響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳胞外多糖液體培養(yǎng)基組成的研究

劉芳茗，胡耀輝*，隋 新

(1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118;2．吉林化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，吉林吉林132022)

黑木耳隸屬木耳目、木耳科、木耳屬［1］，是生長于朽木之上的一種營養(yǎng)豐富的藥、食兩用真菌，是藥品與保健食品開發(fā)的新來源［2］．黑木耳多糖對機(jī)體免疫功能有明顯的促進(jìn)作用，除此之外還有抗凝血抗血栓、降血脂降血糖、抗衰老抗腫瘤、抗氧化等功能［3-7］．資料表明液態(tài)深層發(fā)酵獲得的多糖含量遠(yuǎn)高于子實體，有很高的科研價值［8］．目前，唐青濤［9］、肖彩霞［10］、王國良［11］等人采用正交試驗的方法對黑木耳深層發(fā)酵產(chǎn)多糖培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化．作為真菌的一種，黑木耳是維生素B2天然缺陷型，維生素B2以一種輔酶的形式存在，需要少量外部添加才能生長良好．本文研究了維生素B2的添加量，并用響應(yīng)面法研究了碳源、氮源、無機(jī)鹽、維生素B2的交互作用對于黑木耳液態(tài)深層發(fā)酵的影響，優(yōu)化了培養(yǎng)基配方，為進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了有力的依據(jù)．

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

菌種:黑木耳為黑-29品種，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所提供．

儀器:立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，垂直凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱，低速離心機(jī)(湖南戶康離心機(jī)有限公司)，全溫?fù)u瓶柜(太倉市試驗設(shè)備廠)．

1.2 試驗過程

1．2．1 培養(yǎng)方法

種子液的培養(yǎng)從黑木耳菌種斜面上用接種針鉤取少許移入到裝有80 mL種子培養(yǎng)基的容積為250 mL的三角瓶中，28℃，150 rpm條件下培養(yǎng)5 d．

發(fā)酵培養(yǎng)將液體種子以10%的接種量，接入裝有80 mL液體菌種培養(yǎng)基的容積為250 mL的三角瓶中，28℃，150 rpm條件下培養(yǎng)7 d．

1．2．2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

(1)碳源種類、濃度的篩選試驗分別用葡萄糖、蔗糖、大米粉、可溶性淀粉、玉米粉以30．00 g/L的添加量代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源，比較胞外多糖產(chǎn)量．經(jīng)過試驗，選擇玉米粉濃度為 10．00、20．00、30．00、40．00 和 50．00 g/L，考察玉米粉濃度對于胞外多糖產(chǎn)量的影響．

(2)氮源種類、濃度的篩選試驗分別用豆餅粉、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、麩皮以10．00 g/L的添加量代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基的氮源，比較胞外多糖產(chǎn)量．經(jīng)過試驗，選擇酵母浸粉濃度為6．00、8．00、10．00、12．00 和 14．00 g/L，考察酵母浸粉濃度對于胞外多糖產(chǎn)量的影響．

(3)無機(jī)鹽濃度的篩選試驗磷酸二氫鉀與硫酸鎂以2 1的比例組成混合無機(jī)鹽，分別考察混合無機(jī)鹽濃度為3．00、4．50、6．00、7．50 和9．00 g/L時對于胞外多糖產(chǎn)量的影響．

(4)維生素B2濃度的篩選試驗分別考察維生素 B2 濃度為 20．00、40．00、60．00、80．00 和100．00 mg/L，對于胞外多糖產(chǎn)量的影響．

(5)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇玉米粉、酵母浸粉、磷酸二氫鉀和硫酸鎂、維生素B2為考察因素，單因素試驗得出的各最佳條件為中心點，選擇四因素三水平Box-Behnken設(shè)計表，用響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)基配方．

1．2．3 檢測方法

發(fā)酵液4 000 rpm離心10 min后的上清液濃縮至原體積的1/5，加入3倍體積的95%的酒精，4℃沉淀24 h，離心后沉淀60℃真烘干至恒重，Sevage法［12］除蛋白后稱重得粗胞外多糖重量．

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源種類、濃度的影響

不同碳源對黑木耳深層發(fā)酵胞外多糖產(chǎn)量的影響見圖1．

圖1 碳源種類對黑木耳液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響

由圖1可知不同碳源對于黑木耳深層發(fā)酵胞外粗多糖產(chǎn)量的影響各異．以玉米粉為碳源胞外粗多糖產(chǎn)量最高，蔗糖、可溶性淀粉其次，葡萄糖最?。虼瞬捎脙r格低廉的玉米粉作為碳源，并對不同玉米粉濃度進(jìn)行篩選試驗，結(jié)果表明30．00～40．00 g/L為最適添加量．

2.2 氮源種類、濃度的影響

不同氮源對黑木耳深層發(fā)酵胞外多糖的影響見圖2．

由圖2可知不同氮源對于黑木耳深層發(fā)酵胞外粗多糖產(chǎn)量的影響各異．以酵母浸粉為氮源胞外粗多糖產(chǎn)量最高，并對不同酵母浸粉濃度進(jìn)行篩選試驗，結(jié)果表明10．00 g/L為最適添加量．

圖2 氮源種類對黑木耳液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響

2.3 無機(jī)鹽濃度的影響

不同無機(jī)鹽濃度對黑木耳深層發(fā)酵胞外粗多糖產(chǎn)量的影響見圖3．

圖3 無機(jī)鹽濃度對黑木耳液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響

由圖3可知6．00 g/L的添加量胞外粗多糖產(chǎn)量最高，即磷酸二氫鉀與硫酸鎂的濃度分別為4．00 g/L 和2．00 g/L．

2.4 維生素B2濃度的影響

不同維生素B2濃度對黑木耳深層發(fā)酵胞外粗多糖產(chǎn)量的影響見圖4．

圖4 無機(jī)鹽濃度對黑木耳液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響

由圖4可知80．00 mg/L的添加量胞外粗多糖產(chǎn)量最高．

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基配方

采用四因素三水平的響應(yīng)面進(jìn)行分析法，考察各因素的交互作用，試驗因素及水平設(shè)計見表1，試驗設(shè)計結(jié)果見表2．

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平設(shè)計表

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

經(jīng)Design-Expert8．0．5軟件對黑木耳液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)胞外粗多糖的產(chǎn)量進(jìn)行分析，得到二次模型回歸統(tǒng)計分析表見表3．

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

從方差分析表中可以看出，x1、x1x2項差異顯著，x2、x3、x2x4以及各因素的平方項差異極顯著，建立的回歸方程如下:

Y= － 69．18+1．85x1+1．89x2+14．42x3+0．20x4+0．04x1x2－0．08x2x3+0．02 x2x4－0．02 x3x4－0．03－0．22－2．01，該方程決定系數(shù)R2=0．941 2，修正決定系數(shù) Adj．R2=0．882 4，說明該模型能對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行較好的擬合，可以預(yù)測實際生產(chǎn)．

此外，由于F值越大代表因素對于試驗的指標(biāo)越重要，由表3可知:x2＞x3＞x1＞x4，即培養(yǎng)基中各組分對于黑木耳液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)胞外粗多糖的影響程度大小:酵母浸粉＞無機(jī)鹽＞玉米粉＞維生素B2．

圖5 玉米粉與酵母浸粉交互影響黑木耳胞外多糖響應(yīng)面圖

圖6 維生素B2與酵母浸粉交互影響黑木耳胞外多糖響應(yīng)面圖

圖7 胞外多糖與玉米粉水平、酵母浸粉水平等高線圖

圖8 胞外多糖與維生素B2水平、酵母浸粉水平等高線圖

進(jìn)行響應(yīng)面最優(yōu)分析可知，對于黑木耳液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖，玉米粉和酵母浸粉的交互作用顯著，維生素B2和酵母浸粉的交互作用極顯著．根據(jù)回歸方程繪制的響應(yīng)面和等高線如圖5～8，可以更加直觀地反映出其交互作用．等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反．

3 結(jié) 論

通過單因素試驗設(shè)計，采用Box-Behnken設(shè)計建立了黑木耳黑木耳液態(tài)深層發(fā)酵胞外粗多糖產(chǎn)量與四個關(guān)鍵因子的二次多項式回歸模型，經(jīng)檢驗證明該模型是合理可靠的．利用模型的響應(yīng)面分析黑木耳胞外粗多糖得率的關(guān)鍵因子及其相互作用．通過模型系數(shù)顯著性檢驗，得到因素的主效應(yīng)關(guān)系:酵母浸粉＞無機(jī)鹽＞玉米粉＞維生素B2．維生素B2雖然不是影響黑木耳液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的主要因素，但與酵母浸粉的交互作用極顯著．最終得到優(yōu)化培養(yǎng)基組成為:葡萄糖36．78 g/L，酵母浸粉11．23 g/L，無機(jī)鹽6．10 g/L，維生素B286．06 mg/L;在此條件下可得到胞外多糖的最大產(chǎn)量，預(yù)測值為6．074 g/L，對試驗結(jié)果進(jìn)行驗證，得到胞外多糖的產(chǎn)量為5．905 g/L，與理論預(yù)測值基本一致．

［1］ 陳麗華，章克昌．8味中藥對黑木耳發(fā)酵的影響［J］．食品與生物技術(shù)學(xué)報，2007，26(5):105-109．

［2］ 肖彩霞，王玉紅，章克昌．黑木耳深層發(fā)酵工藝條件的研究［J］．生物技術(shù)，2004，114(15):70-71．

［3］ 史岳紅，鮮喬，張擁軍．不同品種黑木耳多糖含量差異的研究［J］．浙江食用菌，2009，17(5):15-17．

［4］ YUAN Z，HE P，CUI J．Hypoglycemic effect of watersoluble polysaccharide from from woody ear(Auricularia auricula-judae Quel．)in genetically diabetic KKAy mice［J］．Journal of nutritional science and vitaminology，1998，44(6):29-40

［5］ 韓春然，徐麗萍．黑木耳多糖的提取、純化及降血脂作用的研究［J］．中國食品學(xué)報，2007，7(1):55-58．

［6］ J．Bohn，J．N．BeMiller．(l→3)-β-D-Glucans as biological respense modifiers:a review of structure-functional activity relations［J］．Carbohydrate Polymer，1995(28):3-14

［7］ 趙鑫．黑木耳分級多糖抗氧化活性及其相關(guān)生理功能研究［D］．哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2011

［8］ 張大為．以中藥為基質(zhì)的黑木耳多糖發(fā)酵工藝條件的研究［D］．貴陽:貴州大學(xué)，2008．

［9］ 唐青濤，陳福生．深層發(fā)酵黑木耳產(chǎn)胞外多糖的初步研究［J］．食品科學(xué)，2002，23(3):46-49．

［10］肖彩霞，章克昌．黑木耳胞外多糖深層發(fā)酵培養(yǎng)基組成的優(yōu)化［J］．無錫輕工大學(xué)學(xué)報，2004，23(3):24-26．

［11］王國良，王志江，蔡景順，等．黑木耳菌絲體發(fā)酵條件優(yōu)化和發(fā)酵罐生產(chǎn)多糖的試驗［J］．農(nóng)業(yè)科技通訊，2009(1):42-59．

［12］穆文靜，杜玲，扈瑞平，等．鈍頂螺旋藻多糖Sevage法脫蛋白工藝的研究［J］．內(nèi)蒙古石油化工，2011(10):1-4．