植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

劉秋林，鐘月仙，萬(wàn)偉峰，田 甜，林授楷，2，黃 健，薛李春，艾玉芳，柯玉琴，何華勤

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州350002;2.莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建 莆田 351100）

植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

劉秋林1，鐘月仙1，萬(wàn)偉峰1，田 甜1，林授楷1，2，黃 健1，薛李春1，艾玉芳1，柯玉琴1，何華勤1

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州350002;2.莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建 莆田 351100）

首先闡述了植物細(xì)胞蛋白質(zhì)磷酸化的作用機(jī)制，并從植物磷酸化蛋白質(zhì)的分離與鑒定技術(shù)、植物磷酸化蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)及植物蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)工具，對(duì)植物磷酸化蛋白質(zhì)組的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述.最后分析了植物磷酸化蛋白質(zhì)組研究中亟需關(guān)注的3個(gè)問題，即磷酸化蛋白質(zhì)的分離與鑒定技術(shù)的提升、位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具的完善及蛋白質(zhì)功能的分析.

植物;磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué);進(jìn)展

蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要方式，是一種可逆的過程，包括蛋白質(zhì)磷酸化修飾與去磷酸化修飾［1-5］.蛋白質(zhì)磷酸化修飾是在蛋白激酶的催化下供體磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體蛋白質(zhì)的某個(gè)氨基酸殘基上的過程，而蛋白質(zhì)去磷酸化是在磷酸化酶的催化下進(jìn)行的（圖1）.在真核生物中，蛋白質(zhì)磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上;在原核生物中蛋白質(zhì)磷酸化也可能發(fā)生在天冬氨酸、谷氨酸和組氨酸上［6］.研究表明，真核生物中發(fā)生磷酸

化修飾的酪氨酸、蘇氨酸和絲氨酸的數(shù)量比約為1∶200∶1800［7］.被磷酸化修飾的蛋白質(zhì)稱為磷酸化蛋白質(zhì)，一個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)可能含有1個(gè)或多個(gè)磷酸化氨基酸位點(diǎn)［8］.

研究［9，10］表明生物體內(nèi)蛋白激酶的激活、細(xì)胞變異與轉(zhuǎn)化、細(xì)胞發(fā)育等都受到蛋白質(zhì)磷酸化的調(diào)節(jié).而且蛋白質(zhì)的可逆磷酸化是目前人類所知道的生物體內(nèi)最主要的信號(hào)傳遞方式［11］.真核生物體內(nèi)隨時(shí)都有三分之一的蛋白質(zhì)被磷酸化［6］，且真核生物中編碼蛋白激酶和磷酸化酶的基因占全基因組的2%-4%［12］.但通過生物化學(xué)試驗(yàn)從各物種中鑒定獲得的磷酸化蛋白質(zhì)的數(shù)量十分有限［13］.隨著磷酸化蛋白質(zhì)富集與鑒定技術(shù)的不斷發(fā)展，探索生物體生命活動(dòng)過程的蛋白質(zhì)磷酸化現(xiàn)象，特別是分析蛋白質(zhì)磷酸化修飾對(duì)功能蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)控作用已成為一個(gè)熱點(diǎn)問題［14］.

圖1 蛋白質(zhì)磷酸化修飾過程Fig.1 Process of protein phosphorylation and de-phosphorylation

1 植物蛋白質(zhì)磷酸化修飾的作用機(jī)理

植物在適應(yīng)各種不同生理生態(tài)環(huán)境（如光、水、營(yíng)養(yǎng)、病蟲害）以及在不同生長(zhǎng)發(fā)育過程中都伴隨著蛋白質(zhì)磷酸化或去磷酸化修飾現(xiàn)象的發(fā)生［15］.蛋白質(zhì)磷酸化修飾的作用主要體現(xiàn)在如下3個(gè)方面.一是通過磷酸化修飾改變了受體蛋白質(zhì)的活性.蛋白質(zhì)磷酸化或去磷酸化修飾起到開啟或關(guān)閉蛋白質(zhì)活性的作用.Chao et al［16］應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)擬南芥磷酸丙酮酸羧化酶（PEPCK）的第55位點(diǎn)絲氨酸（Ser55）、58和59位點(diǎn)蘇氨酸（Thr58、Thr59）在光誘導(dǎo)下發(fā)生磷酸化修飾，尤其是Ser55位點(diǎn)的磷酸化修飾程度與PEPCK的活性成負(fù)相關(guān)，表明第55位點(diǎn)絲氨酸的磷酸化抑制了光誘導(dǎo)的PEPCK脫羧活性.二是磷酸化蛋白質(zhì)參與植物體內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo).Medzihradszky et al［17］研究發(fā)現(xiàn)擬南芥葉片中光受體——光敏素B（Phytochrome B）中位于第86位點(diǎn)的絲氨酸（Ser86）若被磷酸化修飾，光敏素B的活性就會(huì)受到抑制，從而阻礙了植株光誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo).三是蛋白質(zhì)磷酸化影響蛋白質(zhì)間的互作.由于在氨基酸殘基上結(jié)合或失去了磷酸基團(tuán)，從而改變了受體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，影響了該受體蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)間的互作.在水稻和擬南芥中，三維結(jié)構(gòu)分析表明α-微管蛋白的Thr349位于與β-微管蛋白互作的交界面上，對(duì)于α與β微管蛋白的互作及二聚體蛋白的形成至關(guān)重要.而Thr349的磷酸化修飾，影響了α與β微管蛋白質(zhì)間的互作，導(dǎo)致微管解聚［18］.

細(xì)胞中蛋白質(zhì)磷酸化水平是一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過程，其細(xì)微差異都可能導(dǎo)致細(xì)胞代謝水平上的變化［8］.因此，蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響是全方位的.

2 植物磷酸化蛋白質(zhì)的富集與鑒定技術(shù)

富集和分離出磷酸化蛋白質(zhì)是后續(xù)對(duì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行鑒定的前提.目前對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的分離富集技術(shù)主要有32P放射性標(biāo)記法、特異抗體的免疫共沉淀法、熒光染料染色和色譜分離法等技術(shù)［19］.由于細(xì)胞中磷酸化蛋白質(zhì)在植物組織總蛋白質(zhì)中所占的比例較小，檢測(cè)時(shí)易受其他蛋白質(zhì)的干擾.因此，各種不同的分離富集方法都是從組織總蛋白質(zhì)中富集分離出磷酸化蛋白質(zhì)，再通過下游的質(zhì)譜技術(shù)鑒定磷酸化蛋白質(zhì).

2.1 32 P 標(biāo)記法

該方法利用32P同位素示蹤標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基酸上的磷酸基團(tuán)，從而確定蛋白質(zhì)磷酸化修飾的狀態(tài).日本學(xué)者Khan et al［20］運(yùn)用［γ32P］標(biāo)記分析GA處理下水稻葉鞘中的磷酸化蛋白質(zhì)，共鑒定出44個(gè)發(fā)生磷酸化修飾蛋白質(zhì)，其中有13個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)參與信號(hào)傳遞.由于32P標(biāo)記具有放射性，試驗(yàn)操作要求較高，也比較繁瑣.因此，近年來，隨著新型磷酸化蛋白質(zhì)分離富集方法的興起，使用32P標(biāo)記法來分離磷酸化蛋白質(zhì)的研究少見報(bào)道.

2.2 免疫共沉淀法

該方法首先應(yīng)用雙向電泳技術(shù)（2-DE）分離組織細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，然后用磷酸化絲氨酸、磷酸化蘇氨酸和磷酸化酪氨酸的特異抗體先后進(jìn)行免疫共沉淀（western-blotting），成像后從對(duì)應(yīng)的2-DE凝膠上切取磷酸化蛋白質(zhì)點(diǎn)，膠上酶解后進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定.Kaufmann et al［21］首次合成磷酸化絲氨酸、磷酸化蘇氨酸和磷酸化酪氨酸的特定抗體.應(yīng)用該方法，He et al［22］、Ke et al［23］鑒定出ABA調(diào)控及干旱脅迫下水稻的磷酸化蛋白質(zhì).Rush et al［24］富集了4種細(xì)胞的600多個(gè)酪氨酸磷酸化的肽段，其中磷酸化位點(diǎn)約559個(gè).相對(duì)而言，磷酸化絲氨酸和蘇氨酸抗體的抗原決定簇較小，免疫共沉淀較為困難，而磷酸化酪氨酸抗體的抗原決定簇適中，更適用于免疫共沉淀分析.

2.3 熒光染料染色（Pro-Q diamond phosphoprotein stain，Pro-Q DPS）

Pro-Q可以高效地與磷酸化的氨基酸殘基結(jié)合.先采用2-DE技術(shù)對(duì)組織細(xì)胞的總蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，然后用Pro-Q對(duì)SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，只有磷酸化蛋白質(zhì)才會(huì)結(jié)合Pro-Q而顯色.而且Pro-Q可與銀染或考馬斯亮藍(lán)一起使用.Agrawa et al［25］發(fā)現(xiàn)Pro-Q DPS染色液稀釋3倍后同樣能保持較高的靈敏度與線性度，使Pro-Q DPS試驗(yàn)成本大幅降低.他們使用改進(jìn)后的Pro-Q DPS方法，鑒定出在油菜籽發(fā)育不同階段均發(fā)生磷酸化修飾的70個(gè)蛋白質(zhì)，并分析其功能，此研究是人類第1次大規(guī)模檢測(cè)植物的磷酸化蛋白質(zhì)組［26］.美國(guó)學(xué)者Chittetiet al［27］運(yùn)用SYPro Rubby染色法和Pro-Q染色法分離鑒定鹽脅迫下水稻根系的磷酸化蛋白質(zhì)與差異表達(dá)蛋白質(zhì)，共鑒定出28個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)和31個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì).Chen et al［28］也應(yīng)用Pro-Q技術(shù)分離并鑒定出高溫脅迫下苗期水稻葉片的磷酸化蛋白質(zhì).但熒光染料染色（Pro-Q DPS）對(duì)低豐度磷酸化蛋白點(diǎn)的結(jié)合率較低，易造成低豐度磷酸化蛋白質(zhì)的丟失.

2.4 色譜柱法

該方法是根據(jù)磷酸化蛋白質(zhì)和非磷酸化蛋白質(zhì)或雜質(zhì)的不同性質(zhì)，通過特異性材料進(jìn)行選擇性吸附和洗脫，達(dá)到分離磷酸化蛋白質(zhì)的目的.

2.4.1 固相金屬離子親和色譜（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）1975年P(guān)orath提出該方法，剛開始只用于分離標(biāo)記組氨酸，后來逐漸用于分離富集磷酸化蛋白質(zhì)［29］.其原理是磷酸化蛋白質(zhì)會(huì)與IMAC硅脂柱上的固相化金屬離子（Ga2+或Fe3+）通過靜電作用結(jié)合，然后先洗脫非磷酸化的雜質(zhì)，最后富集和分離出磷酸化蛋白質(zhì)［30］.該方法也存在一些缺點(diǎn)，如比較難洗脫有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)與IMAC柱緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)或多肽;部分磷酸化蛋白質(zhì)和多肽因未與IMAC柱結(jié)合而丟失［31］;有些帶負(fù)電的酸性氨基酸（如天冬氨酸、谷氨酸）可能與柱材料結(jié)合而引入雜質(zhì).研究［32］發(fā)現(xiàn)富集前對(duì)含酸性氨基酸的肽段進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，把羧基轉(zhuǎn)化為羧甲酯，可減弱非特異性吸附.

2.4.2 強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜（SCX） 大多數(shù)肽段經(jīng)過強(qiáng)陽(yáng)離子交換與胰蛋白酶處理后帶上2個(gè)負(fù)電荷，而磷酸基團(tuán)帶有1個(gè)負(fù)電荷.經(jīng)SCX色譜柱時(shí)，帶單電荷的磷酸化多肽由于其與柱的結(jié)合力弱先流出，帶多電荷的肽段由于其與柱的結(jié)合力強(qiáng)后流出.因此可以從含有多電荷復(fù)雜的非磷酸化肽段中分離出磷酸化肽段［33］.研究人員應(yīng)用該技術(shù)從海拉細(xì)胞核中分離鑒定出967種蛋白質(zhì)的2002個(gè)磷酸化位點(diǎn)［34］，而且發(fā)現(xiàn)將SCX和IMAC聯(lián)用的分離效果更佳［35］.

2.4.3 金屬氧化物親和色譜 是一種新興的磷酸化多肽富集技術(shù)，常用的金屬氧化物有 TiO2和Al（OH）3等.TiO2柱層析的原理與IMAC類似.TiO2是一種兩性電解質(zhì)，在酸性溶液中Ti帶正電，能與磷酸鹽結(jié)合;在高pH或磷酸緩沖液中又可被洗脫下磷酸化多肽［36］.這種方法會(huì)受到溶液中酸性氨基酸的影響，若在上樣溶液中加入2，5-二羥基苯甲酸（2-hydroxy-5-methoxybenzoicacid，DHB），可提高TiO2富集的特異性［37］.Prak et al［38］應(yīng)用改進(jìn)后的TiO2柱層析法富集擬南芥細(xì)胞膜的磷酸化蛋白質(zhì)，找到6個(gè)新的磷酸化位點(diǎn).

Al（OH）3富集原理是Al（OH）3中Al3+與磷酸基團(tuán)具有親和作用，而非磷酸化多肽及酸性多肽與Al3+的結(jié)合率較低.采用Al（OH）3色譜，Wolschin et al［39］鑒定出擬南芥種子中9個(gè)蛋白質(zhì)的16個(gè)磷酸化位點(diǎn).

2.5 磷酸鈣沉淀法

該方法的基本原理是在堿性條件下磷酸基團(tuán)與磷酸鈣螯合而沉淀，在酸性條件下又被釋放.先用磷酸鈣沉淀蛋白質(zhì)酶解液中的磷酸化肽段，然后再用IMAC或者TiO2法富集磷酸化肽段，可顯著提高富集效率.該方法快捷、成本低，可對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行初篩.Zhang et al［40］通過將磷酸鈣沉淀法與IMAC聯(lián)用，鑒定了水稻胚細(xì)胞中125種蛋白質(zhì)的242個(gè)磷酸化位點(diǎn).

2.6 化學(xué)標(biāo)記法

化學(xué)標(biāo)記法是利用磷酸化的絲氨酸或蘇氨酸經(jīng)過消除反應(yīng)后形成雙鍵，再與硫代乙二醇發(fā)生加成反應(yīng)，用巰基取代磷酸根，然后在巰基上連接生物素或加入雙重功能的新配基后進(jìn)行分離富集［41］.化學(xué)標(biāo)記技術(shù)的最大不足是磷酸化的酪氨酸不能發(fā)生消除反應(yīng).

2.7 磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)是一種常用、可靠的蛋白質(zhì)或多肽分析方法，但近年來興起的蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)在磷酸化蛋白質(zhì)的檢測(cè)上表現(xiàn)出自身的優(yōu)勢(shì).蛋白質(zhì)微陣列是指將大量蛋白質(zhì)或配基按一定序列高密度地固定在特殊處理的載玻片上，形成蛋白質(zhì)探針點(diǎn)陣.蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)具有快速、靈敏和易于自動(dòng)化等多種優(yōu)點(diǎn)［42］，可用于檢測(cè)低豐度的磷酸化蛋白質(zhì)［43］.可以選擇不同的蛋白激酶作探針來檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì).Kersten et al［44］制作了第1張植物（擬南芥）蛋白質(zhì)微陣列，并采用該技術(shù)分析植物中促分裂素原活化蛋白激酶的信號(hào)傳導(dǎo)途徑［45］.研究人員在采用多肽陣列技術(shù)研究擬南芥根系細(xì)胞特異性的磷酸化蛋白質(zhì)及其激酶時(shí)，發(fā)現(xiàn)H2O2能誘導(dǎo)MPK3催化而使mRNA的剪接因子SLC30發(fā)生磷酸化，而H2O2不影響富含絲氨酸和精氨酸的蛋白質(zhì)特異性激酶4（SRPK4），這個(gè)發(fā)現(xiàn)為證明激酶的動(dòng)態(tài)性提供了新的依據(jù)［46］.

由上述分析可知，不同的磷酸化蛋白質(zhì)富集分離技術(shù)方法各有優(yōu)勢(shì)，也都存在不足之處.為了減少鑒定結(jié)果的假陽(yáng)性，可通過多種方法互補(bǔ)進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)的分離與鑒定.

3 植物磷酸化蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)

生物學(xué)數(shù)據(jù)的不斷積累，促進(jìn)了相應(yīng)生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的發(fā)展，使生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的研究逐漸成為相應(yīng)學(xué)科研究的重要組成部分［47］.研究人員應(yīng)用各種生物化學(xué)方法，從不同物種中鑒定出大量的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn).生物信息學(xué)研究人員對(duì)這些蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，開發(fā)出具有不同用途的磷酸化蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，如收集來自各種物種磷酸化蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)——Phospho.ELM，還有關(guān)于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的數(shù)據(jù)庫(kù)dbPTM，甚至前人還專門開發(fā)出擬南芥蛋白磷酸化位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)——PhosPhAt2.2［48-50］.下面簡(jiǎn)要介紹一些常用的植物磷酸化蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù).

3.1 Phospho.ELM 數(shù)據(jù)庫(kù)

該數(shù)據(jù)庫(kù)是通過手動(dòng)的方式從公開發(fā)表的文獻(xiàn)資料中收集經(jīng)試驗(yàn)鑒定來自不同物種的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn).現(xiàn)共存儲(chǔ)有42574個(gè)非冗余的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn).在Phospho.ELM中不僅收錄了相應(yīng)激酶催化的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)，還附加了相關(guān)的信息，包括參考文獻(xiàn)、亞細(xì)胞分布、參與的信號(hào)傳導(dǎo)途徑等［48］.還有一些新的特征也被存儲(chǔ)在其中，如結(jié)構(gòu)性亂紊型、規(guī)則型以及保守型位點(diǎn)等.最后還鏈接到分子互作數(shù)據(jù)庫(kù)（MINT）.

3.2 dbPTM 數(shù)據(jù)庫(kù)

dbPTM的數(shù)據(jù)來源主要是從SWISS-PROT，O-GLYCBASE和Phospho.ELM數(shù)據(jù)庫(kù)中整合已經(jīng)獲得試驗(yàn)驗(yàn)證的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾位點(diǎn)數(shù)據(jù)，并不斷地更新和加入新的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾數(shù)據(jù).dbPTM還對(duì)一些注釋信息較少的數(shù)據(jù)，尤其是磷酸化、硫酸化和糖基化蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)和注釋［49］.

3.3 PhosPhAt數(shù)據(jù)庫(kù)

PhosPhAt數(shù)據(jù)庫(kù)專門收錄擬南芥的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)數(shù)據(jù).目前共收錄了6300多個(gè)蛋白質(zhì)的14000多個(gè)磷酸化位點(diǎn)信息［50］.同時(shí)，PhosPhAt也是一個(gè)專門用于擬南芥的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)工具.

可以預(yù)見，蛋白質(zhì)磷酸化數(shù)據(jù)庫(kù)的開發(fā)將往分類精細(xì)、信息全面、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、冗余率低的方向發(fā)展.

4 植物蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)工具

生物學(xué)數(shù)據(jù)的不斷積累使得通過數(shù)據(jù)訓(xùn)練算法開發(fā)出各種預(yù)測(cè)工具成為可能.2006年報(bào)道了150個(gè)新的在線預(yù)測(cè)工具［10］.研究人員開發(fā)出許多蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)的高通量、自動(dòng)化與低成本化［51］.由于哺乳動(dòng)物和人類磷酸化蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的積累較快，前期研究人員開發(fā)出的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具大多更適用于預(yù)測(cè)動(dòng)物和人類的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)［51］.近年來，隨著植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷發(fā)展，研究人員也開發(fā)出適用于植物的蛋白質(zhì)磷酸化預(yù)測(cè)工具.

4.1 M usite 預(yù)測(cè)工具

Musite適用于所有或特定激酶催化的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)［52］.它利用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法將磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)模擬為一個(gè)失衡的分類問題.該預(yù)測(cè)工具收集了多種生物體磷酸化蛋白質(zhì)組的可靠試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用這些數(shù)據(jù)來訓(xùn)練磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)模型.Musite工具使用的3種特征提取方法分別為K-Nearest Neighbor（KNN）、Protein Disorder和氨基酸頻率.KNN方法能獲取由相同激酶或激酶家族所催化的磷酸化位點(diǎn)周圍序列的相似性.Disorder分值反映了磷酸化殘基在無(wú)序區(qū)域出現(xiàn)的可能性.

Musite 1.0共訓(xùn)練了6種生物體的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)模型和13個(gè)激酶或激酶家族的特定激酶預(yù)測(cè)模型.這6種生物體分別是Homo sapiens（人類）、Muroidea musculus（老鼠）、Drosophila melanogaster（果蠅）、Caenorhabditis elegans（蠕蟲）、Saccharomyces cerevisiae（酵母）和Arabidopsis thaliana（擬南芥），用戶可以自由選擇一個(gè)生物模型進(jìn)行預(yù)測(cè).Musite可滿足用戶對(duì)不同置信度的要求.用戶可以根據(jù)需要，把預(yù)測(cè)的閾值類型設(shè)置為特異性或分值，并且可以連續(xù)地調(diào)整其特異性值或分值.

4.2 PlantPhos預(yù)測(cè)工具

PlantPhos應(yīng)用最大依賴性分解（MDD）方法［53］，將所有磷酸化片段進(jìn)行聚類，形成具有顯著位點(diǎn)特異性的磷酸化片段子集［54］;并且把每個(gè)MDD聚類產(chǎn)生的序列子集的模序，與Phospho.ELM數(shù)據(jù)庫(kù)中已知激酶的作用模序進(jìn)行對(duì)比［48］;對(duì)MDD聚類產(chǎn)生的每個(gè)優(yōu)化序列子集，運(yùn)用隱馬爾可夫模型（HMM）分別建立相應(yīng)模型［55］.用戶在搜索時(shí)，HMMER會(huì)返回1個(gè)HMMER值和期望值（E值）.HMMER值是比率的對(duì)數(shù)值，該比率是查詢序列具有顯著匹配的可能性與序列是由隨機(jī)模型產(chǎn)生可能性的比值.E值表示期望值大于或等于返回的HMMER值的序列數(shù)目.若某位點(diǎn)的查詢結(jié)果中，HMMER值大于臨界值，則表明該位點(diǎn)被預(yù)測(cè)為磷酸化位點(diǎn)［54］.

4.3 PhosphAt預(yù)測(cè)工具

以試驗(yàn)鑒定出的擬南芥蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)數(shù)據(jù)為訓(xùn)練集，使用支持向量機(jī)算法（SVM）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的絲氨酸磷酸化位點(diǎn).如果SVM計(jì)算獲得的預(yù)測(cè)值大于0，則認(rèn)為該位點(diǎn)被磷酸化;如果該預(yù)測(cè)值小于0，則認(rèn)為該位點(diǎn)未被磷酸化［56］.

4.4 PhosphoRice 預(yù)測(cè)工具

PhosphoRice是專門用于水稻蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)工具.常見的磷酸化蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)工具包括Netphos2.0、Kinasephos、Scansite、NetphosK、Disphos、Kinasephos2.0 和 Predphosphos，首先利用它們對(duì)訓(xùn)練數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，獲得各工具預(yù)測(cè)結(jié)果的靈敏度Sn、特異性Sp、準(zhǔn)確度ACC和馬修斯系數(shù)MCC等指標(biāo).從中選擇若干種預(yù)測(cè)效果較好的工具進(jìn)行整合.整合方法包括限制性網(wǎng)格搜索法、未加權(quán)表決法、減數(shù)加權(quán)表決法和加權(quán)表決法等.通過設(shè)定不同的權(quán)重和閾值，從中獲得最佳的權(quán)重分配，最后集合成一個(gè)專門針對(duì)水稻的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具——PhosphoRice［57］.

5 展望

近年來，數(shù)學(xué)、物理、化學(xué)和生物科學(xué)等學(xué)科間的不斷融合，促進(jìn)了植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)與方法的發(fā)展，使得大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)的分離與鑒定成為可能;植物磷酸化蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的功能趨于精細(xì);蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具的性能日漸成熟.通過加強(qiáng)以下3個(gè)方面的研究促進(jìn)植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究往縱深發(fā)展.

（1）優(yōu)化蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的分離與鑒定技術(shù).當(dāng)前植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)展的一個(gè)瓶頸是分離與鑒定技術(shù).各種技術(shù)普遍存在假陽(yáng)性高、自動(dòng)化程度低等弊端，而且由于缺乏類似DNA擴(kuò)增的技術(shù)，低豐度磷酸化蛋白質(zhì)也不易被檢測(cè)到.只有磷酸化蛋白質(zhì)分離與鑒定技術(shù)取得突破性進(jìn)展，才能支撐植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的跨越性發(fā)展.

（2）開發(fā)高通量、精確性高的植物蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具，引領(lǐng)植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究從“嘗試型”向“驗(yàn)證型”方式的轉(zhuǎn)變.傳統(tǒng)的生物學(xué)研究策略大都采用“嘗試—錯(cuò)誤—再嘗試—發(fā)現(xiàn)”的模式，為發(fā)現(xiàn)一個(gè)蛋白質(zhì)磷酸化的位點(diǎn)，往往需要花費(fèi)大量的時(shí)間和經(jīng)費(fèi).如果應(yīng)用預(yù)測(cè)工具先篩選出可能的磷酸化位點(diǎn)，再應(yīng)用生物化學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，這種“驗(yàn)證型”研究策略不但提高了試驗(yàn)效率，也節(jié)省了開支.因此，未來植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)方向就是要在磷酸化蛋白質(zhì)位點(diǎn)數(shù)據(jù)持續(xù)積累的基礎(chǔ)上，采用合理有效的特征提取策略，訓(xùn)練優(yōu)異的算法，開發(fā)出更精確、高通量的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具，為下游生化試驗(yàn)指明方向［51］.

（3）磷酸化蛋白質(zhì)的功能分析.磷酸化蛋白質(zhì)的功能分析是后基因組時(shí)代的重要研究?jī)?nèi)容.尤其是在蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)和生物化學(xué)鑒定技術(shù)不斷完善的前提下，蛋白質(zhì)磷酸化修飾或去磷酸化修飾的功能分析就顯得尤為必要.氨基酸點(diǎn)突變［17］、去磷酸化［22］及基因敲除等技術(shù)，都可用于蛋白質(zhì)磷酸化修飾的功能分析研究.

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（責(zé)任編輯:葉濟(jì)蓉）

New advance in the research of plant phosphoproteome

LIU Qiu-lin1，ZHONG Yue-xian1，WANWei-feng1，TIAN Tian1，LIN Shou-kai1，2，HUANG Jian1，XUE Li-chun1，AIYu-fang1，KE Yu-qin1，HE Hua-qin1
（1.College of Life Sciences，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China;2.College of Environmental and Biological Engineering，Putian University，Putian，F(xiàn)ujian 351100，China）

The functions of protein phosphorylation were discussed firstly.Then，the advances in the research of plant phosphoproteome were reviewed，including themethods of phosphoproteins extraction and identification，the databases of protein phosphorylated sites and the predictors of protein phosphorylation sites.Finally，the new research areas in plant phosphoproteomewere put forward，including the improvement of the technology of phophosprotein extraction and identification，the enhancement of the performance of predictors on phophorylation sites，and the analysis of the function of phosphorylated protein.

plant;phosphoproteomics;advance

Q51

A

1671-5470（2015）03-0225-07

10.13323/j.cnki.j.fafu（nat.sci.）.2015.03.001

2014-11-25

2015-01-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31270454）;福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2013J01077）.

劉秋林（1988-），男，碩士研究生.研究方向:植物蛋白質(zhì)組學(xué).通訊作者何華勤（1968-），男，教授，博士生導(dǎo)師.研究方向:植物逆境生理與分子生態(tài)學(xué).Email:hehq3@fafu.edu.cn.