• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    乙型肝炎病毒反轉錄酶區(qū)rtI233V變異的演變及病毒學特點分析

    2015-03-02 05:27:44葉曉玲劉妍陳容娟許智慧李曉東葉海燕唐振祥程書權徐東平
    解放軍醫(yī)學雜志 2015年3期
    關鍵詞:病毒學抗病毒變異

    葉曉玲,劉妍,陳容娟,許智慧,李曉東,葉海燕,唐振祥,程書權,徐東平

    核苷(酸)類似物(NAs)具有強效抑制乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)、改善肝臟功能、延緩肝臟疾病進展以及口服方便、副反應小等特點,已廣泛應用于慢性乙肝(chronic hepatitis B,CHB)的治療,然而長期用藥引起的耐藥問題為臨床乙肝防治帶來了新的挑戰(zhàn)。阿德福韋酯(ADV)是第一種應用于臨床的核苷酸類藥物,因其對HBV野生株和核苷類藥物拉米夫定(LAM)耐藥株均有較強的抗病毒作用而被廣泛用于臨床CHB患者的治療,但長期應用仍具有較高的耐藥率(5年耐藥率為29%)。經(jīng)典的ADV耐藥變異為HBV反轉錄酶(RT)區(qū)rtN236T和rtA181V變異[1-2]。近年有研究報道HBV rtI233V位點變異可引起ADV耐藥,但也有報道該變異仍對ADV敏感[3-9]。本研究從臨床大樣本患者入手,分析rt I233V變異的發(fā)生頻率,并重點分析其中2例慢性HBV患者rtI233V變異的演變過程,總結變異株與野生株的表型耐藥特點,明確rtI233V位點變異的病毒學特點及其臨床意義。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象 2010年7月-2013年8月解放軍302醫(yī)院收治的慢性HBV感染者9830例,均接受不同的NAs治療。診斷標準符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[10],常規(guī)檢查項目由解放軍302醫(yī)院臨床檢驗中心完成,無重疊或混合感染,血清凍存于–20℃。

    1.2 主要試劑 病毒DNA-OUT提取試劑盒(北京天恩澤公司),pGEM-Teasy載體(Prom ega公司,美國),XbaⅠ/SphⅠ內(nèi)切酶及T4DNA連接酶(TaKaRa公司,日本),p TriEx-HBV(C)1.1倍載體(法國里昂大學Zou lim教授惠贈),X-trem eGENE HD 轉染試劑(Roche公司,德國),胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(Gib co公司,美國),熒光定量PCR試劑盒(上海復星公司)。引物合成和克隆測序均由北京天一輝遠公司完成。

    1.3 方法

    1.3.1 HBV RT區(qū)基因耐藥變異與基因型分析 采用病毒DNA-OUT試劑提取患者血清HBV DNA,HBV RT區(qū)基因擴增采用本室建立的單管巢式PCR方法[11],對PCR產(chǎn)物進行DNA雙向測序,并對rt80、rt84、rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt233、rt236和rt250等耐藥相關位點的序列峰圖進行分析。用Mega 4軟件進行HBV基因分型[12]。

    1.3.2 HBV RT區(qū)TA基因克隆 將擴增后的PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-Teasy載體中,轉化JM 109感受態(tài)細胞,挑選至少20個經(jīng)PCR鑒定陽性的樣品送測序并分析耐藥變異。

    1.3.3 p TriEx-HBV 1.1倍重組載體的構建及鑒定分別提取含相關變異類型(rtI233V、rtN236T及rtI233V+rtN236T)和野生型克隆的質(zhì)粒,將其RT區(qū)片段經(jīng)XbaⅠ和SphⅠ雙酶切后定向克隆至經(jīng)同樣酶切后的p TriEx-HBV(C)1.1倍表達載體上,連接產(chǎn)物轉化JM 109感受態(tài)細胞,接種至LB固態(tài)瓊脂板(含100g/m l氨芐青霉素),37℃溫箱培養(yǎng)過夜。隨機挑取克隆測序,對重組質(zhì)粒進行鑒定,確定HBV表達載體構建成功。

    1.3.4 細胞轉染及表型耐藥分析 將HepG2細胞接種于24孔板(10萬/孔),18h后每孔轉染0.25μg質(zhì)粒;5h后,細胞用1×PBS洗2次,分別加入含倍增濃度藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)(LAM:0、0.01、0.1、1、10、100μm o l/L;ADV:0、3.125、6.25、12.5、25、50μm o l/L;ETV:0、0.001、0.01、0.1、1、10μm o l/L;TDF:0、0.78、3.125、12.5、50、200μm o l/L),隔天換藥。4d后收集細胞培養(yǎng)上清,用DNase消化游離DNA,37℃過夜;75℃ 10m in滅活DNase,裂解釋放Dane顆粒中的DNA。采用實時熒光定量PCR法檢測上清中的HBV DNA載量,計算藥物半數(shù)有效濃度(EC50)及耐藥倍數(shù)[即變異株與野生株EC50的比值(Fo ld)]。

    1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 18.0軟件分析數(shù)據(jù)。連續(xù)變量以±s表示,組間差異的比較根據(jù)分組分別采用t檢驗和方差分析,P<0.05(雙側)為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結 果

    2.1 臨床樣本資料和rtI233V變異檢出分析 應用PCR產(chǎn)物直接測序法從9830例慢性乙肝患者血清樣本中共檢出rtI233V變異28例,檢出率0.28%;檢出經(jīng)典ADV耐藥變異rtA181V和(或)rtN236T 653例,檢出率6.64%。進一步分析rtI233V變異類型,其中單獨變異19例,與其他變異聯(lián)合出現(xiàn)9例。28例患者中男24例,女4例,年齡34.8±12.9歲,HBV DNA載量4.6±1.5 LogU/m l,ALT 48.8±33.3U/L。檢出該變異的患者均有ADV治療史,其中16例(57.1%)接受ADV單藥治療6個月以上,其余12例(42.9%)接受包括ADV的多藥序貫聯(lián)合治療1年以上。HBV基因型分析顯示8例為B基因型,20例為C基因型。

    2.2 兩例患者rtI233V變異的臨床演變 回顧性分析2例HBeAg陰性慢性乙肝患者rtI233V變異的臨床演變。

    患者1,男,36歲。治療基線(S1)時僅檢測到野生型病毒株,HBV DNA載量和ALT分別為5.4 Log U/m l和53U/L。首次經(jīng)ADV單一抗病毒治療1個月后未檢測到HBV DNA,實現(xiàn)了快速病毒學應答,16個月后出現(xiàn)病毒學突破,血清HBV DNA載量升至3.12LogU/m l,繼續(xù)服用ADV 1個月后,血清HBV DNA載量為2.8LogU/m l,ALT正常,HBV RT區(qū)克隆檢出rt I233V變異(S2),該變異株占病毒準種池的6.25%。繼續(xù)服用ADV治療至45個月(S3)時,HBV DNA為3.68LogU/m l,ALT正常。此時克隆測序顯示rtI233V變異株占25.0%,rtN236T變異株占62.5%,rtI233V+rtN236T變異株占6.25%,因服用ADV抑制病毒效果欠佳,換用ETV繼續(xù)抗病毒治療,HBV DNA一直處于最低檢測下限(圖1A、1B)。

    圖1 患者1的臨床抗病毒治療應答、病毒學演變及體外復制力評價Fig.1 Clinical virological and biochem ical response in patient 1 during antiviral therapy (A), dynam ic evo lutions of rtI233V m utation by clonal sequencing (B) and the in vitro assessm ent of HBV natural rep lication com petence of various viral stains (C)w t. Wild type; (1)P<0.05 com pared with rtN236T m u tan t

    患者2,男,49歲。治療基線(S4)時僅檢測到野生型病毒株,HBV DNA載量和ALT分別為4.57 LogU/m l和66U/L,經(jīng)ADV單一抗病毒治療3個月(S5)后,HBV DNA升至5.54LogU/m l,ALT恢復正常;HBV RT區(qū)克隆檢出rtI233V變異,占病毒準種池的26.7%,換用聚乙二醇干擾素治療5個月后,HBV DNA下降仍不理想,ALT波動,最高升至118U/L。繼續(xù)ADV抗病毒治療4個月(S6)后,HBV DNA升至5.9LogU/m l,HBV RT區(qū)克隆顯示rtI233V變異占病毒準種池的86.4%,換用ETV后病毒逐漸降至最低檢測下限,ALT維持正常水平(圖2A、2B)。

    圖2 患者2的臨床抗病毒治療應答、病毒學演變及體外復制力評價Fig.2 Clinical virological and biochem ical response in patient 2 during antiviral therapy (A), dynam ic evolutions of rtI233V mutation by clonal sequencing (B) and the in vitro assessment of HBV natural rep lication com petence of various viral stains (C)w t. W ild type

    2.3 病毒體外復制力測定 分別將患者1的野生株和變異株(rtI233V、rtN236T、rtI233V+rtN236T)的重組載體質(zhì)粒及患者2的野生株和rtI233V變異株的重組載體質(zhì)粒瞬時轉染Hep G2細胞,4d后測定細胞上清中HBV DNA載量即為病毒體外復制力,取3次獨立實驗的平均值(圖1C、圖2C),結果顯示rtN236T單獨變異株的復制力(5.38±0.31LogU/m l)低于野生株(6.20±0.1LogU/m l),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而rtI233V+rtN236T變異株的復制力為6.27±0.28LogU/m l,顯著增加了由于rtN236T變異而受損的病毒復制力(P<0.05)。患者2的野生株病毒復制力(6.67±0.10LogU/m l)與rtI233V變異株病毒復制力(6.82±0.08 LogU/m l)比較差異無統(tǒng)計學意義。2.4 變異株的表型耐藥分析 從2例患者分離的野生株和單獨rt I233V變異株對ADV均敏感,而rtN236T和rtI233V+rtN236T變異株對ADV均顯示不同程度的耐藥,耐藥倍數(shù)分別為6.82和5.28;此外,野生株與rtI233V、rtN236T、rtI233V+rtN236T變異株對LAM、ETV及TDF均敏感(表1)。

    表1 患者1與患者2各變異類型的耐藥表型分析Tab.1 Pheno typ ic assay of m u tan ts and w ild-type strain of the tw o patien ts

    3 討 論

    目前NAs是臨床最常用的抗HBV藥物[13],其作用靶點均為HBV RT區(qū),對HBV cccDNA并沒有直接抑制作用,因此需要長期服用。長期應用NAs會導致對環(huán)境壓力適應力強的變異病毒株獲得適應性突變和選擇性擴增,或使已存在于準種池中的極少量變異株獲得選擇性擴增,使耐藥病毒逐漸成為優(yōu)勢種群,導致病毒學和生化學突破,最終導致病情惡化。ADV是繼LAM之后第二種應用于臨床的NAs類藥物,可明顯抑制HBV DNA的復制,促進乙肝患者血清轉氨酶正常化,促進肝臟組織學改善,且價格適中,適用于慢性乙肝患者和對LAM耐藥的患者,但長期應用后的耐藥也是患者在抗病毒治療過程中難以避免的問題。

    rtN236T變異與rtA181V變異是經(jīng)典的ADV耐藥變異形式[1],rtI233變異位點與rtN 236變異位點相距3個堿基,是否同樣可導致ADV耐藥引起了學者們的廣泛關注。rt I233V位點變異最早見于德國學者的報道,Schildgen等[3]于2006年首次經(jīng)體外實驗證實了rt I233V變異會引起ADV原發(fā)耐藥,EC50是野生株的6~10倍;而同一課題組的Geipel等[6]于2014年的研究卻發(fā)現(xiàn),rtI233V變異并不會影響病毒對ADV的敏感性。Ism ail等[7]通過蛋白質(zhì)空間結構的同源模建和分子對接方法,闡明rt I233V變異不會影響蛋白質(zhì)的催化位點,認為rt I233V變異不會影響ADV的抗病毒作用。Ahn等[8]提出rtI233V變異會影響病毒復制力,并引起ADV耐藥。鄧俊等[9]通過定點突變及Sou thern b lo tting等實驗技術證實rtI233V變異能導致HBV對ADV輕度耐藥。可見,關于rtI233V變異與ADV耐藥的相關性仍存較大爭議。

    為了進一步闡明rtI233V變異與ADV的相關性,本研究通過對大樣本慢性HBV感染者的測序分析,從9830例患者樣本中檢出28例rtI233V位點變異(單獨出現(xiàn)或與其他耐藥變異共同存在),對其中2例服用ADV后發(fā)生病毒學突破或原發(fā)性無應答的典型病例進行隨訪分析,病毒復制力檢測結果表明,rtI233V變異株的體外復制力與野生株相當,而常見的耐藥相關變異株的病毒復制力比野生株低[14-15],這與機體免疫系統(tǒng)或藥物的選擇壓力有關[16]。本研究結果顯示rtI233V變異僅在有ADV用藥史的患者樣本中檢出,且病毒準種池中的rtI233V變異隨著ADV用藥時間的延長而增加,說明該變異與ADV用藥有關。

    本研究還運用體外表型耐藥分析明確了rtI233V位點變異對4種NAs耐藥的影響,ADV表型耐藥結果顯示rtI233V、rtN236T和rtI233V+rtN236T變異株的EC50分別是野生株的1.57、6.82和5.28倍。臨床通常將抗病毒藥物的耐藥分為3個級別:耐藥倍數(shù)2~9倍為輕度耐藥,10~99倍為中度耐藥,大于100倍為高度耐藥。但是由于受到藥物臨床實際暴露量、在體內(nèi)代謝變化等因素的影響,不同藥物引起臨床耐藥需要的藥物敏感性下降程度(即EC50增加值)有很大差別,通常認為引起ADV耐藥變異EC50與野生毒株相比需增加2.5倍以上,引起ETV和TDF耐藥變異EC50需增加10倍以上,引起LAM耐藥變異EC50需增加100倍以上[17]。本研究結果顯示,無論是rtI233V單獨變異(與野生株相比)還是與rtN236T聯(lián)合變異(與rtN236T耐藥株相比)對ADV的影響均不到2.5倍,說明rtI233V不是ADV原發(fā)耐藥變異。但rtI233V變異可以增加rtN236T變異株受損的病毒復制力,因而該變異符合ADV耐藥相關的復制力補償變異的特點,與本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)的LAM相關的復制力補償變異rtL229F變異類似[18]。

    本研究結果表明,rt I233V位點變異對LAM、ETV、TDF 3種藥物均敏感。2例患者換用ETV補救抗病毒治療后,病毒載量降至最低檢測下限,說明ADV治療失敗后換用與其無交叉耐藥位點的ETV治療有效,與相關文獻報道一致[19-20]。

    總之,本研究首次通過臨床大樣本對rt I233V變異頻率、演變規(guī)律、體外復制力及表型耐藥進行分析,發(fā)現(xiàn)rt I233V變異與ADV用藥療效不佳有關,是一種ADV耐藥相關復制力補償變異,臨床換用ETV繼續(xù)治療可獲得持續(xù)病毒學和生化學應答。本研究結果對深入了解ADV相關耐藥變異的臨床特點、優(yōu)化抗HBV治療方案具有重要意義。

    [1] Segovia MC, Chacra W, Go rdon SC. Ade fovir d ip ivoxil in ch ronic hepatitis B: history and curren t uses[J]. Expert Op in Pharm aco ther, 2012, 13(2): 245-254.

    [2] Wang X, Liu Y, Si LL, et al. Analysis for phenotyp ic resistan t characteristics of a novel m utation rtN236V in the reversetranscrip tase dom ain of hepatitis B virus iso lated from an adefovir dipivoxil-refractory patient with chronic hepatitis B[J].Med J Chin PLA, 2013, 38(4): 256-259. [王曉, 劉妍, 思蘭蘭,等. 阿德福韋酯治療失敗的慢性乙型肝炎患者HBV反轉錄酶區(qū)新變異rtN236V的表型耐藥特點分析[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2013, 38(4): 256-259.]

    [3] Schildgen O, Sirm a H, Gerlich WH, et al. Variant of hepatitis B virus with p rim ary resistance to adefovir[J]. N Eng l J Med, 2006,354(17): 1807-1812.

    [4] Curtis M, Zhu Y, Borroto-Esoda K. Hepatitis B virus containing the I233V m utation in the po lym erase reverse-transcrip tase dom ain rem ains sensitive to inhibition by adefovir[J]. J In fect Dis, 2007, 196(10): 1483-1486.

    [5] Sch ildgen O, O lo tu C, Funk A, et a l. Se lection and counterselection of the rtI233V adefovir resistance m utation during antiviral therapy[J]. J Clin M icrobio l, 2010, 48(2): 631-634.

    [6] Geipel A, Glebe D, Gerlich WH, et al. Hepatitis B virus rtI233V m utation and resistance to adefovir[J]. N Eng l J Med, 2014,370(17): 1667-1668.

    [7] Ism ail AM, Sharm a OP, Kum ar MS, et al. Im pact of rtI233V m utation in hepatitis B virus po lym erase p rotein and adefovir efficacy: Hom ology m odeling and m olecular docking studies[J].Bioin fo rm ation, 2013, 9(3): 121-125.

    [8] Ahn S, Park Y, Kim K, et al. The im pact of the hepatitis B virus polym erase rtA181T m utation on rep lication and drug resistance is potentially affected by overlapping changes in surface gene[J].J Viro l, 2014, 88(12): 6805-6818.

    [9] Deng J, Yu DM, Zhang XX, et al. Im pact of 1233V m utation in the hepatitis B virus reverse transcrip tase dom ain on adefovir resistance[J]. Chin J In fect Dis, 2011, 29(3): 129-133. [鄧俊,于德敏, 張欣欣, 等. 乙型肝炎病毒P基因反轉錄酶區(qū)I233V變異對阿德福韋酯耐藥的實驗研究[J]. 中華傳染病雜志,2011, 29(3): 129-133.]

    [10] Chinese Society of Hepato logy and Ch inese Society of In fectious Diseases, Chinese Medical Association. The guideline of p revention and treatm ent for chronic hepatitis B (2010)[J].In fect Dis In fo, 2011, 24(1): Ⅲ-ⅩⅤ. [中華醫(yī)學會肝病學分會,中華醫(yī)學會感染病學分會. 慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J]. 傳染病信息, 2011, 24(1): Ⅲ-ⅩⅤ.]

    [11] Xu DP, Liu Y, Cheng J, et al. Multip le-site analysis of HBV d rugresistant m utations in 340 patients with chronic hepatitis B[J].Chin J Hepato l, 2008, 16(10): 735-738. [徐東平, 劉妍, 成軍,等. 340例慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒多位點耐藥相關突變分析[J]. 中華肝臟病雜志, 2008, 16(10): 735-738.]

    [12] Liu Y, Zhong YW, Xu ZH, et al. Features and clinical im p lications of hepatitis B virus genotypes and m u tations in basal co re p rom oter/ p recore region in 507 Chinese patients with acute and ch ronic hepatitis B[J]. J Clin Viro l, 2010, 47(3): 243-247.

    [13] Yu YQ, Zhang WH. Progress in antiviral therapy to p revent HBV recurrence in patients of post-liver transp lan tation[J]. Chin J Pract In tern Med, 2014, 34(6): 553-557. [喻一奇, 張文宏. 預防肝移植患者慢性乙型肝炎復發(fā)抗病毒治療現(xiàn)狀及進展[J]. 中國實用內(nèi)科雜志, 2014, 34(6): 553-557.]

    [14] Liu Y, Li XD, Xin SJ, et al. The rtA181S m utation of hepatitis B virus p rim arily con fers resistance to adefovir dipivoxil[J]. J Viral Hepat, 2014, 8(14): 1-7.

    [15] Liu Y, Liu WH, Xu DP, et al. Screening and iden tification of a novel adefovir dipivoxil resistance associated m utation, rtN236V,of HBV from a large cohort of HBV-in fected patients[J]. Antivir Ther, 2014, 4(8): 1-8.

    [16] Zhang MS, Ge GH, Yang YL, et al. Decreased an tigen icity p rofiles of imm une-escaped and d rug-resistan t hepatitis B surface antigen (HBsAg) doub le m utan ts[J]. Viro l J, 2013, 10:292.

    [17] Lok AS, Zou lim F, Locarnini S, et al. An tiviral d rug-resistan t HBV:standard ization of nom enclatu re and assays and recomm endations for m anagem ent[J]. Hepatology, 2007, 46(1):254-265.

    [18] Ji D, Liu Y, Xu ZH, et al. Evo lu tion and pheno typ ic analysis of rtL229 po lym erase m utations within the hepatitis B virus genom e[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(6): 544-547. [紀冬, 劉妍, 許智慧, 等. 乙肝病毒多聚酶區(qū)rtL229突變的演變及其表型分析[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2012, 37(6): 544-547.]

    [19] Zeng MD, Mao YM, Yao GB, et al. Five years of treatm ent with adefovir d ip ivoxil in Chinese patien ts with HBeAg-positive ch ron ic hepatitis B[J]. Liver In t, 2012, 32(1): 137-146.

    [20] Yao WM, Liu Y, Si LL, et al. Inh ib ito ry e ffect of herbal concoction Suduxing on hepatitis B virus rep lication in vitro[J].Med J Chin PLA, 2014, 39(2): 121-124. [姚偉明, 劉妍, 思蘭蘭, 等. 新型中藥制劑肅毒星對乙型肝炎病毒體外復制的抑制作用研究[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2014, 39(2): 121-124.]

    猜你喜歡
    病毒學抗病毒變異
    影響乙肝口服抗病毒藥物療效的病毒學因素
    肝博士(2024年1期)2024-03-12 08:37:58
    “病毒學”??匮骶?/a>
    慢性乙型肝炎抗病毒治療是關鍵
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:52
    抗病毒治療可有效降低HCC的發(fā)生及改善患者預后
    肝博士(2021年1期)2021-03-29 02:32:14
    抗病毒藥今天忘吃了,明天要多吃一片嗎?
    肝博士(2020年4期)2020-09-24 09:21:26
    變異危機
    變異
    支部建設(2020年15期)2020-07-08 12:34:32
    對抗病毒之歌
    血清HBsAg水平對恩替卡韋治療HBeAg陽性的慢性乙肝患者病毒學應答的影響
    變異的蚊子
    百科知識(2015年18期)2015-09-10 07:22:44
    自拍偷自拍亚洲精品老妇| 一级片'在线观看视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产日韩欧美视频二区| 99久久精品一区二区三区| 欧美三级亚洲精品| 亚洲伊人久久精品综合| 午夜老司机福利剧场| 亚洲av综合色区一区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久久国产精品麻豆| 国产 一区精品| 91久久精品国产一区二区三区| 在线 av 中文字幕| 精品亚洲成a人片在线观看| 五月开心婷婷网| 91aial.com中文字幕在线观看| av一本久久久久| av女优亚洲男人天堂| 久久久a久久爽久久v久久| 国产男女超爽视频在线观看| 色吧在线观看| 婷婷色综合www| 自线自在国产av| 欧美+日韩+精品| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久青草综合色| 热re99久久精品国产66热6| 国产午夜精品一二区理论片| 这个男人来自地球电影免费观看 | 搡老乐熟女国产| 乱系列少妇在线播放| 国产淫语在线视频| 91久久精品电影网| 少妇的逼好多水| 美女cb高潮喷水在线观看| 又爽又黄a免费视频| 欧美最新免费一区二区三区| 97超视频在线观看视频| 亚洲国产色片| av专区在线播放| 亚洲精品aⅴ在线观看| 777米奇影视久久| 久久国内精品自在自线图片| 男女无遮挡免费网站观看| 国产成人精品久久久久久| 亚州av有码| 高清欧美精品videossex| 国产日韩欧美亚洲二区| 日本黄大片高清| 久久久久视频综合| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 91精品国产九色| 国产精品99久久久久久久久| 少妇人妻 视频| 久久韩国三级中文字幕| 国产高清三级在线| 91久久精品电影网| 国国产精品蜜臀av免费| 性色av一级| 久久亚洲国产成人精品v| 午夜日本视频在线| 国产精品女同一区二区软件| 欧美日韩亚洲高清精品| 色网站视频免费| 99久久精品热视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久毛片免费看一区二区三区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 色吧在线观看| 亚洲四区av| 亚洲第一av免费看| 国产精品国产三级专区第一集| 成人特级av手机在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品国产三级专区第一集| 久久午夜综合久久蜜桃| 成年av动漫网址| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 美女福利国产在线| av在线app专区| 高清视频免费观看一区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 高清不卡的av网站| 久久综合国产亚洲精品| 视频中文字幕在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲精品国产av成人精品| a级毛色黄片| 性色av一级| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 99九九线精品视频在线观看视频| 99久国产av精品国产电影| 国产精品蜜桃在线观看| 久久狼人影院| 久久女婷五月综合色啪小说| 午夜av观看不卡| 国产亚洲欧美精品永久| 日韩一区二区三区影片| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲精品日韩av片在线观看| av在线观看视频网站免费| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 色视频在线一区二区三区| 亚洲av免费高清在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 日本欧美视频一区| 男的添女的下面高潮视频| 在线观看国产h片| 美女视频免费永久观看网站| 色94色欧美一区二区| 成人国产av品久久久| 好男人视频免费观看在线| 涩涩av久久男人的天堂| 免费黄频网站在线观看国产| 国产成人一区二区在线| 日日撸夜夜添| 少妇熟女欧美另类| 老司机影院毛片| 爱豆传媒免费全集在线观看| 乱系列少妇在线播放| 午夜福利,免费看| av福利片在线| 亚洲va在线va天堂va国产| 精品一区二区三卡| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲va在线va天堂va国产| 精品一区二区三卡| 69精品国产乱码久久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品一品国产午夜福利视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 一本大道久久a久久精品| 久久人人爽人人片av| 秋霞伦理黄片| kizo精华| 国产精品久久久久久久久免| 99久久精品一区二区三区| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲伊人久久精品综合| 美女内射精品一级片tv| 99久久人妻综合| 亚洲久久久国产精品| 2022亚洲国产成人精品| av一本久久久久| 免费黄色在线免费观看| 久久狼人影院| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲欧洲日产国产| 国产在视频线精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 伦精品一区二区三区| 国产精品久久久久久久电影| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久久午夜欧美精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 观看免费一级毛片| 亚洲精品日韩av片在线观看| 丝袜脚勾引网站| 国产又色又爽无遮挡免| 极品人妻少妇av视频| 国产 精品1| 免费看光身美女| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 男女边吃奶边做爰视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 一区二区三区精品91| 99久久综合免费| 夜夜爽夜夜爽视频| 精品久久久久久久久亚洲| 一区二区三区乱码不卡18| 国产av一区二区精品久久| 亚洲精品,欧美精品| videossex国产| 两个人免费观看高清视频 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 97在线人人人人妻| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产男女超爽视频在线观看| 中国国产av一级| 久久久久精品性色| 久久av网站| www.色视频.com| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美日韩综合久久久久久| 午夜久久久在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产永久视频网站| 国模一区二区三区四区视频| 国产毛片在线视频| 有码 亚洲区| 欧美日韩亚洲高清精品| 婷婷色麻豆天堂久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 黄色欧美视频在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 老司机亚洲免费影院| 亚洲性久久影院| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久人人爽人人片av| 久久国产精品大桥未久av | 女人久久www免费人成看片| 亚洲av福利一区| 免费看日本二区| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲国产精品成人久久小说| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| av视频免费观看在线观看| 久久久久久久精品精品| 毛片一级片免费看久久久久| 人妻少妇偷人精品九色| 丝袜喷水一区| 精品酒店卫生间| 国产真实伦视频高清在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| a级一级毛片免费在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 国产精品三级大全| 下体分泌物呈黄色| h视频一区二区三区| 精品人妻偷拍中文字幕| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品一区www在线观看| 人妻 亚洲 视频| 久久热精品热| 黑人猛操日本美女一级片| 久久精品国产亚洲网站| 国产伦在线观看视频一区| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 午夜精品国产一区二区电影| 久久久久久久久久久免费av| 精品国产一区二区久久| 一区二区三区免费毛片| 亚洲图色成人| 免费观看a级毛片全部| 国产淫片久久久久久久久| 女性生殖器流出的白浆| 一级毛片久久久久久久久女| av专区在线播放| 国产一区二区在线观看av| 青春草国产在线视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 视频中文字幕在线观看| 少妇的逼水好多| 亚洲欧洲国产日韩| 国产一级毛片在线| 只有这里有精品99| 日韩 亚洲 欧美在线| 黑丝袜美女国产一区| 青青草视频在线视频观看| 成人美女网站在线观看视频| 精品一区二区免费观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 人人妻人人澡人人看| 一级黄片播放器| 国产有黄有色有爽视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 少妇的逼水好多| 亚州av有码| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲精品视频女| 一本大道久久a久久精品| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 青青草视频在线视频观看| 精品一品国产午夜福利视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 亚洲欧洲日产国产| 精品一区二区三卡| 日日撸夜夜添| 久久精品国产a三级三级三级| 国产精品成人在线| 国模一区二区三区四区视频| 国产免费又黄又爽又色| 久久久久国产精品人妻一区二区| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美激情国产日韩精品一区| 在线观看免费日韩欧美大片 | av一本久久久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 日韩精品有码人妻一区| 欧美日韩亚洲高清精品| 五月伊人婷婷丁香| 久热久热在线精品观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲精品日本国产第一区| 国产黄片美女视频| 中文字幕av电影在线播放| a级片在线免费高清观看视频| 大码成人一级视频| av在线老鸭窝| 爱豆传媒免费全集在线观看| 伊人久久国产一区二区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 18禁动态无遮挡网站| 一区二区三区精品91| 水蜜桃什么品种好| 国产永久视频网站| 黄色视频在线播放观看不卡| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产 一区精品| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产成人aa在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产国拍精品亚洲av在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 最新中文字幕久久久久| 久久久久久久国产电影| 视频区图区小说| 亚洲精品456在线播放app| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲国产色片| 中文天堂在线官网| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产成人精品无人区| 国产在视频线精品| 欧美三级亚洲精品| 一本一本综合久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产一区二区三区综合在线观看 | 少妇的逼好多水| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久久久久久国产电影| 亚洲欧洲国产日韩| 久久久久久久久久久丰满| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 水蜜桃什么品种好| 韩国高清视频一区二区三区| 九九在线视频观看精品| 高清欧美精品videossex| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 美女内射精品一级片tv| 国产av精品麻豆| av国产久精品久网站免费入址| 久久久久久久久久久免费av| 一级毛片电影观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 在线观看三级黄色| 三级国产精品片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 777米奇影视久久| 国产精品蜜桃在线观看| 色94色欧美一区二区| 日韩伦理黄色片| 日本爱情动作片www.在线观看| 免费看日本二区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美日韩亚洲高清精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久人人爽av亚洲精品天堂| tube8黄色片| 久久国产乱子免费精品| 我要看黄色一级片免费的| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产亚洲91精品色在线| 国产一级毛片在线| 成人毛片60女人毛片免费| 久久 成人 亚洲| 日韩电影二区| 视频区图区小说| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 最近中文字幕2019免费版| 观看美女的网站| 日韩电影二区| 日本vs欧美在线观看视频 | 日韩av在线免费看完整版不卡| 黄色视频在线播放观看不卡| 2022亚洲国产成人精品| 国产精品伦人一区二区| 99热国产这里只有精品6| 自线自在国产av| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲伊人久久精品综合| 国产一区有黄有色的免费视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 丁香六月天网| 久久久国产一区二区| 午夜免费观看性视频| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲av成人精品一区久久| 日韩中字成人| 亚洲av不卡在线观看| 少妇人妻 视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲国产欧美在线一区| 久久毛片免费看一区二区三区| 我要看日韩黄色一级片| 黄色一级大片看看| 能在线免费看毛片的网站| 亚洲电影在线观看av| 五月天丁香电影| a级毛片在线看网站| 麻豆乱淫一区二区| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲国产精品国产精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久久精品免费免费高清| 男女国产视频网站| 色5月婷婷丁香| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久久久久久久久人人人人人人| 日韩亚洲欧美综合| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 免费看av在线观看网站| 少妇人妻 视频| 久久久国产欧美日韩av| 国国产精品蜜臀av免费| 国产探花极品一区二区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 免费观看在线日韩| 免费黄色在线免费观看| 婷婷色综合大香蕉| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产男人的电影天堂91| 熟女av电影| 一区二区三区四区激情视频| 欧美区成人在线视频| 久久久久网色| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 中文字幕制服av| 女人精品久久久久毛片| 人妻 亚洲 视频| 一级毛片久久久久久久久女| 免费av不卡在线播放| 亚洲四区av| 日韩av在线免费看完整版不卡| 啦啦啦啦在线视频资源| 少妇人妻久久综合中文| 精品一区二区三卡| 99精国产麻豆久久婷婷| 成年人午夜在线观看视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲成人一二三区av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 老女人水多毛片| 夫妻午夜视频| 亚洲久久久国产精品| 亚洲高清免费不卡视频| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品一二三区在线看| 亚洲美女黄色视频免费看| 高清毛片免费看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 大香蕉久久网| 五月天丁香电影| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 少妇人妻久久综合中文| 久久久精品免费免费高清| 黄色怎么调成土黄色| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产 精品1| 久久国产乱子免费精品| 观看免费一级毛片| 99久久中文字幕三级久久日本| 中文字幕制服av| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 高清不卡的av网站| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 久久久久网色| 免费观看av网站的网址| 亚洲色图综合在线观看| 婷婷色综合www| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲精品久久午夜乱码| kizo精华| 国产精品三级大全| 丝袜在线中文字幕| 在线看a的网站| 能在线免费看毛片的网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲色图综合在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 少妇人妻 视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久99一区二区三区| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲三级黄色毛片| 最近中文字幕高清免费大全6| 高清午夜精品一区二区三区| 少妇人妻精品综合一区二区| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲三级黄色毛片| 久久97久久精品| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美3d第一页| 97超视频在线观看视频| 国产成人一区二区在线| 一本大道久久a久久精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产深夜福利视频在线观看| 国国产精品蜜臀av免费| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久狼人影院| 中文字幕av电影在线播放| 在线看a的网站| 免费看日本二区| 日韩三级伦理在线观看| 99国产精品免费福利视频| 高清欧美精品videossex| 久久久午夜欧美精品| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久久精品94久久精品| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲人与动物交配视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 成年女人在线观看亚洲视频| 高清不卡的av网站| av网站免费在线观看视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产成人精品福利久久| 乱系列少妇在线播放| 久久久久精品久久久久真实原创| 日韩一区二区视频免费看| 高清不卡的av网站| 久久免费观看电影| 亚洲国产精品国产精品| 中国国产av一级| 熟女电影av网| 免费看av在线观看网站| 亚洲国产欧美在线一区| www.av在线官网国产| 欧美日韩av久久| 五月伊人婷婷丁香| 一级毛片aaaaaa免费看小| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产成人精品无人区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美精品国产亚洲| 大香蕉久久网| 国产片特级美女逼逼视频| 日韩伦理黄色片| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 中文天堂在线官网| 亚洲图色成人| 亚洲国产精品一区三区| 日本-黄色视频高清免费观看| 韩国高清视频一区二区三区| freevideosex欧美| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 秋霞在线观看毛片| 一级,二级,三级黄色视频| 日本黄色片子视频| 街头女战士在线观看网站| 超碰97精品在线观看| 69精品国产乱码久久久| 蜜桃久久精品国产亚洲av| www.色视频.com| 久久久国产欧美日韩av| 日韩大片免费观看网站| 国产高清三级在线| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美97在线视频| 97在线视频观看| 国产毛片在线视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产男女超爽视频在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 22中文网久久字幕| 丰满饥渴人妻一区二区三| 日韩精品有码人妻一区| 久久久国产欧美日韩av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 五月伊人婷婷丁香| 中文在线观看免费www的网站| 日韩av免费高清视频| 伦理电影大哥的女人| 人妻系列 视频| 97超视频在线观看视频| 看免费成人av毛片| 久久人人爽人人片av| 大码成人一级视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 2018国产大陆天天弄谢| 色网站视频免费| 香蕉精品网在线| 久久久精品94久久精品| 亚洲电影在线观看av| 久久久久久人妻| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 自线自在国产av| 欧美日韩视频高清一区二区三区二|