)現(xiàn)的陽性細(xì)胞數(shù)減少(P＜0.05);糖痹康高劑量組與α-硫辛酸組比較，發(fā)現(xiàn)的陽性細(xì)胞數(shù)略高于α-硫辛酸組(P＜0.05)，提示糖痹康具有抗神經(jīng)元凋亡的作用。見表5。

表5 各組DPN大鼠坐骨神經(jīng)神經(jīng)元TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)(n=10，±s)

表5 各組DPN大鼠坐骨神經(jīng)神經(jīng)元TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)(n=10，±s)

注:與正常組比較，aP＜0.01;與模型組比較，bP＜0.05;與西藥組比較，cP ＜0.05

組別 神經(jīng)元凋亡數(shù)目正常組0模型組 9.39 ±1.12a α-硫辛酸組 5.85 ±2.16ab糖痹康低 9.51 ±1.03糖痹康中 8.92 ±1.91糖痹康高 6.55 ±1.89abc

2.7 Caspase-3蛋白表達(dá)水平測定

模型組、α-硫辛酸組和糖痹康組坐骨神經(jīng)組織Caspase-3蛋白明顯高于正常組(P＜0.05);α-硫辛酸組、糖痹康高劑量組大鼠坐骨神經(jīng)組織Caspase-3蛋白表達(dá)顯著低于模型組(P＜0.05)，兩組間Caspase-3蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示糖痹康可抑制Caspase-3蛋白的表達(dá)，具有抗凋亡的作用。見表6。

表6 各組DPN大鼠坐骨神經(jīng)Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較(n=10，±s)

表6 各組DPN大鼠坐骨神經(jīng)Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較(n=10，±s)

注:與正常組比較，aP ＜0.05;與模型組比較，bP ＜0.05

組別 Caspase-3(ng/ml)23.18 ±4.57模型組 57.82 ±15.21a α-硫辛酸組 46.24 ±13.72ab糖痹康低 55.56 ±15.26糖痹康中 54.89 ±15.19糖痹康高 44.32 ±8.99正常組ab

3 討論

DPN的發(fā)病機(jī)制目前還不是十分清楚，不能用單一因素來解釋，而應(yīng)該是多種因素相互作用的結(jié)果。其可能發(fā)病機(jī)制主要包括代謝原因和血管原因，還有多元醇途徑、晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)途徑、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)途徑、氨基已糖途徑、生長因子缺乏、氧化應(yīng)激、神經(jīng)營養(yǎng)因子、免疫因素等等。很多研究提示氧化應(yīng)激在DPN的眾多發(fā)病機(jī)制中占有重要的地位，可能是糖尿病并發(fā)癥產(chǎn)生的一個(gè)核心通路。大鼠鏈脲佐菌素DM模型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，糖尿病或高血糖狀態(tài)下可引起背根神經(jīng)節(jié)中 O2－、H2O2及過氧化物增多［4］，Brownlee 提出高血糖時(shí)體內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng)，造成線粒體中超氧陰離子產(chǎn)生過多，最終引起包括糖尿病周圍神經(jīng)病變等一系列的慢性并發(fā)癥［5］。生理情況下，ROS在人體內(nèi)的代謝很穩(wěn)定，如果在病理狀態(tài)下產(chǎn)生了過量的ROS導(dǎo)致人體抗氧化系統(tǒng)不能清除過多的ROS時(shí)，就會(huì)啟動(dòng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成機(jī)體損傷［6］，SOD是人體一種重要的酶，它是自由基的清道夫，它能夠?qū)2－轉(zhuǎn)化為H2O2或者O2，通過對(duì)SOD含量進(jìn)行測定，可以初步評(píng)價(jià)高血糖狀態(tài)下組織抗氧化能力。MDA是一種自由基影響下多不飽和脂肪酸過氧化物的降解產(chǎn)物，它的含量可以提示機(jī)體脂肪過氧化速率和強(qiáng)度及體內(nèi)的自由基代謝情況，也能夠推斷機(jī)體氧化應(yīng)激受損程度。Caspase家族被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，Caspase-3為Caspase家族中的凋亡執(zhí)行因子，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶之一［7-8］，Caspase-3 可直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［9］。課題組認(rèn)為氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡在促進(jìn)DPN的進(jìn)展。

課題組前期細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［10-11］證明，糖痹康有緩解氧化應(yīng)激的作用，阻止和延緩了DPN的病變發(fā)展進(jìn)程，本研究進(jìn)一步證實(shí)糖痹康對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡具有對(duì)抗作用，糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)中SOD的含量顯著下降而MAD、ROS含量明顯增高，Caspase-3蛋白表達(dá)增加，氧化應(yīng)激啟動(dòng)后細(xì)胞凋亡明顯增加，而糖痹康可顯著上調(diào)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠SOD水平和下調(diào)MAD、ROS水平，可抑制Caspase-3蛋白的表達(dá)，具有抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的作用。因此筆者認(rèn)為，糖痹康具有的抗氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡能力可能是其對(duì)糖尿病性周圍神經(jīng)病變的神經(jīng)保護(hù)作用的主要機(jī)制之一。

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(本文編輯:韓虹娟)