核苷酸切除修復(fù)基因XPF無義突變與胃癌發(fā)生的相關(guān)性研究

魏中華　黃　琴　高　軍　金艷鳳　劉　敏

作者單位：201306 上海市第六人民醫(yī)院病理科

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核苷酸切除修復(fù)基因XPF無義突變與胃癌發(fā)生的相關(guān)性研究

魏中華黃琴高軍金艷鳳劉敏

作者單位：201306 上海市第六人民醫(yī)院病理科

【摘要】目的探討胃癌組織及胃癌細胞系中XPF C2169A無義突變與其發(fā)生的關(guān)系。方法對488例腫瘤患者外周血及64例胃癌組織進行基因組DNA的提取，應(yīng)用Taqman MGB探針進行基因分型；應(yīng)用免疫組化法檢測XPF蛋白的情況。結(jié)果488例腫瘤患者外周血中C2169A無一發(fā)生突變，然而64例胃癌組織中發(fā)現(xiàn)32例(50%)發(fā)生突變，并導(dǎo)致XPF蛋白表達水平降低，羧基端失去194個氨基酸；XPF C2169A突變僅出現(xiàn)在癌組織中，而癌旁正常組織中沒有突變；突變后表達的截斷蛋白tXPF不能與ERCC1相互作用，迅速通過泛素化降解。結(jié)論胃癌中XPF C2169A主要是單等位基因突變，表明XPF是一個單倍型劑量不足修復(fù)基因，XPF C2169A突變可以作為胃癌早期診斷和治療的靶點。

【關(guān)鍵詞】核苷酸切除修復(fù)酶；單核苷酸多態(tài)性；突變；胃癌；泛素

(ThePracticalJournalofCancer，2015，30:0028～0031)

研究表明核苷酸切除修復(fù)酶(XPF)與腫瘤之間存在密切的聯(lián)系，如XPF功能缺陷罹患皮膚癌的風(fēng)險增加[1]，然而XPF與胃癌發(fā)生之間的關(guān)系仍有待進一步的闡述。本研究運用免疫組化分析胃癌與癌旁組織XPF蛋白的表達差異，TaqMan MGB探針結(jié)合激光捕獲顯微切割對血樣及胃癌與癌旁組織進行基因分型，結(jié)合分子生物學(xué)實驗綜合分析XPF無義突變與胃癌發(fā)生的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1資料

胃癌組織及血樣分別為上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院病理科和檢驗科2012年1月至2012年12月收集的樣本。

1.2XPF基因單核苷酸多態(tài)性的選擇及試劑

首先對XPF基因在NCBI SNP數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi showRare=on&chooseRs=all&go=Go&locusId=2072)進行生物信息學(xué)分析，再結(jié)合PFS數(shù)據(jù)庫(http：//pfs.nus.edu.sg/(S(z33avc3onc224ksdhkac4m5h))/FuncDetail_V1.aspx?Func=NCBI_Gene_LinkOut&FuncAddInfo=2072)預(yù)測，選取rs2020959C>A(NM_005236.2：c2169C>A)作為研究對象。血樣基因組DNA提取試劑盒及石蠟包埋組織DNA提取試劑盒(DP330)購自北京天根生物技術(shù)有限公司；激光捕獲顯微切割組織DNA提取試劑盒(KIT0103)購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；TaqMan MGB探針和引物(C_11189219_10)用于rs2020959基因分型。15%的樣本進行基因分型重復(fù)實驗，100%結(jié)果一致。

1.3細胞培養(yǎng)

胃癌細胞系A(chǔ)GS、SGC7901和MKN45以及人胚腎細胞系HEK293T均購自中科院上海細胞庫。10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4表達載體的構(gòu)建

將XPF和ERCC1基因PCR擴增后產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后連接到pCDNA3.1載體上分別形成pCDNA-XPF和pCDNA-ERCC1表達載體；另外構(gòu)建含有GFP標(biāo)簽的pEGFP-XPF載體。用全氏金突變試劑盒構(gòu)建突變載體pEGFP-tXPF。所有載體在大腸桿菌TOP10中進行擴增，然后經(jīng)過質(zhì)粒純化試劑盒抽提質(zhì)粒，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5免疫組織化學(xué)染色

所有標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片，常規(guī)HE染色。按照S-P免疫組化染色試劑盒說明書步驟進行XPF染色。以已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照，以兔血清封閉液和同種屬非免疫血清作為空白對照。陽性判斷采用半定量標(biāo)準(zhǔn)：按染色強度及陽性染色細胞百分率計分，最后以上述2項評分之和作為評判標(biāo)準(zhǔn)，0~1分為低表達，≥2分為高表達。

1.6瞬時轉(zhuǎn)染和western blot

HEK293T細胞以每孔1×105個細胞種植六孔板，轉(zhuǎn)染前培育16 h；用轉(zhuǎn)染試劑X-TREME GENE HP DNA(Roche Molecular Systems)轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后，用細胞裂解液冰上裂解細胞20 min，收取蛋白進行定量。等量的蛋白經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%牛奶封閉1 h，XPF單抗(Gene Tex)封閉過夜，PBS充分洗滌后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，用增強化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進行檢測。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行分析處理，胃癌與癌旁組織間XPF表達的差異采用卡方檢驗，等位基因的分型應(yīng)用Fisher確切概率。

2結(jié)果

2.1胃癌及血樣中XPF C2169A突變的檢測結(jié)果

488例腫瘤患者中無1例XPF C2169A發(fā)生突變，表明人群中該位點SNP并不常見，然而在64例胃癌中發(fā)現(xiàn)有32例發(fā)生雜合性突變(表1)，提示胃癌中這是一種體細胞突變。進一步對5例胃癌及癌旁組織分析發(fā)現(xiàn)，癌旁組織中XPF基因沒有突變，然而有2例癌組織中共發(fā)生了突變，同樣的突變出現(xiàn)在3例胃癌細胞系(AGS，MKN45，and SGC7901)中。XPF無義突變引入了一個非成熟終止密碼，因此三株胃癌細胞表達截斷和全長的XPF蛋白，與僅表達全長XPF蛋白HEK293T細胞相比，三株胃癌細胞中XPF蛋白表達明顯降低(圖1)。因此，C>A突變不是一個簡單的SNP，而是與胃癌相關(guān)的無義突變。

表1　胃癌和腫瘤患者外周血中基因分型結(jié)果(例，%)

A為四株細胞系中XPF蛋白表達，B為應(yīng)用Image J軟件以β-actin為參照對上圖XPF的定量分析。

2.2胃癌及癌旁組織中XPF蛋白的表達情況

113例癌旁組織中XPF呈高表達，24例癌組織中XPF呈高表達，表明胃癌組織中XPF表達的不穩(wěn)定性。

2.3tXPF與ERCC1相互作用

XPF通過其羧基端的265個氨基酸與ERCC1相互作用(AA559-AA823)。通過免疫沉淀及免疫印跡檢測tXPF或XPF與ERCC1的相互作用，結(jié)果表明與XPF相比，tXPF與ERCC1的相互作用明顯降低(圖2A)。為了進一步評價tXPF蛋白的穩(wěn)定性，tXPF或XPF與ERCC1載體共轉(zhuǎn)染AGS細胞1天、2天和3天。western blot結(jié)果表明XPF蛋白轉(zhuǎn)染3天中依然穩(wěn)定，tXPF蛋白轉(zhuǎn)染后第3天穩(wěn)定性明顯下降(圖2B和2C)。故推測XPF蛋白的穩(wěn)定性有賴于其整體結(jié)構(gòu)的完整性，而羧基端194個氨基酸的缺失則破壞了這種結(jié)構(gòu)的完整性。為了驗證這一點，將pCDNA3.1-HAtXPF載體轉(zhuǎn)染AGS細胞，24 h后給予MG132(1種蛋白酶抑制劑)，3天后收取蛋白行western blot分析，在MG132處理后tXPF濃度顯著升高，提示tXPF是通過泛素化途徑降解的。進一步于AGS細胞中共同轉(zhuǎn)染帶有GFP標(biāo)簽表達tXPF或XPF蛋白與帶HA標(biāo)簽的泛素載體，然后通過GFP抗體檢測XPF或tXPF蛋白表達或通過HA抗體檢測XPF或tXPF蛋白的泛素化。結(jié)果表明GFP抗體免疫沉淀后XPF或tXPF在MG132處理后都被泛素化，tXPF比XPF泛素化更明顯，提示tXPF更易受到蛋白酶體的降解。

3討論

胃癌是國內(nèi)第三常見的惡性腫瘤[2]。盡管其病因還不是很清楚，但是遺傳改變在胃癌的發(fā)生中有著很重要的作用[3]。本研究結(jié)果表明XPF基因2169位點的無義突變能夠促進該修復(fù)蛋白的降解，而且該突變僅出現(xiàn)在胃癌組織中，而腫瘤病人的外周血和癌旁正常組織中沒有突變，這些結(jié)果提示該突變是胃癌組織的特異性突變，可以作為一個陽性的生物學(xué)標(biāo)記。核苷酸切除修復(fù)是DNA修復(fù)的重要途徑之一[4]，切除修復(fù)過程中XPF與ERCC1形成異源性二聚體，因此干擾該二聚體形成的因素都會阻礙核苷酸切除修復(fù)[5]。我們研究發(fā)現(xiàn)XPF蛋白羧基端部分缺失會干擾XPF/ERCC1二聚體的形成，而且截斷的XPF蛋白不穩(wěn)定而逐漸降解。

根據(jù)流行病資料庫記載，XPF基因2169位點A堿基突變率在墨西哥和日本人群中分別是4.1%和1.2%，然而在歐洲和中國人群中沒有發(fā)現(xiàn)該位點突變(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=2020959)。與此一致的是我們在488例漢族人群血樣中沒有發(fā)現(xiàn)該位點突變，相反在胃癌中發(fā)現(xiàn)有50%的突變，表明該位點的突變與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。一般認為腫瘤是一個復(fù)雜的疾病，散發(fā)性遺傳變異通常不足以增加致癌風(fēng)險，很有可能是DNA修復(fù)能力的破壞導(dǎo)致突變的積累，從而進一步加速了惡性的轉(zhuǎn)化[6-7]。

A為體外XPF或tXPF與ERCC1相互作用，B和C為XPF和tXPF蛋白穩(wěn)定性的比較，C為應(yīng)用Image J 軟件對B圖XPF蛋白進行定量。

圖2tXPF/ERCC1相互作用及tXPF蛋白的穩(wěn)定性

雖然胃癌發(fā)生的確切機制還不是很清楚，但是來源于腫瘤研究的證據(jù)表明DNA修復(fù)酶XPF/ERCC1和胃癌之間是有相關(guān)性的。Matoka等應(yīng)用組織重建模式研究了前列腺癌中核苷酸切除修復(fù)酶XPF/ERCC1的潛在作用，他們研究發(fā)現(xiàn)XPF/ERCC1有助于防止前列腺癌的產(chǎn)生，然而該修復(fù)途徑的破壞會使前列腺上皮更易于向惡性轉(zhuǎn)化[8]。另外Facista等研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中XPF/ERCC1表達也是降低的[9]。

早期東方人群的研究顯示ERCC1 3個多態(tài)性與胃癌的發(fā)生相關(guān)，研究表明XPF rs2276466C>G，rs6498486A>C多態(tài)性與胃癌之間沒有聯(lián)系[10]。但是Meta分析表明XPF單核苷酸多態(tài)性和胃癌之間存在聯(lián)系[11]。本研究證明XPF rs2020959C>A 在胃癌組織中引入一個終止密碼，提示在胃癌早期轉(zhuǎn)化過程中XPF作為癌基因起作用。由于rs2020959C>A干擾了XPF的重要功能，我們把它作為一個突變而不是單核苷酸多態(tài)性。該突變主要是單等位基因，表明XPF是一個單倍型劑量不足修復(fù)基因。據(jù)我們所知，本研究首次報道XPF C2169A與胃癌發(fā)生的風(fēng)險增加有關(guān)，對于正常細胞惡性轉(zhuǎn)化可能具有關(guān)鍵性的作用。當(dāng)腫瘤中表達截斷蛋白tXPF時試圖恢復(fù)DNA的正常修復(fù)功能值得更深入的研究。

參考文獻

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(編輯：吳小紅)

Correlation Study of Nonsense Mutation of Xeroderma Pigmentosum Complementation Group F (XPF) Gene and Gastric Carcinogenesis

WEIZhonghua，HUANGQin，GAOJun，etal.DepartmentofPathology，SixthPeople’sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai，201306

【Abstract】ObjectiveTo study the relation between C2169A nonsense mutation in XPF and Carcinogenesis in gastric cancer tissues and cell lines.MethodsGenomic DNA was extracted from blood samples of 488 cancer patients and 64 gastric tumors.The genotype was mapped using a Taqman MGB probe.Expression of XPF was examined by immunohistochemistry.ResultsThe C2169A mutation was not detected in 488 samples of blood genomic DNA，yet was found in 32 of 64 gastric cancer tissue samples (50.0%)，resulted in a 194 C-terminal amino acid loss in XPF protein and lower expression.The XPF C2169A was found in cancer tissues，but not in surrounding normal tissues.The truncated form of XPF (tXPF) impaired interaction with ERCC1，was rapidly degraded via ubiquitination.ConclusionIn gastric cancer，the C2169A mutation is monoallelic，indicating that XPF is a haplo-insufficient DNA repair gene.The C2169A mutation might be regarded as a therapeutic target for early diagnosis and treatment of gastric cancer.

【Key words】Nucleotide excision repair enzymes；Single nucleotide polymorphism(SNP)；Mutation；Gastric cancer；Ubiquitination

(收稿日期2014-03-08修回日期 2014-04-04)

中圖分類號：R735.2

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-5930(2015)01-0028-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.008

通訊作者：劉敏