葉曉玲,劉妍,陳容娟,許智慧,李曉東,葉海燕,唐振祥,程書權,徐東平
核苷(酸)類似物(NAs)具有強效抑制乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)、改善肝臟功能、延緩肝臟疾病進展以及口服方便、副反應小等特點,已廣泛應用于慢性乙肝(chronic hepatitis B,CHB)的治療,然而長期用藥引起的耐藥問題為臨床乙肝防治帶來了新的挑戰(zhàn)。阿德福韋酯(ADV)是第一種應用于臨床的核苷酸類藥物,因其對HBV野生株和核苷類藥物拉米夫定(LAM)耐藥株均有較強的抗病毒作用而被廣泛用于臨床CHB患者的治療,但長期應用仍具有較高的耐藥率(5年耐藥率為29%)。經(jīng)典的ADV耐藥變異為HBV反轉錄酶(RT)區(qū)rtN236T和rtA181V變異[1-2]。近年有研究報道HBV rtI233V位點變異可引起ADV耐藥,但也有報道該變異仍對ADV敏感[3-9]。本研究從臨床大樣本患者入手,分析rt I233V變異的發(fā)生頻率,并重點分析其中2例慢性HBV患者rtI233V變異的演變過程,總結變異株與野生株的表型耐藥特點,明確rtI233V位點變異的病毒學特點及其臨床意義。
1.1 研究對象 2010年7月-2013年8月解放軍302醫(yī)院收治的慢性HBV感染者9830例,均接受不同的NAs治療。診斷標準符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[10],常規(guī)檢查項目由解放軍302醫(yī)院臨床檢驗中心完成,無重疊或混合感染,血清凍存于–20℃。
1.2 主要試劑 病毒DNA-OUT提取試劑盒(北京天恩澤公司),pGEM-Teasy載體(Prom ega公司,美國),XbaⅠ/SphⅠ內(nèi)切酶及T4DNA連接酶(TaKaRa公司,日本),p TriEx-HBV(C)1.1倍載體(法國里昂大學Zou lim教授惠贈),X-trem eGENE HD 轉染試劑(Roche公司,德國),胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(Gib co公司,美國),熒光定量PCR試劑盒(上海復星公司)。引物合成和克隆測序均由北京天一輝遠公司完成。
1.3 方法
1.3.1 HBV RT區(qū)基因耐藥變異與基因型分析 采用病毒DNA-OUT試劑提取患者血清HBV DNA,HBV RT區(qū)基因擴增采用本室建立的單管巢式PCR方法[11],對PCR產(chǎn)物進行DNA雙向測序,并對rt80、rt84、rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt233、rt236和rt250等耐藥相關位點的序列峰圖進行分析。用Mega 4軟件進行HBV基因分型[12]。
1.3.2 HBV RT區(qū)TA基因克隆 將擴增后的PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-Teasy載體中,轉化JM 109感受態(tài)細胞,挑選至少20個經(jīng)PCR鑒定陽性的樣品送測序并分析耐藥變異。
1.3.3 p TriEx-HBV 1.1倍重組載體的構建及鑒定分別提取含相關變異類型(rtI233V、rtN236T及rtI233V+rtN236T)和野生型克隆的質(zhì)粒,將其RT區(qū)片段經(jīng)XbaⅠ和SphⅠ雙酶切后定向克隆至經(jīng)同樣酶切后的p TriEx-HBV(C)1.1倍表達載體上,連接產(chǎn)物轉化JM 109感受態(tài)細胞,接種至LB固態(tài)瓊脂板(含100g/m l氨芐青霉素),37℃溫箱培養(yǎng)過夜。隨機挑取克隆測序,對重組質(zhì)粒進行鑒定,確定HBV表達載體構建成功。
1.3.4 細胞轉染及表型耐藥分析 將HepG2細胞接種于24孔板(10萬/孔),18h后每孔轉染0.25μg質(zhì)粒;5h后,細胞用1×PBS洗2次,分別加入含倍增濃度藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)(LAM:0、0.01、0.1、1、10、100μm o l/L;ADV:0、3.125、6.25、12.5、25、50μm o l/L;ETV:0、0.001、0.01、0.1、1、10μm o l/L;TDF:0、0.78、3.125、12.5、50、200μm o l/L),隔天換藥。4d后收集細胞培養(yǎng)上清,用DNase消化游離DNA,37℃過夜;75℃ 10m in滅活DNase,裂解釋放Dane顆粒中的DNA。采用實時熒光定量PCR法檢測上清中的HBV DNA載量,計算藥物半數(shù)有效濃度(EC50)及耐藥倍數(shù)[即變異株與野生株EC50的比值(Fo ld)]。
1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 18.0軟件分析數(shù)據(jù)。連續(xù)變量以±s表示,組間差異的比較根據(jù)分組分別采用t檢驗和方差分析,P<0.05(雙側)為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 臨床樣本資料和rtI233V變異檢出分析 應用PCR產(chǎn)物直接測序法從9830例慢性乙肝患者血清樣本中共檢出rtI233V變異28例,檢出率0.28%;檢出經(jīng)典ADV耐藥變異rtA181V和(或)rtN236T 653例,檢出率6.64%。進一步分析rtI233V變異類型,其中單獨變異19例,與其他變異聯(lián)合出現(xiàn)9例。28例患者中男24例,女4例,年齡34.8±12.9歲,HBV DNA載量4.6±1.5 LogU/m l,ALT 48.8±33.3U/L。檢出該變異的患者均有ADV治療史,其中16例(57.1%)接受ADV單藥治療6個月以上,其余12例(42.9%)接受包括ADV的多藥序貫聯(lián)合治療1年以上。HBV基因型分析顯示8例為B基因型,20例為C基因型。
2.2 兩例患者rtI233V變異的臨床演變 回顧性分析2例HBeAg陰性慢性乙肝患者rtI233V變異的臨床演變。
患者1,男,36歲。治療基線(S1)時僅檢測到野生型病毒株,HBV DNA載量和ALT分別為5.4 Log U/m l和53U/L。首次經(jīng)ADV單一抗病毒治療1個月后未檢測到HBV DNA,實現(xiàn)了快速病毒學應答,16個月后出現(xiàn)病毒學突破,血清HBV DNA載量升至3.12LogU/m l,繼續(xù)服用ADV 1個月后,血清HBV DNA載量為2.8LogU/m l,ALT正常,HBV RT區(qū)克隆檢出rt I233V變異(S2),該變異株占病毒準種池的6.25%。繼續(xù)服用ADV治療至45個月(S3)時,HBV DNA為3.68LogU/m l,ALT正常。此時克隆測序顯示rtI233V變異株占25.0%,rtN236T變異株占62.5%,rtI233V+rtN236T變異株占6.25%,因服用ADV抑制病毒效果欠佳,換用ETV繼續(xù)抗病毒治療,HBV DNA一直處于最低檢測下限(圖1A、1B)。
圖1 患者1的臨床抗病毒治療應答、病毒學演變及體外復制力評價Fig.1 Clinical virological and biochem ical response in patient 1 during antiviral therapy (A), dynam ic evo lutions of rtI233V m utation by clonal sequencing (B) and the in vitro assessm ent of HBV natural rep lication com petence of various viral stains (C)w t. Wild type; (1)P<0.05 com pared with rtN236T m u tan t
患者2,男,49歲。治療基線(S4)時僅檢測到野生型病毒株,HBV DNA載量和ALT分別為4.57 LogU/m l和66U/L,經(jīng)ADV單一抗病毒治療3個月(S5)后,HBV DNA升至5.54LogU/m l,ALT恢復正常;HBV RT區(qū)克隆檢出rtI233V變異,占病毒準種池的26.7%,換用聚乙二醇干擾素治療5個月后,HBV DNA下降仍不理想,ALT波動,最高升至118U/L。繼續(xù)ADV抗病毒治療4個月(S6)后,HBV DNA升至5.9LogU/m l,HBV RT區(qū)克隆顯示rtI233V變異占病毒準種池的86.4%,換用ETV后病毒逐漸降至最低檢測下限,ALT維持正常水平(圖2A、2B)。
圖2 患者2的臨床抗病毒治療應答、病毒學演變及體外復制力評價Fig.2 Clinical virological and biochem ical response in patient 2 during antiviral therapy (A), dynam ic evolutions of rtI233V mutation by clonal sequencing (B) and the in vitro assessment of HBV natural rep lication com petence of various viral stains (C)w t. W ild type
2.3 病毒體外復制力測定 分別將患者1的野生株和變異株(rtI233V、rtN236T、rtI233V+rtN236T)的重組載體質(zhì)粒及患者2的野生株和rtI233V變異株的重組載體質(zhì)粒瞬時轉染Hep G2細胞,4d后測定細胞上清中HBV DNA載量即為病毒體外復制力,取3次獨立實驗的平均值(圖1C、圖2C),結果顯示rtN236T單獨變異株的復制力(5.38±0.31LogU/m l)低于野生株(6.20±0.1LogU/m l),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而rtI233V+rtN236T變異株的復制力為6.27±0.28LogU/m l,顯著增加了由于rtN236T變異而受損的病毒復制力(P<0.05)。患者2的野生株病毒復制力(6.67±0.10LogU/m l)與rtI233V變異株病毒復制力(6.82±0.08 LogU/m l)比較差異無統(tǒng)計學意義。2.4 變異株的表型耐藥分析 從2例患者分離的野生株和單獨rt I233V變異株對ADV均敏感,而rtN236T和rtI233V+rtN236T變異株對ADV均顯示不同程度的耐藥,耐藥倍數(shù)分別為6.82和5.28;此外,野生株與rtI233V、rtN236T、rtI233V+rtN236T變異株對LAM、ETV及TDF均敏感(表1)。
表1 患者1與患者2各變異類型的耐藥表型分析Tab.1 Pheno typ ic assay of m u tan ts and w ild-type strain of the tw o patien ts
目前NAs是臨床最常用的抗HBV藥物[13],其作用靶點均為HBV RT區(qū),對HBV cccDNA并沒有直接抑制作用,因此需要長期服用。長期應用NAs會導致對環(huán)境壓力適應力強的變異病毒株獲得適應性突變和選擇性擴增,或使已存在于準種池中的極少量變異株獲得選擇性擴增,使耐藥病毒逐漸成為優(yōu)勢種群,導致病毒學和生化學突破,最終導致病情惡化。ADV是繼LAM之后第二種應用于臨床的NAs類藥物,可明顯抑制HBV DNA的復制,促進乙肝患者血清轉氨酶正常化,促進肝臟組織學改善,且價格適中,適用于慢性乙肝患者和對LAM耐藥的患者,但長期應用后的耐藥也是患者在抗病毒治療過程中難以避免的問題。
rtN236T變異與rtA181V變異是經(jīng)典的ADV耐藥變異形式[1],rtI233變異位點與rtN 236變異位點相距3個堿基,是否同樣可導致ADV耐藥引起了學者們的廣泛關注。rt I233V位點變異最早見于德國學者的報道,Schildgen等[3]于2006年首次經(jīng)體外實驗證實了rt I233V變異會引起ADV原發(fā)耐藥,EC50是野生株的6~10倍;而同一課題組的Geipel等[6]于2014年的研究卻發(fā)現(xiàn),rtI233V變異并不會影響病毒對ADV的敏感性。Ism ail等[7]通過蛋白質(zhì)空間結構的同源模建和分子對接方法,闡明rt I233V變異不會影響蛋白質(zhì)的催化位點,認為rt I233V變異不會影響ADV的抗病毒作用。Ahn等[8]提出rtI233V變異會影響病毒復制力,并引起ADV耐藥。鄧俊等[9]通過定點突變及Sou thern b lo tting等實驗技術證實rtI233V變異能導致HBV對ADV輕度耐藥。可見,關于rtI233V變異與ADV耐藥的相關性仍存較大爭議。
為了進一步闡明rtI233V變異與ADV的相關性,本研究通過對大樣本慢性HBV感染者的測序分析,從9830例患者樣本中檢出28例rtI233V位點變異(單獨出現(xiàn)或與其他耐藥變異共同存在),對其中2例服用ADV后發(fā)生病毒學突破或原發(fā)性無應答的典型病例進行隨訪分析,病毒復制力檢測結果表明,rtI233V變異株的體外復制力與野生株相當,而常見的耐藥相關變異株的病毒復制力比野生株低[14-15],這與機體免疫系統(tǒng)或藥物的選擇壓力有關[16]。本研究結果顯示rtI233V變異僅在有ADV用藥史的患者樣本中檢出,且病毒準種池中的rtI233V變異隨著ADV用藥時間的延長而增加,說明該變異與ADV用藥有關。
本研究還運用體外表型耐藥分析明確了rtI233V位點變異對4種NAs耐藥的影響,ADV表型耐藥結果顯示rtI233V、rtN236T和rtI233V+rtN236T變異株的EC50分別是野生株的1.57、6.82和5.28倍。臨床通常將抗病毒藥物的耐藥分為3個級別:耐藥倍數(shù)2~9倍為輕度耐藥,10~99倍為中度耐藥,大于100倍為高度耐藥。但是由于受到藥物臨床實際暴露量、在體內(nèi)代謝變化等因素的影響,不同藥物引起臨床耐藥需要的藥物敏感性下降程度(即EC50增加值)有很大差別,通常認為引起ADV耐藥變異EC50與野生毒株相比需增加2.5倍以上,引起ETV和TDF耐藥變異EC50需增加10倍以上,引起LAM耐藥變異EC50需增加100倍以上[17]。本研究結果顯示,無論是rtI233V單獨變異(與野生株相比)還是與rtN236T聯(lián)合變異(與rtN236T耐藥株相比)對ADV的影響均不到2.5倍,說明rtI233V不是ADV原發(fā)耐藥變異。但rtI233V變異可以增加rtN236T變異株受損的病毒復制力,因而該變異符合ADV耐藥相關的復制力補償變異的特點,與本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)的LAM相關的復制力補償變異rtL229F變異類似[18]。
本研究結果表明,rt I233V位點變異對LAM、ETV、TDF 3種藥物均敏感。2例患者換用ETV補救抗病毒治療后,病毒載量降至最低檢測下限,說明ADV治療失敗后換用與其無交叉耐藥位點的ETV治療有效,與相關文獻報道一致[19-20]。
總之,本研究首次通過臨床大樣本對rt I233V變異頻率、演變規(guī)律、體外復制力及表型耐藥進行分析,發(fā)現(xiàn)rt I233V變異與ADV用藥療效不佳有關,是一種ADV耐藥相關復制力補償變異,臨床換用ETV繼續(xù)治療可獲得持續(xù)病毒學和生化學應答。本研究結果對深入了解ADV相關耐藥變異的臨床特點、優(yōu)化抗HBV治療方案具有重要意義。
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