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    miR-20b對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制的研究

    2015-03-02 09:05:34吳巍蕓
    實(shí)用癌癥雜志 2015年1期
    關(guān)鍵詞:凋亡

    吳巍蕓 周 宇

    作者單位:524001 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

    ?

    miR-20b對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制的研究

    吳巍蕓周宇

    作者單位:524001 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

    【摘要】目的探討miR-20b對(duì)大腸癌(CRC)細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制。方法將miR-20b模擬物轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞株HCT-116,qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-20b的表達(dá),分別應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖和凋亡情況。qRT-PCR和western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Bcl-w mRNA和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果轉(zhuǎn)染miR-20b 模擬物后,HCT-116細(xì)胞中miR-20b表達(dá)水平明顯上調(diào),HCT-116細(xì)胞增殖減弱(P<0.05),凋亡增強(qiáng)(P<0.05)。miR-20b可作用于Bcl-w mRNA 的3′-UTR,使海腎熒光素酶活性顯著降低。轉(zhuǎn)染后Bcl-w mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論上調(diào)HCT-116細(xì)胞中miR-20b表達(dá)水平,可抑制其靶基因Bcl-w的表達(dá),發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、增加凋亡的作用。

    【關(guān)鍵詞】微小RNA;大腸癌;Bcl-w;增殖;凋亡

    (ThePracticalJournalofCancer,2015,30:0020~0024)

    大腸癌(colorectal cancer,CRC)的發(fā)生、發(fā)展是多因素參與的過(guò)程。原癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)及其編碼蛋白功能的改變可影響腫瘤發(fā)生的多個(gè)方面,包括細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、耐藥以及維持遺傳基因穩(wěn)定等[1]。微小RNA (microRNA,miRNA,miR)是一類非編碼單鏈小分子RNA,其與靶基因mRNA的3'非編碼末端(3'-UTR)完全和部分互補(bǔ)性結(jié)合,從而引起靶mRNA的降解或者阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯,與腫瘤[2]、心血管疾病[3]、炎癥[4]等病理生理過(guò)程相關(guān)。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn),與正常大腸組織相比,CRC存在多種miRNA表達(dá)異常[5-7]。其中基因芯片檢測(cè)顯示miR-20b在CRC組織中表達(dá)明顯下調(diào)[5],本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析miR-20b對(duì)CRC細(xì)胞的增殖、凋亡的影響及對(duì)其潛在靶基因Bcl-w的調(diào)控,探討miR-20b在CRC發(fā)生發(fā)展中的作用。

    1材料與方法

    1.1主要材料及試劑

    人大腸癌細(xì)胞株HCT-116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM2000(lipo2000)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,Opti-MEM I培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。人miR-20b 模擬物(mimics)、miRNA-20b mimics陰性對(duì)照(miR-20b mimics-NC)購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自上海Dojindo公司。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、小鼠抗人β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔或羊抗小鼠IgG、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。兔抗人Bcl-w抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。 RNAiso Plus、One Step PrimeScript(R)miRNA cDNA Synthesis Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR(R)Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)均購(gòu)自大連Takara公司。TIANGEN高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。miR-20b、U6、Bcl-w、β-actin引物由上海生工生物工程公司合成。

    1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

    HCT-116細(xì)胞用含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液,置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將HCT-116細(xì)胞接種至6孔板,繼續(xù)培養(yǎng)24 h待細(xì)胞長(zhǎng)至60%左右融合時(shí)轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為2組:①miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組:使用lipo2000將miR-20b mimics(終濃度100 nmol/L)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞;②NC組:使用lipo2000將miR-20b mimics-NC(終濃度100 nmol/L)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。

    1.3實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-20b的表達(dá)

    各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,用RNAiso Plus提取總RNA。PrimeScript(R)miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄。所得cDNA再使用試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。miR-20b以U6作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火延伸20 s,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR引物序列如下:miR-20b 上游引物,5′-CAAAGTGCTCATAGTGCAGGTAG-3′;U6上游引物,5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;miRNA下游引物Uni-miR、qPCR、Primer包含在逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔,miR-20b的相對(duì)表達(dá)量用2-△Ct法計(jì)算。

    1.4CCK-8法檢測(cè)miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況

    將HCT-116細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,按上述分組轉(zhuǎn)染,分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后,每孔更換新鮮培養(yǎng)基200 μl,再加20 μL CCK-8溶液。培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。記錄結(jié)果,以時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

    1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡情況

    HCT-116細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板,按上述分組轉(zhuǎn)染,繼續(xù)培養(yǎng)72 h,胰酶消化、收集細(xì)胞,PBS洗滌1次,離心后加入Annexin V-FITC室溫避光孵育10 min。離心后棄上清,加入碘化丙啶(PI)染色液,冰浴避光放置30 min。進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

    1.6雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

    通過(guò)TargetScan Human 6.2(http://www.targetscan.org/)、microRNA.org(http://www.microrna.org)等常用的生物信息學(xué)網(wǎng)站,預(yù)測(cè)miR-20b的潛在靶基因及其結(jié)合位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增包含miR-20b結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的Bcl-w 3′-UTR序列。將目的序列與雙熒光素酶報(bào)告基因載體連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,擴(kuò)增,應(yīng)用TIANGEN高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒。將含預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的Bcl-w 3′-UTR序列的質(zhì)粒命名為pmiR-Bcl-w-wt,含Bcl-w 3′-UTR突變序列的質(zhì)粒命名為pmiR-Bcl-w-mut。將pmiR-Bcl-w-wt或pmiR-Bcl-w-mut分別與miR-20b mimics或miR-20b mimics-NC共轉(zhuǎn)染HCT-116細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后,檢測(cè)各組海腎及螢火蟲(chóng)熒光素酶活性,兩者比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    1.7qRT-PCR檢測(cè)miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后Bcl-w mRNA的表達(dá)

    各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,用RNAiso Plus提取總RNA。使用PrimeScript(R)RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行mRNA逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)所得的cDNA再使用SYBR(R)Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。以β-actin作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火延伸20 s,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。引物序列如下:Bcl-w上游引物,5′-TTCACCCTACCCTCTACCA-3′;Bcl-w下游引物,5'-AGCCCTTTACCCTTTCAG-3';β-actin上游引物,5′-GGCGGCA-ACACCATGTACCCT-3′;β-actin下游引物,5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。

    1.8Western blot檢測(cè)miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后Bcl-w蛋白的表達(dá)

    用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白,BCA法進(jìn)行蛋白定量后,SDS-PAGE電泳分離總蛋白,電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉1 h后,抗Bcl-w抗體(1∶800)及抗β-actin抗體(1∶1000)4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜后,加入HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗小鼠二抗(1∶1000)室溫孵育1 h,用ECL發(fā)光液顯影,X光壓片曝光。應(yīng)用Quantity One軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

    1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,三組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

    2結(jié)果

    2.1miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-20b表達(dá)上調(diào)

    qRT-PCR結(jié)果顯示,與miR-20b mimics-NC轉(zhuǎn)染組比較,miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組miR-20b表達(dá)水平明顯上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

    圖1 CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組miR-20b的表達(dá)情況

    2.2過(guò)表達(dá)miR-20b抑制HCT-116細(xì)胞增殖

    轉(zhuǎn)染miR-20b mimics至HCT-116細(xì)胞,分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后,CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。由圖2可見(jiàn),培養(yǎng)48 h、72 h、96 h時(shí),miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組在450 nm處的吸光度較相應(yīng)的NC組明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    圖2 CCK-8法檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖情況

    2.3過(guò)表達(dá)miR-20b促進(jìn)HCT-116細(xì)胞凋亡

    轉(zhuǎn)染miR-20b mimics至HCT-116細(xì)胞,培養(yǎng)72 h后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組Annexin V-FITC單陽(yáng)性細(xì)胞較NC組明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

    2.4雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

    在轉(zhuǎn)染pmiR-Bcl-w-wt質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中,miR-20b mimics組與NC組相比較,海腎/螢火蟲(chóng)熒光素酶活性下降,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在轉(zhuǎn)染pmiR-Bcl-w-mut質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中,miR-20b mimics組與NC組相比較,海腎/螢火蟲(chóng)熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P>0.05)(圖4)。

    2.5miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后HCT-116細(xì)胞中Bcl-w表達(dá)水平下調(diào)

    qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染miR-20b mimics-NC組比較,miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Bcl-w mRNA的表達(dá)水平明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5A)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染miR-20b mimics-NC組比較,miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Bcl-w蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5B和5C)。

    3討論

    miRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類具有重要調(diào)控作用的非編碼小分子RNA。研究發(fā)現(xiàn),多種人類腫瘤,包括CRC,都伴有miRNA的表達(dá)異常。miRNA通過(guò)靶基因的調(diào)控,對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生影響,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程起作用。Yu等[8]發(fā)現(xiàn),miR-208在人CRC組織中較正常組織表達(dá)下降,并與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度相關(guān),表達(dá)低的患者比表達(dá)高的患者生存時(shí)間更短,說(shuō)明在大腸癌中miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的特性和患者的預(yù)后相關(guān)。miR-154在CRC組織和細(xì)胞系中表達(dá)降低,過(guò)表達(dá)miR-154通過(guò)作用于其靶基因toll樣受體2(TLR2),抑制CRC細(xì)胞增殖、克隆形成、侵襲、轉(zhuǎn)移等,發(fā)揮抑癌作用[9]。miR-20b與腫瘤的關(guān)系也有少量研究。有研究發(fā)現(xiàn),miR-20b在缺氧的微環(huán)境下可以降低乳腺癌細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)[10]?;蛐酒Y(jié)果也顯示,miR-20b在CRC組織較正常大腸組織表達(dá)下調(diào)[5],但miR-20b如何影響大腸癌的發(fā)生、發(fā)展呢?本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-20b mimics至HCT-116細(xì)胞后,大腸癌細(xì)胞HCT-116的miR-20b表達(dá)上調(diào),同時(shí)細(xì)胞增殖明顯受抑,而細(xì)胞凋亡率增高,提示miR-20b與CRC細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。

    圖3 兩組細(xì)胞凋亡圖

    以NC組為1,mimics組表示為NC組的倍數(shù)。

    Bcl-w是 Bcl-2家族抗凋亡成員之一,過(guò)表達(dá)Bcl-w使細(xì)胞凋亡減少。Bcl-w與CRC形成和進(jìn)展密切相關(guān)[11]。在CRC組織中,Bcl-w表達(dá)率顯著升高,且與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示Bcl-w與CRC的進(jìn)展有關(guān)[12]。張雋等[13]也發(fā)現(xiàn),Bcl-w在大腸腺瘤組織中不表達(dá),而在CRC表達(dá)明顯增高,且隨腫瘤浸潤(rùn)深度增加和淋巴轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生,Bcl-w表達(dá)亦增加,同時(shí)Bcl-w表達(dá)陽(yáng)性CRC患者預(yù)后差,也支持上述Bcl-w與CRC的進(jìn)展有關(guān)的觀點(diǎn)。我們通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Bcl-w是miR-20b潛在的靶基因之一,并進(jìn)一步通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)miR-20b能與Bcl-w的3′-UTR結(jié)合。轉(zhuǎn)染miR-20b mimics后,Bcl-w mRNA和蛋白的表達(dá)水平均下調(diào),與對(duì)照組比較,差異有顯著性,說(shuō)明在CRC細(xì)胞中,miR-20b通過(guò)與Bcl-w的3'-UTR結(jié)合,調(diào)控Bcl-w的表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和凋亡。

    綜上所述,miR-20b在CRC的發(fā)生發(fā)展中起一定作用,為CRC預(yù)防及治療提供新的靶標(biāo)。但是miRNA的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,一個(gè)miRNA不止一個(gè)靶基因,因此miR-20b在CRC的功能仍有廣闊的研究前景。

    A為兩組Bcl-w mRNA表達(dá)情況,B為兩組Bcl-w蛋白表達(dá)情況,C為Western blot檢測(cè)兩組Bcl-w蛋白表達(dá)情況。

    圖5miR-20b對(duì)HCT-116細(xì)胞Bcl-w表達(dá)的影響

    參考文獻(xiàn)

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    (編輯:吳小紅)

    Effect of MiR-20b on Proliferation and Apoptosis of Colorectal Cancer Cells and Its Mechanism

    WUWeiyun,ZHOUYu.DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang,524001

    【Abstract】Objective To explore the effect and mechanism of on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cells.MethodsAfter transfection of miR-20b mimics into HCT-116 cells,the expression of miR-20b was evaluated by real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR),and effect of miR-20b on cell proliferation and apoptosis was determined by CCK-8 assay and flow cytometry,respectively.Bcl-w mRNA and protein was measured by qRT-PCR and western blot.ResultsMiR-20b mimics transfection significantly increased miR-20b expression in HCT-116 cells,inhibited cells proliferation and increased cells apoptosis (P<0.05).MiR-20b could effect on 3′-untranslated region (3′-UTR) of Bcl-w mRNA and decrease renilla luciferase activity.MiR-20b mimics significantly suppressed Bcl-w mRNA and protein level in CRC cells (P<0.05).ConclusionOverexpression of miR-20b in HCT-116 cells may suppress cells proliferation and increase cells apoptosis,probably by downregulating its target gene Bcl-w expression.

    【Key words】MicroRNA;Colorectal cancer;Bcl-w;Proliferation;Apoptosis

    (收稿日期2014-04-29修回日期 2014-09-30)

    中圖分類號(hào):R735.3+4

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    文章編號(hào):1001-5930(2015)01-0020-05

    DOI:10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.006

    通訊作者:周宇

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