石蒜愈傷組織增殖分化及試管鱗莖膨大研究

劉旭忻，鄒　娜，張　露，徐正華，舒春節(jié)，趙　衡

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與藝術(shù)學(xué)院,江西南昌330045)

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石蒜愈傷組織增殖分化及試管鱗莖膨大研究

劉旭忻，鄒娜，張露*，徐正華，舒春節(jié)，趙衡

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與藝術(shù)學(xué)院,江西南昌330045)

摘要：以石蒜愈傷組織為材料，分別采用完全隨機和L9(34)正交試驗設(shè)計，研究不同激素濃度配比對石蒜愈傷組織增殖及不定芽分化，以及大量元素濃度、蔗糖濃度和活性炭(AC)含量對石蒜鱗莖膨大等影響。結(jié)果表明：MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L為適宜的愈傷組織增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)為3.02；MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L為適宜的分化培養(yǎng)基，分化率達到92.58%；MS+蔗糖40 g/L+AC 1.0 g/L為適宜的鱗莖膨大培養(yǎng)基，鱗莖質(zhì)量可達0.86 g，增加6.62倍，直徑達1.00 cm。

關(guān)鍵詞：石蒜；愈傷組織；試管鱗莖；膨大

石蒜(Lycorisradiata(L’Her.) Herb)為石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜屬(Lycoris)鱗莖類多年生草本植物，別名紅花石蒜、魔術(shù)花[1]。石蒜是一類集觀賞、藥用與工業(yè)價值于一體的經(jīng)濟植物[2-4]，廣泛應(yīng)用于植物景觀配置和藥用生產(chǎn)。迄今，有關(guān)石蒜屬植物的研究報道主要集中在染色體核型[5-6]、生長發(fā)育[7]、繁殖及栽培[8]、雜交育種[9]、開發(fā)利用[2-3]等方面。由于石蒜有性雜交結(jié)實率很低[10]，自然分球繁殖系數(shù)低、速度慢[11]，因此很多學(xué)者把注意力集中在石蒜組培研究上，以鱗片為外植體，多用直接誘導(dǎo)出的不定芽進行增殖[12]，以期提高其繁殖系數(shù)，但試管鱗莖小，移栽成活率低[13]，限制了石蒜組培快速發(fā)展。目前百合與大蒜在試管鱗莖膨大方面進行了有益探索[14-16]，取得了一定成效。為此，本文將探討石蒜愈傷組織增殖分化及鱗莖膨大因素，旨在為石蒜試管苗生產(chǎn)和壯大提供技術(shù)支撐，為石蒜屬其他植物的快繁技術(shù)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

以石蒜(Lycorisradiata(L’Her.) Herb)雙鱗片誘導(dǎo)出的愈傷組織為試材，進行愈傷組織增殖、不定芽分化和鱗莖膨大試驗。

1.2試驗方法

1.2.1石蒜愈傷組織增殖與不定芽分化采用完全隨機化試驗設(shè)計，將獲得的愈傷組織切割成約1 cm×1 cm小塊，接種到MS添加4種濃度6-BA(1.0，3.0，5.0，7.0 mg/L)和2種濃度NAA(0.3 mg/L、0.5 mg/L)的8種培養(yǎng)基上，各培養(yǎng)基均添加瓊脂6.5 g/L，蔗糖20 g/L，并調(diào)至pH 5.8。每處理接種10瓶，每瓶1～2塊愈傷組織，重復(fù)3次。接種后置于溫度(25±1)℃，光照強度2 000 lx，光周期12 h/d環(huán)境條件下培養(yǎng)。接種50～60 d后進行統(tǒng)計分析愈傷組織增殖系數(shù)、愈傷組織分化率和分化芽數(shù)。

愈傷組織增殖系數(shù)=培養(yǎng)后愈傷組織體積/接入時愈傷組織體積

(1)

愈傷組織分化率=(出芽的愈傷組織塊數(shù)/愈傷組織總塊數(shù))×100%

(2)

分化不定芽數(shù)=不定芽總數(shù)/出芽的愈傷組織塊數(shù)

(3)

1.2.2石蒜試管鱗莖膨大將分化出的不定芽叢芽分割成單芽,選取直徑為0.2～0.3 cm的單芽，切去其葉片,接種于膨大培養(yǎng)基上，各培養(yǎng)基均添加瓊脂6.5 g/L，調(diào)至pH 5.8。試驗設(shè)計采用3因素3水平的正交設(shè)計，參照L9(34)設(shè)計表(表1)，共9個處理，每處理接種10瓶，每瓶接種1個芽，兩次重復(fù)。置于溫度(25±1)℃，光照強度2 000 lx，光周期12 h/d環(huán)境培養(yǎng)，并觀察鱗莖膨大狀況。接種50～60 d后，從培養(yǎng)基中取出誘導(dǎo)出的鱗莖，剪去葉片和根，稱其質(zhì)量，測定鱗莖直徑和高度，統(tǒng)計鱗莖增重倍數(shù)和鱗莖指數(shù)等指標(biāo)。

初始單芽鮮重=接種單芽后培養(yǎng)基與瓶的總質(zhì)量-未接種前的培養(yǎng)基與瓶的總質(zhì)量

(4)

鱗莖增重倍數(shù)=最終形成鱗莖質(zhì)量/初始單芽質(zhì)量

(5)

鱗莖指數(shù)=鱗莖高度/鱗莖直徑

(6)

1.2.3數(shù)據(jù)處理和分析應(yīng)用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 17.0進行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1激素配比對石蒜愈傷組織增殖與不定芽分化影響

石蒜愈傷組織在含有不同激素濃度配比的培養(yǎng)基中進行增殖(表2)，結(jié)果表明NAA濃度一定時，愈傷組織增殖系數(shù)隨著6-BA濃度的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢，并在6-BA為5.0 mg/L時達到最大值，分別比1.0，3.0，7.0 mg/L提高80.84%、54.87%、101.33%；當(dāng)6-BA濃度一定時，與0.3 mg/L NAA相比，0.5 mg/L NAA在1.0，3.0，5.0，7.0 mg/L 6-BA條件下增殖系數(shù)分別提高15.97%、34.48%、64.13%、15.38%。方差分析表明，處理7的增殖系數(shù)與其他各處理間存在極顯著差異。由上可知，植物生長調(diào)節(jié)劑的不同濃度配比組合對愈傷組織的增殖有較大的影響，其中以MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L(即處理7)中的愈傷組織生長最快(愈傷組織體積增大后質(zhì)地較疏松，呈淡黃色)、增殖系數(shù)最大(3.02倍)而為最佳增殖配方(圖1)。

表2　不同激素濃度配比對石蒜愈傷組織增殖和不定芽分化的影響

大寫字母代表0.01水平的差異顯著性分析，小寫字母代表0.05水平的差異顯著性分析。+：愈傷組織緩慢生長；++：愈傷組織生長較快；+++：愈傷組織快速生長。

Uppercase letter significant at 0.01 level,lowercase letter significant at 0.05 level.+:proliferated slowly;++:proliferated faster;+++:proliferated rapidly.

愈傷組織增殖中，也會分化出不定芽。當(dāng)培養(yǎng)30 d時，愈傷組織表面出現(xiàn)白色芽點，50～60 d時芽頂端分化出綠色葉片，但是添加不同濃度配比的植物生長調(diào)節(jié)劑，不定芽分化情況大不相同(圖1-圖2)。表1表明，當(dāng)NAA濃度不變，分化率隨著6-BA濃度的增加而減??；當(dāng)6-BA濃度不變，分化率隨著NAA濃度的升高而下降。方差分析表明，處理1與其它處理達極顯著差異；而處理4和8培養(yǎng)基中的石蒜愈傷組織分化率較低，與其他處理也有極顯著差異。石蒜愈傷組織在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L(即處理1)中具有最高分化率，為92.58%。

不同激素濃度配比組合使得不定芽分化率各不相同，其誘導(dǎo)愈傷組織分化出的不定芽個數(shù)亦有差別(表2)。NAA濃度一定時，6-BA濃度的升高會導(dǎo)致不定芽數(shù)減少；6-BA濃度一定時，低濃度的NAA能促進不定芽數(shù)增加，其中以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L(處理1)中分化芽數(shù)最多(5.53個)，分別比處理2、3、4提高41.43%、56.66%、159.62%，且分化出的不定芽長勢較壯，植株較大。方差分析結(jié)果表明，處理1與其他各處理間均存在極顯著差異。由此看出，低濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑組合不僅可提高石蒜不定芽分化率、且有利于不定芽的形成及生長，篩選出石蒜不定芽適宜分化培養(yǎng)基配方組合為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L(處理1)。

2.2不同因素水平對石蒜試管鱗莖膨大影響

在膨大培養(yǎng)基上培養(yǎng)至50～60 d后，測定鱗莖質(zhì)量、直徑與高度，鑒于石蒜鱗莖近球形，膨大效果主要是體現(xiàn)為質(zhì)量的增加與直徑的增長(圖3)，重點分析其質(zhì)量與直徑，對高度值的分析僅作參考。

從表3中可以看出不同因素水平對石蒜試管鱗莖的質(zhì)量、直徑、高度的影響不同。就鱗莖質(zhì)量而言，處理4的石蒜鱗莖質(zhì)量值最大(0.86 g)，比處理2提高514.29%。通過分析鱗莖質(zhì)量極差值，可知影響石蒜試管鱗莖增重因素的主次順序依次為：大量元素、活性炭、蔗糖。就不同因素水平而言，含大量元素濃度1 MS的培養(yǎng)基，分別比大量元素濃度為1/2 MS、2 MS的培養(yǎng)基平均質(zhì)量提高129.63%、67.57%；添加活性炭2.0 g/L的培養(yǎng)基分別比添加活性炭0.5 g/L、1.0 g/L的培養(yǎng)基提高質(zhì)量96.43%、27.91%；但不同蔗糖濃度對鱗莖質(zhì)量的影響較小，其中以添加40 g/L蔗糖的增重效果較好。

表3　石蒜試管鱗莖膨大相關(guān)性狀及大量元素濃度、蔗糖含量、活性炭含量極差分析

大寫字母代表0.01水平的差異顯著性分析，小寫字母代表0.05水平的差異顯著性分析。

Uppercase letter significant at 0.01 level,lowercase letter significant at 0.05 level.

從鱗莖的直徑這一指標(biāo)來看，處理4中的石蒜試管鱗莖直徑最大(1.00 cm)，分別比處理2、處理9提高163.16%、44.93%。根據(jù)極差值可知對鱗莖直徑增長影響最大的是大量元素，其次是活性炭，蔗糖的作用最小。進一步分析各因素不同水平的作用，大量元素濃度為1 MS的培養(yǎng)基對促進鱗莖直徑增長的效果最好，平均直徑分別比添加大量元素1/2 MS、2 MS的培養(yǎng)基提高53.57%、26.47%；培養(yǎng)基中活性炭用量由0.5 g/L提升至1.0 g/L時，鱗莖平均直徑提高11.29%，活性炭用量由0.5 g/L提升至2.0 g/L時，平均直徑提高25.81%；含有蔗糖40 g/L的培養(yǎng)基的平均直徑(0.77 cm)與含有蔗糖80 g/L的培養(yǎng)基的平均直徑(0.71 cm)比較接近。方差分析表明，處理4對試管鱗莖增重和直徑增長影響與除了處理5之外的其他處理間的差異均達到極顯著水平。

從鱗莖的高度值來看，仍然是處理4的效果最好，該處理中的試管鱗莖高度達到1.24 cm，分別比處理1、處理2、處理8提高58.97%、121.43%、63.16%。處理5、處理3、處理7中的鱗莖高度僅次于處理4，但這四個處理之間差異不顯著。

從3個單因素(大量元素、蔗糖、活性炭)的鱗莖質(zhì)量、直徑極差比較中，分析出較好的鱗莖增重配方為MS+蔗糖 40 g/L+活性炭 2.0 g/L。但該配方與正交試驗所得的最佳膨大方案處理4的配方存在偏差，要得到最優(yōu)的膨大配方，需進一步做試驗對比驗證。

驗證試驗中MS+蔗糖 40 g/L+活性炭 2.0 g/L所培養(yǎng)的鱗莖平均質(zhì)量為0.32 g，鱗莖平均直徑為0.70 cm，鱗莖平均高度為0.95 cm，膨大效果明顯不及處理4(鱗莖平均質(zhì)量0.86 g，鱗莖平均直徑1.00 cm，鱗莖平均高度1.24 cm)。綜合分析表明：以MS基本培養(yǎng)基添加40 g/L蔗糖與1.0 g/L活性炭(處理4)為最佳的膨大配方組合，移栽成活率高達98%(圖4)。

圖1　MS+6-BA 5 mg/L+NAA 0.5 mg/L愈傷組織增殖、分化效果Fig.1　Effect of callus proliferation and differentiation onMS+6-BA 5 mg/L+NAA 0.5 mg/L

圖2　MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.3 mg/L愈傷組織增殖、分化效果Fig.2　Effect of callus proliferation and differentiation onMS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.3 mg/L

圖3　鱗莖膨大效果的比較Fig.3　Comparison of bulblet enlargement

圖4　試管苗移栽成活Fig.4　Transplanting survival of test-tube plantlets

3討論與結(jié)論

植物生長調(diào)節(jié)劑的種類與濃度配比對石蒜屬植物的組培繁殖及小鱗莖的分化存在影響[17]，本研究得出較高濃度的6-BA和NAA組合有利于石蒜愈傷組織的增殖，較低濃度的生長素有利于分化出不定芽。石蒜試管鱗莖貯藏的養(yǎng)分能為石蒜出苗后的生長發(fā)育提供大量的營養(yǎng)，試管苗形成的鱗莖愈大愈能夠提高移栽成活率，所以鱗莖的大小決定著試管苗出瓶移栽后的生長勢態(tài)。對于石蒜鱗莖而言，大量元素是促進其膨大的決定性因素，大量元素濃度等于標(biāo)準(zhǔn)濃度MS時，膨大效果最好，這與張潔等[18]的研究結(jié)果不相同。大量元素濃度過低，不利于鱗莖的膨大[19-20]，而大量元素中N、P、K等濃度過高會抑制根的發(fā)生，影響營養(yǎng)元素的吸收。高含量的活性炭有利于試管鱗莖的膨大，隨著活性炭含量的增加，鱗莖的質(zhì)量和直徑增加，2.0 g/L時，鱗莖膨大顯著，這與胡鳳榮[21]的研究結(jié)果相似?？赡苁腔钚蕴拷o試管鱗莖創(chuàng)造了暗環(huán)境，產(chǎn)生了對生長抑制物等其他有機物的吸附作用，從而促進了鱗莖的膨大[20,22]。蔗糖濃度為40 g/L時，有利于鱗莖的膨大，這與朱錦等[11]、王光萍等[23]的研究結(jié)果不一致。推測是小鱗莖在膨大前所處的營養(yǎng)環(huán)境不相同，機體內(nèi)所含養(yǎng)分存在差異，膨大過程中對糖分的需求也不盡相同。三種因素采用正交設(shè)計，則大量元素MS+蔗糖40 g/L+AC 1.0 g/L為最佳膨大組合，這是各因素間互相作用的結(jié)果。

本試驗通過帶鱗莖基盤的石蒜雙鱗片誘導(dǎo)獲得愈傷組織，以愈傷組織為外植體，添加不同濃度配比的激素進行增殖、不定芽分化，再將分化形成的單芽放入正交設(shè)計的培養(yǎng)基上促進其鱗莖膨大。主要技術(shù)路線為：將愈傷組織接入MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L進行增殖，取增殖后的愈傷組織放入分化培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L誘導(dǎo)不定芽萌發(fā)，最后將所得的單芽置于MS+蔗糖40 g/L+AC 1.0 g/L中進行鱗莖膨大培養(yǎng)。試驗中亦發(fā)現(xiàn)，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L能促使石蒜鱗莖復(fù)壯，使鱗莖直徑增長至0.30 cm左右，為鱗莖膨大試驗提供了良好材料。

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Proliferation and Differentiation of Callus and

Enlargement of Tube Bulbs inLycorisradiata

LIU Xu-xin,ZOU Na,ZHANG Lu*,XU Zheng-hua,

SHU Chun-jie,ZHAO Heng

(College of Landscape and Art,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

Abstract:Taking the callus ofLycorisradiataas material,the callus proliferation and adventitious bud differentiation ofL.radiatawere studied by means of randomized complete design,using the medium of different hormone proportions.The influences of the macroelement concentration,sucrose concentration,activated carbon concentration on bulblet enlargement ofL.radiatawere studied utilizing L9(34) orthogonal design.The results showed that the suitable medium for the callus proliferation was MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L and its multiplication coefficient was 3.02.The suitable medium for the bud differentiation was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L and its differentiation rate was up to 92.58%.The suitable medium for the bulblet enlargement was MS with 40 g/L sucrose and 1.0 g/L activated carbon.The weight and the diameter of the bulblet were up to 0.86 g and 1.00 cm respectively,and the weight increased 6.62 times.

Key words:Lycorisradiata;callus;bulblet in tube;enlargement

作者簡介：劉旭忻(1991—)，女，碩士生，主要從事石蒜組織培養(yǎng)研究，E-mail:jxaulxx@163.com;*通信作者：張露，教授，博導(dǎo)，E-mail:zhlu856@163.com。

基金項目：教育部留學(xué)回國人員啟動基金(教外司留[(2009)1001號])

收稿日期：2015-03-18修回日期：2015-05-05

中圖分類號：S682.2+9

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-2286(2015)06-1005-06

劉旭忻，鄒娜，張露，等.石蒜愈傷組織增殖分化及試管鱗莖膨大研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，37(6)：1005-1010.