原子力顯微鏡在生命科學(xué)領(lǐng)域研究中的應(yīng)用進(jìn)展

鞠安，蔣雯，許陽(yáng)，楊升，常寧，王鵬，顧寧

(東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210009)

·綜 述·

原子力顯微鏡在生命科學(xué)領(lǐng)域研究中的應(yīng)用進(jìn)展

鞠安，蔣雯，許陽(yáng)，楊升，常寧，王鵬，顧寧

(東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210009)

在微納尺度上對(duì)細(xì)胞及相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行觀察是近年來(lái)的熱點(diǎn)。原子力顯微鏡(AFM)以其納米級(jí)別的分辨率、超高的靈敏度以及對(duì)各種工作環(huán)境良好的兼容性而被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。作者介紹AFM在細(xì)胞性質(zhì)、細(xì)胞或生物大分子間相互作用以及觀察動(dòng)態(tài)生物過(guò)程等方面的研究進(jìn)展，歸納傳統(tǒng)AFM存在的主要問(wèn)題以及近年來(lái)針對(duì)這些問(wèn)題作出的改進(jìn)。

原子力顯微鏡； 生命科學(xué)； 研究進(jìn)展； 問(wèn)題與改進(jìn)； 文獻(xiàn)綜述

原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)，是掃描探針顯微鏡(scanning probe microscopy)的一種。它的核心結(jié)構(gòu)是一個(gè)對(duì)力非常敏感的微懸臂，其尖端有一個(gè)微小的探針。當(dāng)探針靠近樣品表面時(shí)，探針尖端的原子與樣品表面的原子之間產(chǎn)生極其微弱的作用力，從而使微懸臂彎曲。探測(cè)器將微懸臂的形變信號(hào)轉(zhuǎn)換成光電信號(hào)進(jìn)行放大，就可以得到原子之間力的微弱變化的信號(hào)，獲得作用力分布信息，從而以納米級(jí)分辨率獲得表面形貌結(jié)構(gòu)信息及表面粗糙度信息(如圖1)。正是由于AFM具有微納級(jí)別的空間分辨率以及皮牛頓級(jí)別的測(cè)力靈敏度[1]，它漸漸成為研究活細(xì)胞表面形貌、結(jié)構(gòu)以及生物過(guò)程的強(qiáng)有力的工具，在生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

1 AFM應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)

自1675列文虎克發(fā)明光學(xué)顯微鏡以來(lái)，人們就開(kāi)始利用顯微鏡這個(gè)平臺(tái)來(lái)觀察微觀世界。后來(lái)，電子顯微鏡(EM)、掃描隧道顯微鏡(STM)、掃描探針顯微鏡(SPM)等相繼問(wèn)世。然而，光學(xué)顯微鏡由于可見(jiàn)光波長(zhǎng)的限制，精度和分辨率遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到觀察生物過(guò)程的要求；無(wú)論是透射EM還是掃描電子顯微鏡，都是利用打到樣品表面的高速電子束來(lái)反映樣品形貌特征，勢(shì)必涉及對(duì)樣品一定程度的損傷；STM是利用隧道效應(yīng)，檢測(cè)隧穿電流，因此一般也要求樣品為導(dǎo)體或半導(dǎo)體。與這些顯微鏡對(duì)技術(shù)和樣品的高要求相比，AFM有著以下幾點(diǎn)明顯的優(yōu)勢(shì)：(1) 樣品制備簡(jiǎn)單，對(duì)樣品的破壞較其他技術(shù)小得多，無(wú)須經(jīng)歷電子束的轟擊或者免疫組化的熒光染色過(guò)程；(2) AFM比一般的STM更有優(yōu)勢(shì)的地方在于，它可以在液態(tài)環(huán)境下檢測(cè)絕緣物質(zhì)，尤其是在生理學(xué)環(huán)境下[2]；(3) 能提供生物分子的高分辨率的圖像；(4) 觀察生物大分子之間的相互作用，如受體-配體、生物素-親和素、抗原抗體等；(5) 能利用針尖對(duì)單細(xì)胞、單分子進(jìn)行操作，如在細(xì)胞膜上打孔、切割染色體等，也可以輔助研究一些細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的問(wèn)題，比如信號(hào)、細(xì)胞分化、細(xì)胞黏附等[3]；能與其他顯微鏡等技術(shù)互補(bǔ)，從多個(gè)角度共同展現(xiàn)生物過(guò)程。

圖1 AFM的成像原理

Fig 1 The Imaging principle of AFM

2 AFM在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用

基于AFM較其他顯微技術(shù)的無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，前人已經(jīng)利用這個(gè)平臺(tái)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行了卓有成效的研究工作，從多個(gè)角度深入探究了生命科學(xué)領(lǐng)域中值得關(guān)注的問(wèn)題。

2.1 AFM對(duì)細(xì)胞膜表面形態(tài)的研究

細(xì)胞膜有重要的生理功能，它既使細(xì)胞維持穩(wěn)定代謝的胞內(nèi)環(huán)境，又能調(diào)節(jié)和選擇物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。AFM能夠觀察到細(xì)胞膜表面的超微結(jié)構(gòu)，因此它可以用來(lái)觀察正常細(xì)胞與病變細(xì)胞的細(xì)胞膜，發(fā)現(xiàn)兩者的異同，為臨床病理診斷提供新的視角和方法。

Braga等[4]在生理?xiàng)l件下觀察了大腸桿菌受抗生素作用后外膜的形態(tài)變化，所獲得的AFM圖像清楚地顯示出外膜上有由成百上千個(gè)脂多糖分子(LPS)組成的突起，他們認(rèn)為就是這些LPS斑塊有效地控制著大腸桿菌的外膜通透性。關(guān)維等[5]用2%的福爾馬林溶液和枸櫞酸鹽緩沖液制備AFM樣品，分別觀察了人成纖維細(xì)胞(Fb cell)、人宮頸癌細(xì)胞(Hela cell)、人乳腺癌細(xì)胞(Mcf7 cell)、人成纖細(xì)胞癌變細(xì)胞(Ma-Fb)。當(dāng)掃描范圍為500 nm時(shí)可見(jiàn)到Fb細(xì)胞膜是由圓形、橢圓形等大小較一致的隆起組成，結(jié)構(gòu)比較飽滿、光滑，隆起的凹陷排列疏密程度適中。而癌變細(xì)胞膜隆起結(jié)構(gòu)明顯增大增高，細(xì)胞膜由圓形、三角形、多角形、不規(guī)則形等多種形狀的隆起構(gòu)成，彼此之間形成的縫隙也變得凸凹不平，排列疏密不均，相對(duì)紊亂。邢曉波等[6]用AFM研究不同刺激條件下T細(xì)胞的形態(tài)和生物力學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)靜息的T細(xì)胞呈較為規(guī)則的圓形，細(xì)胞表面相對(duì)光滑均一，而經(jīng)過(guò)超抗原SEA和植物凝集素PHA活化的T細(xì)胞膜表面粗糙度增大，細(xì)胞表面形成100 nm～1 μm的顆粒狀團(tuán)簇結(jié)構(gòu)。而且他們還發(fā)現(xiàn)不同的刺激劑對(duì)T細(xì)胞的活化程度不同，從而會(huì)導(dǎo)致不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)和膜納米結(jié)構(gòu)。

2.2 AFM測(cè)定細(xì)胞彈性以及力學(xué)性質(zhì)

病變這一生理過(guò)程與細(xì)胞的形態(tài)和力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化會(huì)影響和反映細(xì)胞性質(zhì)、功能以及細(xì)胞微環(huán)境的改變。健康細(xì)胞與病理狀態(tài)的細(xì)胞在機(jī)械性能上是完全不同的。抓住這一點(diǎn)，可以利用AFM測(cè)量出的細(xì)胞彈性性質(zhì)識(shí)別癌細(xì)胞，以及輔助診斷紅細(xì)胞相關(guān)的各種疾病等，從細(xì)胞層面上對(duì)各種疾病進(jìn)行早期診斷和治療。

楊氏模量可視為衡量材料產(chǎn)生彈性變形難易程度的指標(biāo)，其值越大，使材料發(fā)生一定彈性變形的應(yīng)力也越大。大量研究表明，腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的楊氏模量是不同的，這說(shuō)明了楊氏模量可以作為一個(gè)新的腫瘤標(biāo)記。已知彈性常數(shù)的AFM微懸臂探針用于力曲線檢測(cè)已成為目前研究生物微觀力學(xué)不可或缺的強(qiáng)有力的工具。AFM所獲得的力-距離曲線的斜率就是樣品的彈性模量[7]。Ding等[8]利用AFM獲得了宮頸鱗癌細(xì)胞的楊氏模量等力學(xué)參數(shù)，分析了正常細(xì)胞和癌變細(xì)胞彈性性質(zhì)的不同。與傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)分析方法相比，AFM檢測(cè)分析的方法可以避免實(shí)驗(yàn)中主觀因素相互干擾帶來(lái)的假陽(yáng)性或者假陰性。他們也利用高分辨率的成像技術(shù)如環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM)拍攝了細(xì)胞表面的形態(tài)，驗(yàn)證了AFM圖像的分析結(jié)果。Cross等[9]檢測(cè)了體外培養(yǎng)24 h的腫瘤細(xì)胞的模量，發(fā)現(xiàn)它們比正常細(xì)胞要柔軟70%。這些腫瘤細(xì)胞是從肺癌、乳腺癌和胰腺癌病人的胸膜積液中取得的。Lekka等[10]也發(fā)現(xiàn)人類(lèi)膀胱上皮腫瘤細(xì)胞的硬度和可變形性比正常細(xì)胞有所下降。此外，他們也利用AFM對(duì)45個(gè)患有冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓和糖尿病的病人和13個(gè)健康人的紅細(xì)胞模量進(jìn)行了對(duì)比研究[11]。從每個(gè)血樣中隨機(jī)選取20個(gè)左右的紅細(xì)胞，在每個(gè)細(xì)胞表面選擇20～30個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量，以獲取細(xì)胞彈性模量的分布。糖尿病患者和吸煙者血液中紅細(xì)胞模量平均值和寬度分布相比健康人都明顯增大，而且模量平均值與病人年齡相關(guān)。利用這些統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我們可以對(duì)病人進(jìn)行年齡分布、病變程度等早期診斷和治療，為疾病的預(yù)測(cè)提供便利。

2.3 AFM檢測(cè)活細(xì)胞間相互作用

AFM也可以對(duì)細(xì)胞間的相互作用進(jìn)行觀察[12]。將一種細(xì)胞連接在AFM掃面探針的尖端，使針尖功能化，對(duì)另一種單層排列的細(xì)胞進(jìn)行掃描就可以進(jìn)行細(xì)胞間相互作用的研究(如圖2)。如Thie等[13]利用AFM第一次界定了滋養(yǎng)細(xì)胞和子宮內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用。他們?cè)谖冶凵闲揎椛衔⒅?，再將滋養(yǎng)細(xì)胞包被在微珠表面，去接近單層排列的子宮內(nèi)皮細(xì)胞，用AFM獲得兩者之間作用力變化的情況。Omidvar等[14]將T47D細(xì)胞附著在包被了伴刀豆球蛋白A的微懸臂上，該微懸臂作為檢測(cè)兩個(gè)T47D細(xì)胞間黏附力的探針，來(lái)測(cè)量細(xì)胞間的局部剛度。首先帶有T47D細(xì)胞的微懸臂靠近培養(yǎng)的細(xì)胞，讓兩個(gè)細(xì)胞相互接觸。在一定的時(shí)間之后，微懸臂被拉回。兩個(gè)細(xì)胞之間持續(xù)作用，直到兩個(gè)細(xì)胞完全被分開(kāi)。微懸臂的垂直偏轉(zhuǎn)與針尖的細(xì)胞作用力成正比。AFM的這一作用，對(duì)研究多細(xì)胞生物體中細(xì)胞間的相互作用有重要啟示，例如可研究動(dòng)物胚胎移植中細(xì)胞的免疫排異反應(yīng)，還可以研究在病灶處病變細(xì)胞與健康細(xì)胞間有著怎樣的界限，如何相互影響相互作用并達(dá)到一種動(dòng)態(tài)平衡等過(guò)程。

圖2 AFM觀察細(xì)胞間相互作用

Fig 2 Observing interactions between cells by AFM

2.4 AFM觀察動(dòng)態(tài)生物過(guò)程

AFM也是觀察細(xì)胞生物過(guò)程非常有效的工具[15]。Haberle等[16]用AFM記錄了單個(gè)病毒顆粒從被感染細(xì)胞中釋放的過(guò)程。類(lèi)似地，Ohnesorge等[17]研究了痘病毒和活細(xì)胞，得到了痘病毒感染活細(xì)胞全過(guò)程的AFM圖。通過(guò)活著的細(xì)胞觀察子代病毒顆粒，并用AFM在水溶液環(huán)境中在分子水平分辯出有規(guī)則重復(fù)的烙鐵狀結(jié)構(gòu)和準(zhǔn)有序的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。觀察中發(fā)現(xiàn)：在感染前后最初幾小時(shí)，細(xì)胞并無(wú)顯著變化；子代病毒粒子沿細(xì)胞骨架進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，還有胞吐、病毒顆粒聚集等現(xiàn)象。通過(guò)AFM圖像可以看出啞鈴狀小泡逐漸形成、消失并在細(xì)胞膜表面形成凹陷的全過(guò)程。Yamashita等[18]發(fā)現(xiàn)了趨磁細(xì)菌細(xì)胞表面的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。他們發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外膜完全被一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)所覆蓋，在這種結(jié)構(gòu)的邊緣有很多孔蛋白顆粒。用AFM追蹤網(wǎng)孔的運(yùn)動(dòng)軌跡，動(dòng)力學(xué)圖像揭示了在小孔邊緣的顆粒是如何進(jìn)出這些結(jié)構(gòu)的。第一次用AFM觀察到了活細(xì)胞表面的分子動(dòng)力學(xué)，直接展示了孔蛋白類(lèi)結(jié)構(gòu)在磁性顆粒穿過(guò)細(xì)胞膜的過(guò)程。Yokokawa等[19]將兔子肌肉中的鈣離子泵提純出來(lái)，放在云母板上的脂質(zhì)環(huán)境中，用fastXY模式(可以實(shí)現(xiàn)顯微鏡樣品電動(dòng)化XY軸定位的一種掃描模式)來(lái)檢測(cè)鈣離子泵運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。他們發(fā)現(xiàn)這一過(guò)程受到鈣離子和ATP的共同影響，而且在一種鈣離子泵抑制劑毒胡蘿卜素的存在下，動(dòng)力學(xué)過(guò)程被明顯地抑制。

2.5 AFM觀察生物大分子之間相互作用

除了活細(xì)胞層面的相互作用，生物大分子之間相互作用也能深刻反映出生命活動(dòng)的本質(zhì)。

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的承擔(dān)者，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，調(diào)節(jié)著人體內(nèi)各種生命現(xiàn)象的過(guò)程，作為遺傳物質(zhì)的基因也必須經(jīng)過(guò)蛋白表達(dá)之后才能體現(xiàn)遺傳形狀。Yokokawa等[20]研究了細(xì)胞內(nèi)與蛋白質(zhì)折疊調(diào)節(jié)相關(guān)的分子伴侶的行為。GroEL是大腸桿菌中的一種分子伴侶，而GroES是它的輔分子伴侶。當(dāng)GroES與GroEL結(jié)合后，AFM圖像顯示它能誘導(dǎo)近端GroEL的一個(gè)構(gòu)型變化，增加中心孔洞的體積。當(dāng)中心孔洞可以與不成熟蛋白接觸時(shí)，在ATP下可以看到GroEL分子由閉環(huán)狀態(tài)變成開(kāi)啟的狀態(tài)。AFM所得的數(shù)據(jù)也可以清晰顯示出開(kāi)啟形態(tài)的GroEL比閉合的有更高的結(jié)構(gòu)。

在生物體內(nèi)，DNA與蛋白質(zhì)間的相互作用有著同樣舉足輕重的地位。在轉(zhuǎn)錄、翻譯的過(guò)程中，DNA與特定的蛋白質(zhì)如解旋酶、聚合酶、啟動(dòng)因子等的結(jié)合就決定著生命活動(dòng)的開(kāi)啟。Gilmore等[21]利用AFM以每500ms拍攝1次的速度，清晰地觀察到了蛋白質(zhì)在DNA上的結(jié)合情況。因此，AFM可以真正幫助我們深入地“看到”生命活動(dòng)的本質(zhì)。

2.6 AFM測(cè)定細(xì)胞電學(xué)性質(zhì)

細(xì)胞不論在靜止?fàn)顟B(tài)還是活動(dòng)狀態(tài)，都會(huì)產(chǎn)生與生命狀態(tài)密切相關(guān)的、有規(guī)律的電現(xiàn)象，生物電信號(hào)包括靜息電位和動(dòng)作電位，其本質(zhì)是離子的跨膜流動(dòng)。因此，研究細(xì)胞的電生理學(xué)也成為了生命科學(xué)領(lǐng)域一個(gè)重要的分支。

張文曉[22]在AFM系統(tǒng)中增加了導(dǎo)電模塊，在迎春花細(xì)胞、酵母菌細(xì)胞等樣品和探針之間加一個(gè)偏壓，在掃描的過(guò)程中，同時(shí)獲得樣品的表面形貌和電流像，且在成像的同時(shí)檢測(cè)探針和細(xì)胞樣品之間的電流(如圖3)，得到樣品表面形貌和局域電流分布及兩者之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)AFM在納米尺度上對(duì)細(xì)胞樣品電學(xué)特性的分析檢測(cè)。同個(gè)細(xì)胞的不同位置所體現(xiàn)的細(xì)胞導(dǎo)電性是有所差異的，細(xì)胞核、細(xì)胞器所在的位置與細(xì)胞質(zhì)的導(dǎo)電性有所差別，細(xì)胞中間部分與細(xì)胞膜邊緣的導(dǎo)電性也不盡相同?？梢詫⒄麄€(gè)細(xì)胞的導(dǎo)電性看作一個(gè)滑動(dòng)變阻器，而AFM探針可以針對(duì)各個(gè)阻值進(jìn)行測(cè)量。因此，基于AFM探針對(duì)同一個(gè)細(xì)胞的不同位置進(jìn)行測(cè)量，為檢測(cè)癌細(xì)胞等可能出現(xiàn)的多核現(xiàn)象提供了可能。

3 AFM應(yīng)用遇到的主要問(wèn)題

隨著納米技術(shù)的不斷深入發(fā)展，研究人員對(duì)AFM儀器的功能要求越來(lái)越高。AFM在生命科學(xué)領(lǐng)域的表征、測(cè)量以及操作方面的不足主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。首先是定位精度不高。由于機(jī)械加工技術(shù)的限制，作為驅(qū)動(dòng)器的壓電陶瓷存在著遲滯、蠕變等非線性因素導(dǎo)致定位準(zhǔn)確性不夠好。當(dāng)成像速度、掃描范圍加大的時(shí)候，非特異性識(shí)別的現(xiàn)象就更加明顯[23]。其次是成像速度較慢。由于駐點(diǎn)掃描的成像原理，AFM的成像速度不及傳統(tǒng)的顯微鏡。另一方面，AFM內(nèi)嵌的控制與成像算法尚未達(dá)到超高速掃描的要求。此外，由于微懸臂在幾何結(jié)構(gòu)上的二態(tài)構(gòu)造導(dǎo)致的不對(duì)稱(chēng)，當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)掃描樣品的時(shí)候會(huì)產(chǎn)生針尖的漂移[24]。AFM工作時(shí)，一般要求生物樣品被放置在平的云母基底上且需要被固定住。但在研究動(dòng)力學(xué)過(guò)程時(shí)，固定化就會(huì)在一定程度上阻止正常的生物活動(dòng)，導(dǎo)致這些過(guò)程的三維結(jié)構(gòu)很難被拍攝到。因此在動(dòng)力學(xué)AFM的研究中，固定分子的技術(shù)有著很大的講究，必須保證分子依然可以在空間上自由，保持接近生理學(xué)狀態(tài)[21]。此外，針尖的尺寸也是影響圖像質(zhì)量的重要因素。越粗糙的樣品，受針尖尺寸的影響越明顯。針尖尺寸越小，表面形貌越不失真，但是尺寸越小，技術(shù)難度越大。

圖3 AFM導(dǎo)電模塊示意圖

Fig 3 Schematic diagram of the Conductive Module

4 針對(duì)傳統(tǒng)AFM的技術(shù)改進(jìn)

基于傳統(tǒng)的AFM存在的一些技術(shù)上的瓶頸，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外眾多團(tuán)隊(duì)致力于在硬件和軟件上進(jìn)行改善，取得了一定的成果和進(jìn)展。

4.1 AFM與其他顯微技術(shù)和設(shè)備結(jié)合

Chaudhuri等[25]用側(cè)視熒光顯微鏡和AFM結(jié)合，觀察負(fù)載軸上細(xì)胞變形和細(xì)胞骨架的重排。實(shí)驗(yàn)可觀察到細(xì)胞形狀的變化、力誘導(dǎo)的破裂導(dǎo)致的細(xì)胞形狀的相關(guān)變化以及在細(xì)胞間粘連的過(guò)程中細(xì)胞膜絲形成的過(guò)程。測(cè)量細(xì)胞收縮力的時(shí)候，還可以觀察細(xì)胞骨架的重排以及應(yīng)力纖維的形成。SR超分辨率熒光顯微鏡已經(jīng)超越了傳統(tǒng)的熒光顯微鏡，它的橫向分辨率已經(jīng)可以達(dá)到納米級(jí)別。比如雙色受激發(fā)射損耗(STED)顯微鏡。把STED與AFM結(jié)合，STED共聚焦圖像相當(dāng)于用作AFM移動(dòng)的地圖，讓AFM找到目標(biāo)分子或者細(xì)胞[26]。目前，也有“隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡”(STORM)與AFM配合的，可以拍攝出單分子水平的圖像。Suzuki等[27]對(duì)AFM的工作模式進(jìn)行了改造，使得固定在微懸臂上的探針在XY方向掃描 ，而不是樣品臺(tái)在XY方向掃描。這就意味著“解放”了樣品，使其可以被放到透明的基底上，用熒光或者可見(jiàn)光去研究，用倒置的光學(xué)顯微鏡去看。

4.2 高速AFM

近年來(lái)應(yīng)用較為廣泛的是響應(yīng)速度更快的壓電驅(qū)動(dòng)器。它可以提升AFM的掃描速度，使得AFM成像的時(shí)間間隔更小，在一定程度上趨近實(shí)時(shí)圖像；或通過(guò)重新設(shè)計(jì)掃描器結(jié)構(gòu)，從機(jī)械結(jié)構(gòu)上降低水平方向振動(dòng)對(duì)豎直方向的耦合影響，進(jìn)而提高了高速掃描時(shí)的成像精度。日本金澤大學(xué)的科研團(tuán)隊(duì)則使用3塊壓電陶瓷分別控制樣品臺(tái)3個(gè)方向上的運(yùn)動(dòng)，取代了運(yùn)動(dòng)耦合誤差較大的管式掃描器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)活性蛋白的連續(xù)成像[28]。

4.3 探針針尖的修飾與改造

Shibata等[29]用無(wú)定型碳做了一個(gè)極長(zhǎng)(3 μm)極薄(直徑5～8 nm)的針尖，讓它在力常數(shù)為200 pN·nm-1的軟微懸臂上垂直生長(zhǎng)。這種新型的設(shè)計(jì)可以使得微懸臂在輕敲模式(自由振幅約為100 nm，頻率為800 kHz)下掃描的時(shí)候，與細(xì)胞之間的碰撞達(dá)到最小，同時(shí)成像時(shí)保持較高的空間分辨率。用該設(shè)備觀察mEGFP轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞表面形態(tài)動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)它對(duì)細(xì)胞的成像可以保持1 h以上，不對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生任何明顯的損傷。同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的前緣有膜的褶皺、延伸以及絲狀偽足的回縮。這種長(zhǎng)期的成像穩(wěn)定性可以把細(xì)胞對(duì)于外界刺激的形態(tài)學(xué)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)可視化，比如在靶向給藥或者受體配體相結(jié)合的過(guò)程中，就需要長(zhǎng)期穩(wěn)定的監(jiān)測(cè)。將該設(shè)備與高級(jí)光學(xué)顯微鏡結(jié)合，還可以進(jìn)一步證實(shí)蛋白質(zhì)功能以及細(xì)胞活動(dòng)，甚至了解更多分子作用以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的信息。

4.4 算法改進(jìn)

除了在硬件上對(duì)AFM設(shè)備進(jìn)行改進(jìn)，研究人員同樣致力于改善內(nèi)嵌的控制算法。針對(duì)微懸臂在持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間掃描的過(guò)程中產(chǎn)生的漂移問(wèn)題，Spagnoli等[24]開(kāi)發(fā)了一種叫作Stick-and-Move(SaM) Routine的新算法，使微懸臂首先掃描細(xì)胞表面的興趣位置，直到達(dá)到了一定的力的限度(一般是100 pF)然后被拉回基底，再測(cè)一個(gè)力與距離的曲線。信號(hào)代表了兩個(gè)峰，一個(gè)是接觸基底，一個(gè)是接觸細(xì)胞。用Python語(yǔ)言進(jìn)行數(shù)據(jù)分析之后，可以在細(xì)胞位置的峰上減去基底的峰，同樣得到持續(xù)掃描樣品的等價(jià)信號(hào)，從而進(jìn)行力-距離曲線的分析。除了針對(duì)單細(xì)胞分析過(guò)程中的算法改進(jìn)，張文曉[22]解決了原子力探針在對(duì)同種類(lèi)大量活體細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)測(cè)量的過(guò)程中，耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)會(huì)減少細(xì)胞存活率或是細(xì)胞分裂引起的目標(biāo)混亂的問(wèn)題。主要是采用“蟻群算法”對(duì)探針進(jìn)行路徑的最優(yōu)規(guī)劃，使探針行走的路徑最短，用時(shí)最少。

5 總結(jié)與展望

AFM能在固體表面達(dá)到微納級(jí)別的分辨率，也可以在接近生理狀態(tài)的液體環(huán)境內(nèi)工作，因此可以被用于生物樣本比如蛋白質(zhì)、核酸、膜磷脂甚至是在生理過(guò)程中的活細(xì)胞的檢測(cè)。AFM作為一種高分辨率的形貌表征工具，可以很好地輔助生命科學(xué)研究中的定性、可視化分析，使得生命過(guò)程更加清晰直觀。盡管仍存在不完善之處，但未來(lái)若從改善針尖尺寸、開(kāi)發(fā)雙探針甚至多探針系統(tǒng)[30]、提高掃描速度以及選用機(jī)械性能更加優(yōu)良的探針材料等方面作出努力，相信AFM能更好地為我們所用，幫助我們更透徹地理解紛繁復(fù)雜的生命系統(tǒng)。

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2014-04-13

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國(guó)家重大科學(xué)計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2011CB933500)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(61127002)

鞠安(1994-)，女，江蘇南通人，在讀本科生。E-mail:chris.ju@qq.com

顧寧 E-mail:guning@seu.edu.cn

鞠安，蔣雯，許陽(yáng)，等.原子力顯微鏡在生命科學(xué)領(lǐng)域研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2015，34(5)：807-812．

Q-336

A

1671-6264(2015)05-0807-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.028