hOGG1重組腺病毒載體在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的表達(dá)及其抗氧化應(yīng)激作用研究

周燕，高大慶，欒潔

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 眼科，江蘇 南京 210009)

·論 著·

hOGG1重組腺病毒載體在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的表達(dá)及其抗氧化應(yīng)激作用研究

周燕1，高大慶1，欒潔2

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 眼科，江蘇 南京 210009)

目的：觀察重組腺病毒pAd-CMV5-DEST-hogg1轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19后，高表達(dá)hOGG1對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷中的作用。方法：鑒定和包裝重組腺病毒pAd-CMV5-DEST-hogg1和腺病毒載體對照pAd/CMV/V5-GW/lacZ，并分別轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞。H2O2(100 μmol·L-1，2 h)干預(yù)轉(zhuǎn)染重組腺病毒的ARPE-19細(xì)胞(RPE-Ad-hogg1)、轉(zhuǎn)染腺病毒載體對照的ARPE-19細(xì)胞(RPE-Ad-lacZ)以及未轉(zhuǎn)染病毒的ARPE-19細(xì)胞。蛋白免疫印跡法檢測3組細(xì)胞hOGG1的表達(dá)量；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量；免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測氧化損傷標(biāo)志性終產(chǎn)物8-羥基鳥嘌呤(8-oxodG)的形成量。結(jié)果：重組腺病毒pAd-CMV5-DEST-hogg1包裝成功，并在ARPE-19細(xì)胞中表達(dá)；高表達(dá)hOGG1的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞較兩對照組細(xì)胞顯示出更少的ROS生成量(P<0.05)、更低的8-oxodG氧化損傷程度(P<0.01)。結(jié)論：視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞hOGGl蛋白高表達(dá)，可提高ARPE-19細(xì)胞堿基水平的修復(fù)能力。

視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞； 人8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶； 8-羥基鳥嘌呤； 氧化損傷

內(nèi)外界因素引起的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的失衡會引起諸如糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)等許多眼底疾病[1-2]，而多數(shù)視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生為慢性過程，早期癥狀不明顯，難以通過篩查明確診斷，并且發(fā)生氧化損傷后的組織病理改變具有一定的不可逆性[3]，因此通過有關(guān)視網(wǎng)膜細(xì)胞氧化損傷發(fā)病機制的研究來指導(dǎo)臨床診斷和治療顯得尤為重要。

hOGG1(human 8-oxoguanine DNA glycosylase)由染色體3p25區(qū)域來編碼，可以特異性切除并修復(fù)氧化損傷的標(biāo)志性終產(chǎn)物8-羥基鳥嘌呤(8-oxoguanine，8-oxodG)[4]，該基因在氧化損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。Audebert等[5]分析hOGG1的編碼產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)其mRNA初級產(chǎn)物末端可經(jīng)不同的修飾表達(dá)成至少兩種不同定位的蛋白——定位于細(xì)胞核的α-hOGG1和定位于線粒體的β-hOGG1[6]。線粒體是有效的堿基切除修復(fù)8-oxodG發(fā)生的場所[7]，且β-hOGG1發(fā)揮的堿基切除修復(fù)是線粒體內(nèi)DNA氧化損傷唯一的修復(fù)方式。

本實驗通過鑒定hOGG1腺病毒重組表達(dá)載體在293A細(xì)胞中包裝成功后轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞，研究高表達(dá)hOGG1的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ARPE-19細(xì)胞、人胚胎腎細(xì)胞293A、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由東南大學(xué)微生物免疫實驗室保存，pAd-CMV5-DEST-hogg1重組腺病毒質(zhì)粒由東南大學(xué)微生物免疫實驗室構(gòu)建和保存，質(zhì)粒提取試劑盒購自Anxgen公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 2000、PacⅠ內(nèi)切酶購自美國Invitrogen公司，DMEM高糖培養(yǎng)基及DMEM F12(1∶1)購自GIBCO公司，胎牛血清購自維森特公司，ROS檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，hOGG1抗體、8-oxodG購自Abcam公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠IgG購自南京生興生物公司。

1.2 pAd-CMV5-DEST-hogg1腺病毒質(zhì)粒的擴(kuò)增和293A細(xì)胞包裝病毒

PCR鑒定pAd-CMV5-DEST-hogg1腺病毒質(zhì)粒，鑒定引物(5′-3′)：T7 上游引物:TAATACGACTCACTA

TAGGG;V5(C-term) 下游引物:ACCGAGGAGAGGGT

TAGGGAT。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性，42 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。pAd-CMV5-DEST-hogg1重組腺病毒質(zhì)粒、載體對照pAd/CMV/V5-GW/lacZ分別轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉的LB平板(LA)，37 ℃過夜，挑取陽性克隆8個，于LA培養(yǎng)基中搖菌過夜，堿裂解法提取質(zhì)粒。質(zhì)粒Pac Ⅰ酶線性化后乙醇沉淀的方法純化質(zhì)粒。

取1 μg純化后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，24 h后換液，10 d左右收取細(xì)胞，反復(fù)凍融取上清。293A細(xì)胞擴(kuò)增病毒，空斑試驗測定病毒滴度。

1.3 重組腺病毒pAd-CMV5-DEST-hogg1在ARPE-19細(xì)胞中的表達(dá)

測定病毒滴度后與載體對照分別以感染復(fù)數(shù)(MOI)30∶1轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞，設(shè)ARPE-19細(xì)胞空白對照，2 h后更換培養(yǎng)基，24 h后收集細(xì)胞、裂解細(xì)胞、離心提取細(xì)胞總蛋白，水煮變性后BCA蛋白定量。等量蛋白SDS-PAGE凝膠電泳80 V 30 min、120 V 40 min，恒流2 h轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%BSA封閉1 h，TBST洗膜5 min 3次，hOGG1抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜5 min 5次，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫1 h，TBST洗膜5 min 5次，ECL顯色。

1.4 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測不同濃度H2O2干預(yù)后的存活率

生長對數(shù)期的ARPE-19細(xì)胞消化離心后完全培養(yǎng)基重懸，104·孔-1鋪96孔板，12 h后不同濃度H2O2(20、50、100、200、500、1 000 μmol·L-1)干預(yù)貼壁的ARPE-19細(xì)胞2 h，設(shè)不予干預(yù)對照組和培養(yǎng)液空白對照組，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。2 h后每孔加MTT(5 mg·ml-1)20 μl，CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。4 h后棄去孔板中的培養(yǎng)液，加DMSO 150 μl·孔-1，振蕩10 min后酶標(biāo)儀570 nm處測各孔吸光值(A值)。

1.5 H2O2誘導(dǎo)hOGG1表達(dá)不同ARPE-19細(xì)胞組內(nèi)源性ROS生成、免疫組化檢測8-oxodG形成的陽性細(xì)胞數(shù)

腺病毒pAd-CMV5-DEST-hogg1、pAd/CMV/V5-GW/lacZ分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，以100 μmol·L-1H2O2干預(yù)2 h，然后用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化細(xì)胞至1.5 ml Ep管中，加熒光探針DCFH-DA染色30 min，PBS洗3次，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞平均熒光強度。

4%多聚甲醛4 ℃固定30 min；PBS洗3次。3%的H2O2室溫孵育10 min。PBS洗3次，5% BSA 37 ℃封閉15 min。一抗(8-oxodG，1∶200倍稀釋)4 ℃過夜。PBS洗3次，加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，PBS洗3次，室溫DAB顯色，鏡下控制顯色時間。蒸餾水沖洗終止，蘇木精復(fù)染2 min。鹽酸酒精分化，流水終止，體積分?jǐn)?shù)70%、95%、100%乙醇梯度脫水各5 min，二甲苯透明2 min，晾干封片鏡檢。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 pAd-CMV5-DEST-hogg1腺病毒質(zhì)粒的DNA電泳鑒定、擴(kuò)增和線性化

PCR鑒定重組腺病毒載體pAd-CMV5-DEST-hogg1(圖1)，片段大小約為1 240 bp。

1.DL2000 DNA 標(biāo)記； 2.hogg1基因片段

圖1 PCR鑒定hogg1基因片段

2.2 重組腺病毒 pAd-CMV5-DEST-hogg1在ARPE-19細(xì)胞中的表達(dá)

pAd-CMV5-DEST-hogg1、pAd/CMV/V5-GW/lacZ測定滴度后以MOI 30∶1轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞24 h，ARPE-19細(xì)胞為空白對照，消化細(xì)胞，蛋白裂解液冰上裂解30 min，離心取上清。定量后每孔蛋白15 μg上樣，蛋白免疫印跡法檢測hOGG1的表達(dá)，β-肌動蛋白為內(nèi)參。結(jié)果(圖2)顯示，轉(zhuǎn)染pAd-CMV5-DEST-hogg1的RPE細(xì)胞hOGG1的表達(dá)明顯高于其他兩組，條帶大小正確，轉(zhuǎn)染pAd-CMV5-DEST-hOGG1的ARPE-19細(xì)胞能夠表達(dá)hOGG1。

1.RPE-Ad-hogg1細(xì)胞； 2.RPE-Ad-lacZ細(xì)胞； 3.ARPE-19細(xì)胞

圖2 pAd-CMV5-DEST-hogg1、pAd/CMV/V5-GW/lacZ轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞后hOGG1表達(dá)情況

2.3 不同濃度H2O2干預(yù)后ARPE-19細(xì)胞的存活率

酶標(biāo)儀測得各孔A值。發(fā)現(xiàn)ARPE-19細(xì)胞存活率隨著H2O2濃度的增加而逐漸降低，存活率分別為(91.20±0.535 4)%、(88.08±1.880)%、(77.80±4.513)%、(58.80±0.141 7)%、(53.62±2.774)%、(47.67±1.515)%。說明H2O2可以誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞氧化損傷反應(yīng)的產(chǎn)生，同時降低了ARPE-19細(xì)胞的存活率。選擇H2O2濃度為100 μmol·L-1干預(yù)ARPE-19細(xì)胞2 h誘導(dǎo)細(xì)胞的氧化損傷。

2.4 hOGG1表達(dá)不同ARPE-19細(xì)胞對H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷的反應(yīng)

重組腺病毒pAd-CMV5-DEST-hogg1、pAd/CMV/V5-GW/lacZ分別轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞，得到高表達(dá)hOGG1細(xì)胞組RPE-Ad-hogg1、載體對照組RPE-Ad-lacZ，以正常ARPE-19細(xì)胞為空白對照，共3組。

H2O2(100 μmol·L-1，2 h) 作用于3組細(xì)胞，以正常ARPE-19細(xì)胞為空白對照，共4組。

流式細(xì)胞儀檢測不同hOGG1表達(dá)組RPE細(xì)胞對H2O2引起的氧化損傷過程中細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量(圖3)，4組細(xì)胞ROS產(chǎn)生MEAN值分別為80.09±2.997 0、191.8±0.790 1、101.1±0.222 6、296.4±1.046 0。結(jié)果(圖4)顯示，H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞內(nèi)源性ROS的產(chǎn)生的MEAN明顯高于ARPE-19細(xì)胞空白對照組(P<0.000 1)；H2O2干預(yù)的RPE-Ad-lacZ細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量明顯高于干預(yù)未轉(zhuǎn)染組(P<0.000 1)；H2O2干預(yù)的RPE-Ad-hogg1細(xì)胞較干預(yù)的RPE-Ad-lacZ細(xì)胞相比，高表達(dá)hOGG1組ROS產(chǎn)生量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)。

2.5 8-oxodG免疫組化

每組細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔，染色后拍照，見圖5。

A.ARPE-19細(xì)胞； B.H2O2干預(yù)的未轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞； C.H2O2干預(yù)的RPE-Ad-hogg1細(xì)胞； D.H2O2干預(yù)的RPE-Ad-lacZ細(xì)胞

圖3 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞ROS產(chǎn)生量

圖4 各組ROS產(chǎn)生MEAN統(tǒng)計 a、b、cP<0.0001

計數(shù)每張細(xì)胞片5個鏡下、每個鏡下100個細(xì)胞，總計500個。陽性細(xì)胞呈棕黃色，分布于胞核、胞質(zhì)。計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：染色陰性(-，著色<25%)；弱陽性(+，著色25%～50%)；中等陽性(++，著色51%～75%)；強陽性(+++，著色>75%)。為便于統(tǒng)計，將著色分為陰性(-)、陽性(+、++、+++)兩組。陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)統(tǒng)計結(jié)果：4組細(xì)胞陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為(22.8±1.474 0)%、(39.6±0.529 2)%、(25.73±0.405 5)%、(62.33±2.146 0)%。結(jié)果顯示，ARPE-19細(xì)胞高表達(dá)hOGG1與腺病毒載體對照相比，對外源性H2O2引起DNA氧化損傷具有更強的修復(fù)能力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

結(jié)果(圖6)顯示，H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞形成8-oxodG的陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于ARPE-19細(xì)胞空白對照組(P<0.001)；H2O2干預(yù)的RPE-Ad-lacZ細(xì)胞形成8-oxodG的陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于干預(yù)未轉(zhuǎn)染組(P<0.001)；H2O2干預(yù)的RPE-Ad-hogg1細(xì)胞較干預(yù)的RPE-Ad-lacZ細(xì)胞相比，RPE-Ad-hogg1細(xì)胞組形成8-oxodG的陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.000 1)。

3 討 論

氧化應(yīng)激是引起視網(wǎng)膜細(xì)胞功能障礙的重要因素之一，容易誘發(fā)眼底組織和細(xì)胞的缺血缺氧、新生血管的生成，是許多眼底疾病發(fā)生發(fā)展的主要病理機制[8]。生理狀態(tài)下，機體對氧化損傷具有多重修復(fù)系統(tǒng)，包括堿基切除修復(fù)、同源重組修復(fù)等。hOGG1是堿基切除修復(fù)的關(guān)鍵酶，具有DNA糖苷酶和AP裂解兩種活性，特異性識別并切除受損核苷酸上的糖苷鍵(8-oxodG)，形成AP位點；核酸內(nèi)切酶切除并移去包括AP位點在內(nèi)的小片DNA片段，聚合酶和連接酶完成修復(fù)過程[9]。Blasiak等[10]研究發(fā)現(xiàn)，年齡相關(guān)性黃斑變性患者的易感性與DNA修復(fù)酶hOGG1的基因多態(tài)性相關(guān)。許多眼科缺血缺氧性病變伴隨者DNA修復(fù)酶hOGG1表達(dá)的改變[11-12]。

A.ARPE-19細(xì)胞； B.H2O2干預(yù)的未轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞； C.H2O2干預(yù)的RPE-Ad-hogg1細(xì)胞； D.H2O2干預(yù)的RPE-Ad-lacZ細(xì)胞

圖5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測8-oxodG的形成(黑箭頭所示) ×400

圖6 形成8-oxodG陽性細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計 a、cP<0.001；bP<0.000 1

本實驗鑒定和包裝了重組腺病毒hOGG1表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞之后蛋白免疫印跡法檢測到hOGG1在ARPE-19細(xì)胞的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)高表達(dá)hOGG1的ARPE-19細(xì)胞對H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有更好的耐受性，ROS產(chǎn)生量降低，對DNA損傷產(chǎn)物8-oxodG的修復(fù)功能增強。同時推測ARPE-19細(xì)胞氧化損傷的發(fā)生可能與該細(xì)胞對腺病毒載體的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，印證了hOGG1在眼底疾病氧化損傷的病理機制中的重要修復(fù)作用。

氧化損傷往往伴隨凋亡的發(fā)生[13]。我們推測視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞受到光照、高糖環(huán)境、缺血缺氧等損傷后啟動了細(xì)胞內(nèi)的凋亡程序。hOGG1的DNA修復(fù)作用增強從一定程度上抑制這一程序性細(xì)胞死亡的發(fā)生。但是這一推測有待于進(jìn)一步的實驗探討和驗證。本實驗即為驗證這一推測提供了體外的模型基礎(chǔ)。

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The expression of recombinant adenovirus-hOGG1 vector in human retinal pigment epithelial cells and its anti-oxidative effect

ZHOU Yan1，GAO Da-qing1，LUAN Jie2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.DepartmentofOphthalmology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To study the effect of hOGG1 on human retinal pigment epithelial cells in H2O2induced oxidative stress， by observing pAd-CMV5-DEST-hogg1 transfecting APRE-19. Methods: Construct recombinant adenovirus pAd-CMV5-DEST-hogg1， control adenovirus vector pAd/CMV/V5-GW/lacZ， and transfect them into ARPE-19 cells(RPE-Ad-hogg1， RPE-Ad-lacZ) respectively. The two cell lines，together with a normal ARPE-19 cell strain， were treated by H2O2(100 μmol·L-1，2 h). The oxygen free radicals (ROS) production was detected by Flow Cytometry(FCM). Immunohistochemisty assessed 8-oxoguanine(8-oxodG)，which is the oxidative damage end products. Results: The construction and packaging of recombinant adenovirus-hogg1 vector were successful， and it could be expressed in ARPE-19 cells. ARPE-19 cells with high hOGG1 expression had a lower ROS and 8-oxodG production(P<0.05) and lower degree of oxidational damage on 8-oxodG.Conclusion: A high expression of hOGG1 in ARPE-19 cells can reduce the degree of oxidative stress induced by H2O2．

retinal pigment epithelium cells； 8-oxoguanine DNA glycosylase； 8-oxoguanine； oxidative stress

2015-03-03

2015-05-17

周燕(1989-)，女，江蘇鹽城人，在讀碩士研究生。E-mail:zhouyan3916@163.com

欒潔 E-mail：luanqiu10@163.com

周燕，高大慶，欒潔.hOGG1重組腺病毒載體在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的表達(dá)及其抗氧化應(yīng)激作用研究[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2015，34(5)：783-788．

A

1671-6264(2015)05-0783-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.022