糖腎寧對(duì)自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠腎組織血小板衍生生長(zhǎng)因子及受體表達(dá)的影響

劉迎新 鄒大威 耿建國(guó) 高彥彬 尚雅文 李嬌陽(yáng) 龔慕辛 彭麒朕

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的首要因素［1］。DN病理表現(xiàn)為腎小球硬化(腎小球基底膜增厚、腎小球肥大、系膜基質(zhì)增多)和腎小管間質(zhì)纖維化(成纖維細(xì)胞的增生及由此造成的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度堆積)［2-3］。近年研究發(fā)現(xiàn)，血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)與其相應(yīng)受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)結(jié)合，通過(guò)多種信號(hào)通路發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增生、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)增生作用，在DN腎纖維化進(jìn)程中起到了促進(jìn)作用。本課題采用自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠建立糖尿病腎病模型，通過(guò)觀察糖腎寧對(duì)腎組織PDGF、PDGFR蛋白表達(dá)的影響，探討糖腎寧防治糖尿病腎病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)雄性KK-Ay小鼠60只，8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠20只，均購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(京)2014-0004。KK-Ay小鼠高脂飼料(購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào)SCXK(京)2009-0008)。

1.2 藥物

糖腎寧(主藥配比:黃芪4份、金櫻子2份、川芎2份、大黃1份、葛根2份，由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥制劑室制備成浸膏粉);纈沙坦膠囊(商品名:代文，規(guī)格:80 mg/粒，批號(hào) X1448，北京諾華制藥有限公司)。

1.3 主要試劑

Anti-PDGF antibody(Abcam，ab125268)，PDGF Receptor beta(Epitomics，1469-1)。尿白蛋白酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒(ICL，批號(hào):29S1)，麗春紅(國(guó)家集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，CAS:123334-10-1)，冰醋酸(國(guó)家集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，CAS:3761-53-3)，苯胺藍(lán)(國(guó)家集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，CAS:8004-91-9)。

1.4 主要儀器

電子天平(YP601N，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，血糖儀(One touch ultra，強(qiáng)生中國(guó)醫(yī)療器械有限公司)，酶標(biāo)儀(MR-96A，深圳邁瑞)，顯微攝像系統(tǒng)(Nikon Eclipse 80i，北京瑞馳恒業(yè)儀器科技有限公司)。

1.5 模型建立與分組

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料誘導(dǎo)自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠建立糖尿病腎病模型［4-5］:KK-Ay小鼠60只高脂飼料喂養(yǎng)4周后，測(cè)隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，尿微量白蛋白明顯增多視為糖尿病腎病造模成功。造模成功的KK-Ay小鼠隨機(jī)分為模型組、纈沙坦組、糖腎寧組各20只。采用C57BL/6J小鼠20只作為空白組。KK-Ay小鼠飼以高脂飼料，C57BL/6J小鼠飼以普通飼料。糖腎寧組按生藥20 g/(kg·d)灌胃，纈沙坦組按10 mg/(kg·d)灌胃，模型組及空白組予等量蒸餾水灌胃，實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食飲水，連續(xù)給藥12周。

1.6 標(biāo)本采集及觀察指標(biāo)

灌胃期間，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量和血糖。于給藥12周，將各組小鼠置于代謝籠中收集24小時(shí)尿液并記錄尿量，采用ELISA酶聯(lián)免疫學(xué)方法檢測(cè)24小時(shí)尿微量白蛋白排泄率(urinary albumin excretion，UAER)。各組小鼠連續(xù)給藥12周后，禁食12小時(shí)，5%水合氯醛按0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉，取出雙側(cè)腎臟，部分腎組織用4%多聚甲醛固定，Masson染色觀察腎組織纖維化的病變程度，顯微鏡圖像分析技術(shù)軟件半定量分析膠原纖維染色陽(yáng)性面積。Western Blot方法檢測(cè)腎組織中 PDGF及PDGFR蛋白表達(dá)。剩余尿樣及腎組織－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各指標(biāo)組間比較均采用單因素方差分析(ANOVA)，方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane’s T2非參數(shù)檢驗(yàn)。體質(zhì)量、血糖、UAER、膠原纖維染色陽(yáng)性面積、PDGF及PDGFR蛋白表達(dá)等指標(biāo)組間方差不齊，采用Tam-hane’s T2非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖腎寧對(duì)體重的影響

8周齡時(shí)，與空白組相比，模型組小鼠體重顯著增加(P＜0.05);與模型組相比，纈沙坦組、糖腎寧組小鼠體重?zé)o明顯變化(P＞0.05)。灌胃期間KKAy小鼠飼以高脂飼料，C57BL/6J小鼠飼以普通飼料。24周齡時(shí)，與空白組相比，模型組、纈沙坦組、糖腎寧組小鼠體重顯著增加(P＜0.05);與模型組相比，纈沙坦組、糖腎寧組小鼠體重?zé)o明顯變化(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量的比較(x ± s，g)

2.2 糖腎寧對(duì)血糖的影響

8周齡及24周齡時(shí)，與空白組比較，模型組、纈沙坦組及糖腎寧組血糖均明顯升高(P＜0.05)，模型組、纈沙坦組及糖腎寧組之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血糖的比較(x ± s，mmol/L)

2.3 糖腎寧對(duì)24小時(shí)尿微量白蛋白排泄率的影響

給藥12周后，與空白組相比，模型組、糖腎寧組及纈沙坦組24小時(shí)UAER明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比，糖腎寧及纈沙坦組小鼠24小時(shí)UAER明顯降低(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 給藥12周各組小鼠24小時(shí)尿白蛋白定量比較(±s)

表3 給藥12周各組小鼠24小時(shí)尿白蛋白定量比較(±s)

注:與空白組比較，aP ＜0.05;與模型組比較，bP ＜0.05。

組別 n 尿白蛋白排泄率(ug/24h)空白組12 126.75 ±29.64模型組 12 3486.12 ±601.30a纈沙坦組 12 2723.67 ±531.91ab糖腎寧組 12 2743.17 ±553.66ab

2.4 糖腎寧對(duì)腎組織病理改變的影響

綠染區(qū)主要為膠原纖維成分?？瞻捉M:腎組織形態(tài)正常，腎小球無(wú)腫大，腎小管排列整齊，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)正常。基底膜、系膜基質(zhì)染成綠色，腎小管見(jiàn)少量染成綠色的膠原纖維。模型組:腎小球肥大，大量腎小管上皮細(xì)胞呈空泡樣病變，系膜基質(zhì)區(qū)擴(kuò)大。腎小球系膜區(qū)及腎小管間質(zhì)膠原纖維明顯增多，可見(jiàn)大量綠染的膠原纖維。纈沙坦組和糖腎寧組:腎小球均輕度肥大，腎小管排列較整齊，腎小管上皮細(xì)胞成空泡樣病變，但較模型組病變程度輕，系膜區(qū)及細(xì)胞外基質(zhì)綠染面積較模型組明顯減少。見(jiàn)圖1。

顯微鏡圖像分析系統(tǒng)半定量分析膠原纖維染色陽(yáng)性面積結(jié)果可見(jiàn):模型組、纈沙坦組及糖腎寧組腎組織膠原纖維染色陽(yáng)性面積較空白組明顯增多(P＜0.05);纈沙坦組和糖腎寧組腎組織膠原纖維染色陽(yáng)性面積較模型組顯著降低(P＜0.05)，各給藥組之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。見(jiàn)表4。

圖1 各組小鼠腎組織病理改變比較

表4 各組小鼠膠原纖維染色陽(yáng)性面積比較(±s)

表4 各組小鼠膠原纖維染色陽(yáng)性面積比較(±s)

注:與空白組比較，aP ＜0.05;與模型組比較，bP ＜0.05。

組別 n 相對(duì)面積(%)10 4.48 ±0.31模型組 10 13.39 ±2.70a纈沙坦組 10 6.60 ±1.05ab糖腎寧組 10 7.86 ±1.03空白組ab

2.5 糖腎寧對(duì)PDGF、PDGFR蛋白表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果表明:模型組小鼠 PDGF、PDGFR相對(duì)蛋白表達(dá)量較空白組顯著增加(P＜0.05)，糖腎寧及纈沙坦組相對(duì)蛋白表達(dá)量較模型組顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠腎組織PDGF、PDGFR蛋白表達(dá)比較

3 討論

KK-Ay小鼠是一種毛色基因Ay突變的2型糖尿病小鼠，16周齡以后便開(kāi)始出現(xiàn)明顯的肥胖、多尿、高血糖、高胰島素血癥和高脂血癥等代謝綜合征，符合2型糖尿病動(dòng)物模型的特點(diǎn)［6］。此外，遺傳因素和環(huán)境因素共同參與了KK-Ay小鼠糖尿病的發(fā)生，與人類(lèi)2型糖尿病非常相似［7］。

PDGF屬于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族，是目前已知多肽生長(zhǎng)因子中最強(qiáng)的有絲分裂原。DN時(shí)葡萄糖和糖基化產(chǎn)物可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞持續(xù)表達(dá)PDGF基因及其β受體，繼而促進(jìn)系膜細(xì)胞的增生和Ⅲ型膠原的產(chǎn)生［8］。此外葡萄糖、糖基化產(chǎn)物還可通過(guò)PDGF的表達(dá)，刺激轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF-β)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)釋放，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)積聚和抑制 ECM降解，從而使腎臟出現(xiàn)纖維化［9-10］。徐惠等［11］發(fā)現(xiàn)大鼠單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型中受損的腎小管過(guò)度表達(dá)PDGF-B及PDGFR-β，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的形成和Ⅲ型膠原的沉積，合成大量的ECM，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化和腎功能惡化。Ostendorf T［12］等通過(guò)對(duì)UUO模型采用特殊的抗PDGF治療，腎纖維化大鼠腎小管間質(zhì)纖維化損傷明顯減少，間質(zhì)成纖維細(xì)胞沉積明顯減少，白血球浸潤(rùn)減少。由此可見(jiàn)PDGF及PDGFR在DN腎纖維化進(jìn)程中起到了重要的促進(jìn)作用。

中醫(yī)認(rèn)為DN多屬“消渴”“腎消”“水腫”“虛勞”等病證范疇，病位在腎，多因消渴日久遷延及腎、絡(luò)脈瘀阻、腎體受損而成。病性多虛實(shí)夾雜，治療上以扶正祛邪為主。糖腎寧由黃芪、金櫻子、大黃、川芎等藥物組成，具有益氣固腎、化瘀通絡(luò)降濁之功。方中黃芪益氣扶正，金櫻子固精縮尿，大黃逐瘀清熱降濁，川芎活血化瘀通絡(luò)。早期糖腎寧臨床隨機(jī)雙盲對(duì)照前瞻性研究［13-14］證實(shí)該藥可明顯降低DN患者尿白蛋白，保護(hù)腎功能，安全有效。

本實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)糖腎寧能夠明顯降低尿白蛋白，抑制腎臟纖維化，保護(hù)腎功能。推測(cè)其作用機(jī)理可能與糖腎寧抑制PDGF及PDGFR蛋白的過(guò)度表達(dá)，減輕腎臟損傷有關(guān)，其詳細(xì)機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。

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(本文編輯:董歷華)