隱匿性乙型肝炎病毒感染患者S基因突變特點(diǎn)分析

陳建宏，劉妍，許智慧，思蘭蘭，戴久增，李奇，王帥，李進(jìn)，韓聚強(qiáng)，徐東平

論 著

隱匿性乙型肝炎病毒感染患者S基因突變特點(diǎn)分析

陳建宏，劉妍，許智慧，思蘭蘭，戴久增，李奇，王帥，李進(jìn)，韓聚強(qiáng)，徐東平

目的 分析1例血清HBV DNA長(zhǎng)期陽(yáng)性但HBsAg陰性的隱匿性乙型肝類病毒感染(OBI)患者HBV S基因突變特點(diǎn)，揭示S基因突變與OBI發(fā)生及肝臟疾病進(jìn)展的關(guān)系。方法 收集該患者不同時(shí)間點(diǎn)的4份血清樣本，擴(kuò)增HBV S基因并進(jìn)行克隆測(cè)序，挑選代表性突變株病毒基因構(gòu)建重組載體并進(jìn)行表型分析。結(jié)果 從該患者4份血清樣本中檢出多種S基因突變形式，包括前S1區(qū)大片段缺失、s126–127“RPCMNCTI”插入突變、sQ129N、s131–133 TSM→NST和經(jīng)典的sG145R突變等，其中s131–133 TSM→NST在前后4份動(dòng)態(tài)樣本的檢測(cè)病毒克隆中所占比例分別為0%、26%、59%和74%；前S1區(qū)大片段缺失在4份樣本檢測(cè)病毒克隆中始終存在，所占比例分別為26%、17%、15%和21%。表型分析發(fā)現(xiàn)，sQ129N和s131–133 TSM→NST可以降低抗體對(duì)HBsAg的親和力，增加病毒分泌；與野生株相比，前S1區(qū)大片段(nt 3046–3177)缺失病毒株復(fù)制力下降了43.7%，表面抗原啟動(dòng)子Ⅱ(SPⅡ)活性下降了97.2%；sG145R可降低病毒的分泌能力。結(jié)論 此例HBV感染患者的長(zhǎng)期OBI臨床表現(xiàn)是由于其感染有多種S基因突變病毒株引起，其中一些S基因突變可以影響病毒的表型特點(diǎn)，可能與肝臟疾病進(jìn)展密切相關(guān)。

肝炎病毒，乙型；突變；肝炎表面抗原，乙型

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為HBsAg轉(zhuǎn)陰和抗-HBs抗體的出現(xiàn)是HBV完全清除的標(biāo)志，自20世紀(jì)70年代以來(lái)，隨著病毒檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，特別是PCR技術(shù)的不斷成熟，不斷有研究發(fā)現(xiàn)在HBsAg陰性者的血清或肝組織中仍可檢測(cè)到HBV DNA的存在[1-2]，這種狀態(tài)被稱為隱匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)。有研究認(rèn)為OBI的發(fā)生與宿主免疫功能低下和HBV極低水平復(fù)制和表達(dá)有關(guān)[3-5]，也有研究認(rèn)為其與HBV S基因突變有關(guān)[6-7]。過(guò)去一些OBI病例的出現(xiàn)是由于檢測(cè)方法的靈敏性不夠引起的[8]，包括HBsAg檢測(cè)下限較低以及不能檢出sG145R等經(jīng)典突變型HBsAg。近年隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，臨床上OBI越來(lái)越少見(jiàn)。本研究縱向觀察1例OBI患者疾病進(jìn)展過(guò)程中的4份血清樣本，以期闡明HBV S基因突變與OBI發(fā)生及肝臟疾病進(jìn)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 男，63歲，2002年體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)血清HBsAg陽(yáng)性，血清HBV DNA數(shù)值不詳，因無(wú)癥狀而未接受任何治療。2011年開始出現(xiàn)乏力伴納差，無(wú)發(fā)熱、咳嗽、咳痰，仍未重視。2012年5月因低熱、納差就醫(yī)，檢查顯示血清HBsAg陰性，HBV DNA 5.23×104拷貝/ml。隨后服用阿德福韋酯(ADV)，但并未控制疾病進(jìn)展，最后因肝功能衰竭死亡。采集該患者4次住院期間血清，–40℃凍存。樣本信息如表1所示。4份血清中HBsAg的檢測(cè)值均為陰性(化學(xué)發(fā)光法HBsAg<1.0U/ml)，但血清中HBV DNA均為陽(yáng)性，且病毒載量隨病程進(jìn)展而逐漸升高。

表1 OBI患者4份血清的臨床檢測(cè)指標(biāo)Tab.1 Clinical parameters of four serums in one patient with OBI

1.2 主要試劑 病毒DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天恩澤公司；膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司；pGEM-Teasy載體、JM109感受態(tài)細(xì)胞、熒光素酶表達(dá)載體和檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；pTriEx-1.1HBV表達(dá)載體由法國(guó)里昂大學(xué)Zoulim教授惠贈(zèng)；BstEⅡ、SphⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、BglⅡ購(gòu)自日本TaKaRa公司；BspQⅠ和ScaⅠ購(gòu)自美國(guó)NEB公司；真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(-)/myc-His A購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HD、地高辛標(biāo)記檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司；實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海復(fù)興公司；尼龍膜購(gòu)自美國(guó)安瑪西亞公司；HBsAg鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司；His標(biāo)簽蛋白鼠單克隆抗體、β-actin抗體及二抗購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司。引物合成和基因測(cè)序由北京天一輝遠(yuǎn)公司完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 巢氏PCR擴(kuò)增HBV S基因及克隆測(cè)序 采用病毒DNA提取試劑盒提取4份血清HBV DNA，采用巢式PCR方法擴(kuò)增HBV S基因(前S1+前S2+S)。第一輪上下游引物分別為PSup3，SB1R；第二輪上下游引物為PSup4，SB2R(表2)。將PCR產(chǎn)物純化、膠回收后與pGEM-Teasy載體連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。采用Mega 4進(jìn)化樹軟件對(duì)克隆測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.2 HBV S基因突變相關(guān)載體構(gòu)建 采用Mega 4軟件分析HBV基因型，挑選標(biāo)準(zhǔn)序列用NTI軟件比對(duì)分析S基因突變，挑取代表性突變克隆和野生型克隆構(gòu)建相關(guān)載體以進(jìn)行功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.1 pTriEx-1.1HBV重組載體構(gòu)建 提取野生型和突變型克隆T-easy質(zhì)粒，用BstEⅡ和SphⅠ分別雙酶切質(zhì)粒和pTriEx-1.1HBV載體，將S基因替代到pTriEx-1.1HBV載體上，然后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。鑒定成功后提取轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒備用。

1.3.2.2 pcDNA3.1(-)/myc-His A重組載體構(gòu)建 以提取的野生型和突變型T-easy質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增HBsAg編碼區(qū)S區(qū)，所用引物為HIS-UP(上游引物)，其中包含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；HIS-DOWN(下游引物)，其中包含KpnⅠ酶切位點(diǎn)(表2)。將PCR產(chǎn)物純化膠回收，用EcoRⅠ和KpnⅠ同時(shí)雙酶切膠回收產(chǎn)物和載體，連接并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，抽提質(zhì)粒測(cè)序鑒定，鑒定成功后提取轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒備用。

表2 PCR擴(kuò)增所用引物Tab.2 PCR amplification primers

1.3.2.3 HBV pGL3-SPⅡ熒光素酶表達(dá)載體構(gòu)建因前S1大片段缺失與HBV SPⅡ啟動(dòng)子區(qū)域重疊，而SPⅡ啟動(dòng)子啟動(dòng)2.1kb mRNA，編碼中、主蛋白，因此構(gòu)建HBV pGL3-SPⅡ熒光素酶表達(dá)載體檢測(cè)缺失株對(duì)SPⅡ啟動(dòng)子活性的影響。采用重組PCR方法獲得野生型SPⅡ?qū)φ?。以缺失株的T-easy質(zhì)粒為模板，以P1up，P1down為上下游引物，擴(kuò)增獲得P1段；以野生株的T-easy質(zhì)粒為模板，以P2up，P2down為上下游引物擴(kuò)增獲得P2段；用P1、P2作為模板，分別以P1up和P2down為上下游引物擴(kuò)增獲得野生型的SPⅡ?qū)φ?；以缺失株的T-easy質(zhì)粒為模板，以P1up和P2down為上下游引物擴(kuò)增獲得缺失性的SPⅡ(表2)。將重組PCR獲得的SPⅡ野生型、缺失型和pGL3-Basic載體分別用KpnⅠ和BglⅡ雙酶切，膠回收后連接并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌落，測(cè)序鑒定，測(cè)序成功后提取轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒備用。

1.3.3 上清HBsAg定量檢測(cè) 將HepG2細(xì)胞在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)至最佳狀態(tài)，細(xì)胞以4×105/孔分到6孔板，于分板后16～18h用X-tremeGENE HD轉(zhuǎn)染試劑將pTriEx-1.1HBV重組載體按1μg/孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染，3d后收集上清進(jìn)行HBsAg定量檢測(cè)(羅氏cobas E601)。

1.3.4 熒光定量及Dot blotting分析上清HBV和細(xì)胞內(nèi)核心顆粒 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染同上，3d后收集上清，DNA酶消化過(guò)夜，用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)HBV載量[9-10]。核心顆粒的提取方法參考文獻(xiàn)[11]，–40℃儲(chǔ)存用于實(shí)時(shí)熒光PCR定量和Dot blotting檢測(cè)。Dot blotting分析：采用BspQⅠ和ScaⅠ雙酶切本課題組以前得到的C2基因型全長(zhǎng)克隆，膠回收全長(zhǎng)DNA片段，用于地高辛標(biāo)記探針的制備。取3μl核心顆粒點(diǎn)到尼龍膜上，紫外交聯(lián)5min，用DIG Easy Hyb 42℃預(yù)雜交1h后用含地高辛標(biāo)記探針的DIG Easy Hyb 42℃雜交過(guò)夜，洗膜，封閉，與anti-Digoxigenin-AP Fab孵育，用CSPD化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3.5 Western blotting分析細(xì)胞內(nèi)重組HBsAg的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方式同上，將pcDNA3.1(-)/ myc-His A重組載體按2μg/孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染，3d后用1×PBS洗板2次，加入細(xì)胞裂解液(按100:1的比例加入蛋白酶抑制劑混合物)，收集蛋白，煮沸10min充分變性，以β-actin為內(nèi)參調(diào)整蛋白上樣量，用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后分別以anti-HBsAg和anti-His鼠單克隆抗體為一抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜后以帶有HRP的羊抗鼠單克隆抗體為二抗室溫孵育2h，用Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯色分析。

1.3.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)前S1大片段缺失突變對(duì)SPⅡ啟動(dòng)子活性的影響 細(xì)胞培養(yǎng)同上，將細(xì)胞以3×105/孔分到24孔板，于分板后16～18h將HBV pGL3-SPⅡ熒光素酶表達(dá)載體與內(nèi)參pRL-TK載體按30:1的比例共轉(zhuǎn)染，表達(dá)載體0.3μg/孔，內(nèi)參0.01μg/孔，設(shè)置pGL3-Basic為陰性對(duì)照，pGL3-Control為陽(yáng)性對(duì)照，48h后裂解細(xì)胞，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)，并用內(nèi)參校正，分析前S1區(qū)大片段缺失對(duì)啟動(dòng)子活性的影響。

2 結(jié) 果

2.1 4份血清克隆測(cè)序結(jié)果分析 測(cè)序分析結(jié)果顯示，絕大多數(shù)序列為Y18856C2基因型，以該序列為標(biāo)準(zhǔn)序列用NTI軟件進(jìn)行比對(duì)分析。4份血清96個(gè)克隆中僅1株為野生序列(WT)，其余全部存在S基因突變，主要位于MHR，特別是a決定簇內(nèi)(表3)。其中前S1區(qū)大片段缺失株在4份血清中始終穩(wěn)定存在，所占比例分別為26%、17%、15%、21%，M2隨著病情的加重所占比例越來(lái)越大，分別為0%、26%、59%、74%。

2.2 上清HBsAg定量 HBsAg定量檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。與野生株相比，M1–M5的上清HBsAg定量值分別下降了84.1%、85.6%、51.2%、83.4%、98.3%(P<0.05)。

表3 OBI患者4份血清S基因突變形式Tab.3 S gene mutations of four serums in patient with OBI

圖1 上清HBsAg定量(羅氏cobas E601)Fig.1 Quantitation of supernatant secreted HBsAg(Roch cobas E601)

2.3 細(xì)胞內(nèi)重組HBsAg表達(dá) Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，M1、M2可以降低HBsAg與抗體的親和力，尤其是M2突變株表達(dá)的HBsAg幾乎無(wú)法被其抗體結(jié)合，M3、M4對(duì)HBsAg和抗體親和力的影響不明顯(圖2)。

圖2 重組表達(dá)載體胞內(nèi)HBsAg表達(dá)的Western blotting分析Fig.2 Western blotting analysis of intracellular recombinant HBsAg expression

2.4 上清HBV定量和復(fù)制力檢測(cè) 胞內(nèi)HBV定量結(jié)果顯示，M5的復(fù)制力與野生株相比下降了43.7%(P<0.05)，其他幾種突變形式對(duì)病毒的復(fù)制力無(wú)明顯影響(圖3A、B)。上清中HBV定量結(jié)果顯示，與野生株相比M2、M3上清中HBV載量分別升高了53.4%和60.7%，M4、M5分別下降了41.9%和33.5%，M3幾乎無(wú)變化(圖3C)。

圖3 核心顆粒HBV及培養(yǎng)上清HBV的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)及Dot blotting分析Fig.3 Real-time PCR detection and dot blotting of core particles and supernatant HBV

2.5 前S1大片段缺失突變對(duì)SPⅡ啟動(dòng)子活性的影響 結(jié)果顯示，野生株表達(dá)的相對(duì)熒光素酶活性倍數(shù)(螢火蟲熒光素酶與內(nèi)參表達(dá)的海腎熒光素酶比值)為26.69±1.33，nt 3046–3177缺失株為0.75±0.02，較野生株下降了97.2%(P<0.01)。

3 討 論

H BV包膜蛋白由S基因編碼，S基因包括前S1、前S2和S三個(gè)區(qū)[12]，有2個(gè)串聯(lián)的啟動(dòng)子SPⅠ(nt2219–2780)和SPⅡ(nt2809–3152)，前者調(diào)節(jié)2.4kb mRNA轉(zhuǎn)錄，編碼大蛋白；后者調(diào)節(jié)2.1kb mRNA轉(zhuǎn)錄，編碼中蛋白和主蛋白。主蛋白即HBsAg，包括糖基化的GP27和非糖基化的P24，分子量分別為27kD和24kD。GP27的N端146位的門冬酰胺上連接一種復(fù)雜的糖基，形成NXS/T的結(jié)構(gòu)。糖基化修飾是一種翻譯后的修飾，包膜蛋白每經(jīng)過(guò)一次糖基化的修飾可以使其分子量增加3kD，包膜蛋白的糖基化修飾與病毒顆粒的組裝、穩(wěn)定性、抗原性和感染性密切相關(guān)[13-14]。HBsAg99–169位氨基酸稱為主要親水區(qū)(major hydrophilic region，MHR)，包含了HBV的主要構(gòu)象表位。

本研究中該患者的4份血清獲得96個(gè)克隆，僅1株為HBV S基因野生序列(WT)，其余95株全部存在S基因突變，這種情況引起的長(zhǎng)期表現(xiàn)即為OBI病例，以往在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。從該患者4份血清樣本中檢出的HBV S基因突變多數(shù)位于MHR的a決定簇(aa124–147)內(nèi)，這是一段相對(duì)保守的區(qū)域，是免疫識(shí)別的主要位點(diǎn)。sQ129N(M1)和s131–133 TSM→NST(M2)導(dǎo)致的新發(fā)糖基化位點(diǎn)，可以降低HBsAg與抗體的親和力，導(dǎo)致病毒顆粒的抗原性下降；sQ129N突變、s131–133 TSM→NST突變株上清中HBV載量與野生株相比分別升高了53.4% 和60.7%，而核心顆粒定量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明sQ129N突變、s131–133 TSM→NST突變可增加病毒的分泌能力，這也與臨床HBV DNA檢測(cè)值逐漸升高相符。

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示缺失株的相對(duì)熒光素酶活性較野生株下降了97.2%，說(shuō)明前S1大片段缺失(M5)嚴(yán)重影響了SPⅡ啟動(dòng)子活性，可能會(huì)嚴(yán)重影響2.1kb mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而使HBsAg表達(dá)下降甚至不表達(dá)，這也與圖1中HBsAg極低的表達(dá)量相符。

許多研究發(fā)現(xiàn)sG145R(M4)突變與OBI的發(fā)生相關(guān)性很大，但是關(guān)于其發(fā)生機(jī)制，一些研究認(rèn)為它可以降低HBsAg的抗原性[15-17]，還有一些研究認(rèn)為它是通過(guò)影響病毒或HBsAg的分泌從而導(dǎo)致OBI發(fā)生[18-19]，我們的研究結(jié)果更傾向于后者，sG145R突變對(duì)病毒的抗原性和復(fù)制力無(wú)明顯影響，而上清中HBV的載量卻下降了41.9%，說(shuō)明sG145R可以降低病毒顆粒的分泌能力，使分泌到上清中的病毒顆粒減少。關(guān)于其他幾種突變類型M6-M13(表3)與OBI發(fā)生的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

以往有研究發(fā)現(xiàn)，OBI患者肝臟疾病的進(jìn)展要比普通乙肝更快[20-21]，為了探討其與肝病進(jìn)展可能相關(guān)的因素，我們對(duì)該患者4份血清克隆測(cè)序進(jìn)行了縱向分析，發(fā)現(xiàn)隨著肝臟疾病的進(jìn)展s131–133NST突變所占的比例越來(lái)越大，而前S1大片段缺失也伴隨疾病進(jìn)展的全過(guò)程。s131–133NST突變可以增加病毒的分泌能力，降低病毒的抗原性，這可能使大量的病毒能夠逃逸免疫系統(tǒng)的清除，使機(jī)體處于一種長(zhǎng)期隱匿的感染狀態(tài)，這也與該患者長(zhǎng)期低熱、乏力和納差的臨床表現(xiàn)相符，從而加快了肝臟疾病的進(jìn)展；前S1大段缺失可能也與疾病的進(jìn)展有關(guān)，一些研究認(rèn)為前S1大片段缺失可以使截短的大蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積聚從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力增加，DNA氧化損傷，加重肝臟疾病的進(jìn)展甚至腫瘤發(fā)生[22-23]。

總之，S基因突變與OBI的發(fā)生密切相關(guān)，一些突變可能促進(jìn)了肝臟疾病的進(jìn)展。本研究結(jié)果揭示了HBV S基因復(fù)雜突變?cè)贠BI發(fā)生和肝臟疾病進(jìn)展中的作用，對(duì)研發(fā)完善相關(guān)檢測(cè)試劑有重要意義。

[1] Fu XL, Wang L, Liu F. HBsAg quantitative value in different stages of hepatitis B virus infection and its correlations with serum HBV DNA and age[J]. J Shandong Univ (Health Sci), 2013, 51(5): 94-98. [符曉莉, 王磊, 劉峰. 乙肝病毒感染不同階段血清HBsAg定量值及其與HBV DNA水平和年齡的相關(guān)性[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2013, 51(5): 94-98.]

[2] Raimondo G, Allain JP, Brunetto MR, et al. Statements from the Taormina expert meeting on occult hepatitis B virus infection[J]. J Hepatol, 2008, 49(4): 652-657.

[3] Bes M, Vargas V, Piron M, et al. T cell responses and viral variability in blood donation candidates with occult hepatitis B infection[J]. J Hepatol, 2012, 56(4): 765-774.

[4] Wong DK, Huang FY, Lai CL, et al. Occult hepatitis B infection and HBV replicative activity in patients with cryptogenic cause of hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2011, 54(3): 829-836.

[5] Jiang L, Xu ZH, Liu Y, et al. Up-regulation effect of hepatitis B virus genome A1846T mutation on viral replication and core promoter activity[J]. Med J Chin PLA, 2013, 38(1): 10-14. [江玲, 許智慧, 劉妍, 等. HBV基因組A1846T變異對(duì)病毒復(fù)制力及核心啟動(dòng)子活性的上調(diào)作用研究[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 38(1): 10-14.]

[6] Huang CH, Yuan Q, Chen PJ, et al. Influence of mutations in hepatitis B virus surface protein on viral antigenicity and phenotype in occult HBV strains from blood donors[J]. J Hepatol, 2012, 57(4): 720-729.

[7] Hong K, Seoung-Ae L, Dong-Won K, et al. Naturally occurring mutation in large surface genes related to occult infection of hepatitis B virus genotype C[J]. Plos One, 2013, 8(1): e54486.

[8] Ireland JH, OHeland JB, Basuni AA, et al. Ractivity of 13 in vitro expressed hepatitis B surface antigen variants in 7 commercialdiagnostic assays[J]. Hepatology, 2000, 31(5): 1176-1182.

[9] Liu Y, Xu Z, Liu L, et al. Genotypic and phenotypic characteristics of multidrug-resistant hepatitis B virus infection in Chinese hepatitis B patients[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(6): 539-543. [劉妍, 許智慧, 劉立明, 等. 我國(guó)患者多重耐藥乙肝病毒感染的基因型和表型特點(diǎn)[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 37(6): 539-543.]

[10] Wang X, LiuY, Si LL, et al. Analysis for phenotypic resistant characteristic of a novel mutation rtN236V in reversetranscriptase domain of hepatitis B virus isolated from an adefovir dipovoxil refractory-patient with chronic hepatitis B. Med J Chin PLA, 2013, 38(4):256-259. [王曉, 劉妍, 思蘭蘭, 等. 阿德福韋酯治療失敗的慢性乙型肝炎患者HBV反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)新變異rtN236V的表型耐藥特點(diǎn)分析[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 38(4):256-259.]

[11] Ji D, Liu Y, Si LL, et al. Variable influence of mutational patterns in reverse-transcriptase domain on replication capacity of hepatitis B virus isolates from antiviral-experienced patients[J]. Clinica Chimica Acta, 2011, 412(3-4): 305-313.

[12] Gao SY. Correlation analysis of serum markers of HBV infection and HBVDNA test results[J]. J Jilin Univ (Med Ed) 2011, 37(1): 101. [高淑艷. HBV感染者血清標(biāo)志物與HBVDNA檢測(cè)結(jié)果的關(guān)聯(lián)性分析[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2011, 37(1): 101.]

[13] Renszel KM, Traister RS, Lynch WPk, et al. Unique N-linked glycosylation of CasBrE Env influences its stability, processing, and viral infectivity but not its neurotoxicity[J]. J Virol, 2013, 87(15): 8372-8387.

[14] Zai J, Mei L, Wang C, et al. N-glycosylation of the premembrane protein of Japanese encephalitis virus is critical for folding of the envelope protein and assembly of virus-like particles[J]. Acta Virol, 2013, 57(1): 27-33.

[15] Huang CH, Yuan Q, Chen PJ, et al. Influence of mutation in hepatitis B virus surface protein on viral antigenicity and phenotype in occult HBV strains from blood donors[J]. J Hepatol, 2012, 57(4): 720-729.

[16] Wu C, Deng L, Cao L, et al. Amino acid substitutions at position 122 and 145 of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) determine the antigenicity and immunogenicity of HBsAg and influence in vivo HBsAg clearance[J]. J Virol, 2012, 86(8): 4658-4669.

[17] Kajiwara E, Tanaka Y, Ohashi T, et al. Hepatitis B caused by a hepatitis B surface antigen escape mutant[J]. J Gastroenterol, 2008, 43(3): 243-247.

[18] Kalinina T, Iwanski A, Will H, et al. Deficiency in virion secretion and decreased stability of the hepatitis B virus immune escape mutant G145R[J]. Hepatology, 2003, 38(5): 1274-1281.

[19] Ito K, Qin Y, Guarnieri M, et al. Impairment of hepatitis B virus virion secretion by single-amino-acid substitutions in the small envelope protein and rescue by a novel glycosylation site[J]. J Virol, 2010, 84(24): 12850-12861.

[20] Ikeda K, Kobayashi M, Someya T, et al. Occult hepatitis B virus infection increases hepatocellular carcinogenesis by eight times in patients with non-B, non-C liver cirrhosis: A cohort study[J]. J Viral Hepat, 2009, 16(6): 437-443.

[21] Nishikawa H, Osaki Y. Clinical significance of occult hepatitis B infection in progression of liver disease and carcinogenesis[J]. J Cancer, 2013, 4(6): 473-480.

[22] Wang HC, Huang W, Lai MD, et al. Hepatitis B virus pre-S mutants, endoplasmic reticulum stress and hepatocarcinogenesis[J]. Cancer Sci, 2006, 97(8): 683-688.

[23] Su IJ, Wang HC, Wu HC, et al. Ground glass hepatocytes contain pre-S mutants and represent preneoplastic lesions in chronic hepatitis B virus infection[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2008, 23(8 Pt1): 1169-1174.

Characteristics of S gene mutation in patients with occult HBV infection

CHEN Jian-hong1, LIU Yan2, XU Zhi-hui2, SI Lan-lan2, DAI Jiu-zeng2, LI Qi2, WANG Shuai4, LI Jin3, HAN Ju-qiang4*, XU Dong-ping1*1Viral Hepatitis Research Laboratory, 302 Hospital of PLA, Teaching Hospital of Peking University, Beijing 100039, China
2Viral Hepatitis Research Laboratory, Institute of Infectious Diseases/Liver Failure Research Center,3Department of Medical Administration, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
4Department of Liver Disease, General Hospital of Beijing Command, Beijing 100700, China
*

. XU Dong-ping, E-mail: xudongping302@sina.com; HAN Ju-qiang, E-mail: hanjq73@hotmail.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81373136, 81271847)

ObjectiveTo analyze characteristics of HBV S gene mutation in one patient with occult hepatitis B virus infection, who was positive for serum HBV DNA for long term, but negative for HBsAg in order to reveal the correlation between S gene mutation and development of OBI as well as the progression of the liver disease.MethodsFour serum samples were collected at different time-points for the use of amplifying HBV S gene and performing cloning-sequencing. The representative S mutants were selected to construct recombinant vectors for phenotype analysis.ResultsSeveral S-gene mutational patterns were detected in the samples, including pre-S1 large fragment deletion, s126-127 "RPCMNCTI" insertion, sQ129N, s131-133 TSM→NST, and classical sG145R mutations. In sequential 4 samples, s131-133 TSM→NST mutation was detected in 0%, 26%, 59% and 74% of viral clones, respectively. The pre-S1 large fragment deletion was constantly found in the 4 serum samples, accounting for 26%, 17%, 15% and 21% of detected viral clones, respectively. Phenotypic analysis showed that sQ129N and s131-133 TSM → NST mutations reduced the affinity of the antibody to HBsAg and increased the secretion of virus particles. Compared with the wild-type strain, the replication capacity and surface antigen promoter Ⅱ (SPⅡ) activity of large fragment-deleted (nt 3046-3177 deletion) strain were decreased by 43.7% and 97.2%, respectively. In addition, sG145R-induced impairment to secretion capacity of viral particles was verified.ConclusionsClinical presentations of long-term OBI of this HBV-infected patient could be caused by multiple S-gene mutants.Some S-gene mutations influence viral phenotypic characteristics, which might closely be related to the progression of liver disease.

hepatitis B virus; mutation; HBsAg

R512.62

A

0577-7402(2015)03-0178-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.03.02

2014-12-24；

2015-2-25)

(責(zé)任編輯：熊曉然)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81373136、81271847)

陳建宏，醫(yī)學(xué)碩士。主要從事肝病的基礎(chǔ)與臨床研究

100039 北京大學(xué)解放軍302醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院病毒性肝炎研究室(陳建宏、徐東平)；100039 北京 解放軍302醫(yī)院全軍傳染病研究所、肝衰竭診療與研究中心病毒性肝炎研究室(劉妍、許智慧、思蘭蘭、戴久增、李奇)，醫(yī)務(wù)部(李進(jìn))；100700 北京軍區(qū)總醫(yī)院肝病科(王帥、韓聚強(qiáng))

徐東平，E-mail：xudongping302@sina.com；韓聚強(qiáng)，Email：hanjq73@hotmail.com