兩種不同來源血小板進行基于光子晶體技術(shù)的血小板抗體檢測的對比研究

凌云，孔欣，陳寶安

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 血液科，江蘇 南京 210009； 2.蘇州大學(xué) 附屬第三醫(yī)院，常州市第一人民醫(yī)院，江蘇 常州 313000)

·論 著·

兩種不同來源血小板進行基于光子晶體技術(shù)的血小板抗體檢測的對比研究

凌云1，2，孔欣2，陳寶安1

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 血液科，江蘇 南京 210009； 2.蘇州大學(xué) 附屬第三醫(yī)院，常州市第一人民醫(yī)院，江蘇 常州 313000)

目的：比較分別由濃縮血小板、新鮮血液分離血小板所得血小板裂解液，行光子晶體技術(shù)檢測血小板抗體的效率。方法：檢測樣本為原發(fā)免疫性血小板減少癥(ITP)患者32例和正常健康人對照31例。對來源于濃縮血小板和新鮮血液分離的血小板同時進行基于光子晶體技術(shù)的血小板特異性抗體檢測及單克隆抗體特異性血小板抗原固定術(shù)(MAIPA)檢測，以MAIPA檢測結(jié)果作為光子晶體技術(shù)檢測結(jié)果的參照。結(jié)果：兩組不同來源的血小板行光子晶體的血小板抗體檢測敏感性均高于MAIPA，且濃縮血小板組更高。新鮮血液分離組特異性高于MAIPA，濃縮血小板組低于MAIPA。結(jié)論：使用新鮮血液分離采集血小板行光子晶體技術(shù)檢測血小板特異性抗體效率較高。

血小板來源； 血小板抗體； 液相芯片技術(shù)

原發(fā)免疫性血小板減少癥(idiopathic thrombocytopenic，ITP)是由機體免疫系統(tǒng)功能紊亂引起血小板破壞增加而致數(shù)目減少的自身免疫性出血性疾病，主要系血小板特異性抗體介導(dǎo)血小板破壞引起的血小板數(shù)量減少所致。血小板抗體的產(chǎn)生是引起ITP病人血小板減少及巨核細胞成熟障礙的重要原因。血小板特異性抗體主要包括血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ⅱb/Ⅲa抗體、Ⅰb/Ⅸ抗體，少數(shù)表現(xiàn)為GPⅠa/Ⅱa、GPⅣ等抗體[1]。同一患者體內(nèi)可同時檢測到多種抗體。本實驗采用先進的光子晶體(photonic crystal)技術(shù)進行血小板特異性抗體檢測的研究，對兩種不同來源血小板的檢測結(jié)果進行比較，探究何種方法可以獲取最佳的檢測效率。

1 材料與方法

1.1 研究對象

初治患者血清標(biāo)本32例均取自蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院2011至2012年收治的患者，根據(jù)臨床癥狀診斷為特發(fā)性血小板減少性紫癜，部分伴有感染發(fā)燒癥狀，血小板有不同程度的降低，沒有輸血史。正常對照血清標(biāo)本31例取自2014年東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院門診健康體檢者，無相關(guān)的血液系統(tǒng)疾病，其血小板計數(shù)均在正常范圍。

1.2 主要試劑與儀器

4種包被單克隆抗體的光子晶體微載體[東南大學(xué)生物電子學(xué)國家重點實驗室制備，由其獨特的結(jié)構(gòu)色進行編碼，包被的4種單克隆抗體分別為抗GPⅨ單克隆抗體(SZ1)、GPⅠb mAb(SZ2)、GPⅡb mAb(SZ22)和GPⅢa mAb(SZ21)]；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗人IgG(FITC-goat-anti-human IgG，美國Jackson公司);牛血清白蛋白(BSA，美國Sigma公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)、0.05% twain-20的磷酸鹽緩沖液(PBST，pH 7.4)由東南大學(xué)生物電子學(xué)國家重點實驗室配置；倒置熒光顯微鏡(Olympus，型號BX53);數(shù)字成像系統(tǒng)(Olympus，型號DP73)。

1.3 光子晶體檢測血小板特異性抗體方法

1.3.1血小板采集 將血小板分為A、B兩組：A組為濃縮血小板組，B組為新鮮血液分離組。A組血小板取自紅細胞類型為“O”型健康成年人，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，通過差速離心分離血小板；B組血小板取自輸注濃縮血小板病人輸注后輸液管中殘余的血小板。血小板用PBS/EDTA液洗滌， 3 000 r·min-1離心5 min，沉淀血小板用吸管吹勻，重復(fù)3次。最終用PBS/EDTA液重新懸浮血小板，測血小板濃度并調(diào)整血小板濃度為1×109個·ml-1。

1.3.2血小板裂解液的制備 方法同MAIPA，將濃度為1×109個·ml-1的血小板移至1.5 ml EP管中，每管100 μl，約含血小板1×108個。每管加入100 μl ITP患者待測血漿，混勻后室溫孵育60 min。加0.6 ml PBS/EDTA，混勻后上離心機3 000 r·min-1離心2 min，棄去上清，再加0.6 ml PBS/EDTA，吹勻血小板，洗滌離心，再重復(fù)2次。第3次離心后扣干上清。每管加入TritonX-100裂解液100 μl溶解血小板，震蕩混勻，置于4 ℃搖床孵育30 min。4 ℃下13 000 r·min-1離心40 min分離裂解液，以去除不溶解的物質(zhì)。離心后取上清90 μl，用360 μl稀釋緩沖液稀釋，血小板裂解液即配置完成(圖1)。

圖1 血小板裂解原理圖

Fig 1 Schematic diagram of platelet lysate

1.3.3光子晶體微載體檢測血小板抗體 在EP管中加入4種包被單克隆抗體的光子晶體微載體各5個，加入裂解液200 μl，置于室溫搖床上孵育30 min，PBST洗滌3次，PBS洗滌3次，抽干，加入濃度為0.1 mg·ml-1的FITC-羊抗人IgG 20 μl，室溫搖床孵育30 min，PBST和PBS先后洗滌3次。

1.3.4熒光分析 將最終洗滌好的光子晶體微載體置于正置熒光顯微鏡觀察，cellSens Standard軟件測量并記錄數(shù)據(jù)，由于此軟件可測量灰度值，所以本實驗以灰度值來代替熒光值作為實驗數(shù)據(jù)。使用自然光源區(qū)分光子晶體結(jié)構(gòu)色以確定其編碼，關(guān)閉自然光源并遮擋周圍多余光線，用藍色熒光激發(fā)，檢測并記錄每個光子晶體的灰度值，每組同種類5個光子晶體求平均值作為最終實驗結(jié)果。陽性取值為10個陰性取值的平均數(shù)加2倍標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4 單克隆抗體特異性血小板抗原固定術(shù)(MAIPA)

根據(jù)國際生物標(biāo)準(zhǔn)基于Kiefel等[2]的方法，并依照1996年Stockelberg等[3]的方法對MAIPA進行了改良。使用病人血清與正常血小板的孵育裂解液代替病人血小板裂解液[4]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩組檢測數(shù)據(jù)比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組光子晶體血小板特異性抗體檢測敏感性及特異性與MAIPA檢測結(jié)果比較

將光子晶體微載體檢測A、B兩組血小板特異性抗體的結(jié)果與MAIPA檢測患者及正常對照者血清的結(jié)果進行比較。A、B組敏感性均高于MAIPA，B組敏感性高于A組。A組特異性低于MAIPA，B組特異性高于MAIPA。敏感性、特異性計算結(jié)果見表1。B組測得灰度值陽性均值與陰性值之比值(6.9∶1)較A組(5.4∶1)大。

表1 光子晶體微載體檢測A、B組與MAIPA檢測4種血小板自身抗體的敏感性及特異性

Tab 1 Sensitivity and specificity of group A and B based on photonic crystal microcarriers and MAIPA

單抗敏感性特異性MAIPAA組B組MAIPAA組B組SZ146.9%50.0%50.0%90.3%87.0%90.3%SZ234.4%43.7%37.5%93.5%93.5%96.7%SZ2140.6%96.7%84.4%83.9%77.4%90.3%SZ2231.3%87.1%75.0%93.5%83.9%93.5%

2.2 批內(nèi)變異和批間變異

將1例GPⅠb抗體陽性標(biāo)本同時用兩種方法重復(fù)檢測3組，測定批內(nèi)變異率。A組平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(變異系數(shù))為5.1%±4.7%，B組變異系數(shù)為4.77%±3.21%。將1例GPⅡb抗體陽性標(biāo)本用于測定批間變異，該血清在3 d內(nèi)用兩種方法同時檢測，測定批間變異率。A組批間變異系數(shù)為8.9%±6%，B組為8.3%±8.1%。

3 討 論

血小板自身抗體的檢測對ITP的診斷是至關(guān)重要的[5]。ITP患者血小板自身抗體水平的變化用于評估患者對治療的反應(yīng)也很重要[6]。國際上公認(rèn)且推廣的經(jīng)典方法為MAIPA，1987年由Kiefel等[2]報道，1996年Stockelberg等[3]對MAIPA進行了改良。但該方法操作復(fù)雜、耗時久，不便于臨床推廣。Nguyen等[7]在2004年報道了聯(lián)合檢測血小板特異性抗體(SASPA)，該方法使用3種帶有不同熒光標(biāo)記的聚苯乙烯微球，同時檢測3種不同血小板特異性抗體。但這些方法因為技術(shù)上的繁復(fù)、耗時和低敏感性而未在醫(yī)院廣泛使用[8]。

光子晶體技術(shù)近年來受到越來越多生物學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域研究者的關(guān)注[9-10]。多種新生物技術(shù)的開發(fā)，如酶活性的實時監(jiān)測、細胞形態(tài)學(xué)研究等，都采用光子晶體技術(shù)，且該技術(shù)可進行多重腫瘤標(biāo)志物的同時檢測。光子晶體編碼的微載體用于檢測表現(xiàn)出良好的敏感性、穩(wěn)定性及高通量的優(yōu)點[11]。

本研究中，我們采用光子晶體技術(shù)探索進行血小板特異性抗體檢測，比較何種血小板更適用于該檢測。兩組檢測批內(nèi)批間差異均在可接受范圍內(nèi)，兩組試驗均為有效實驗。其中濃縮血小板較易獲得，且濃度高、不易凝集，用于實驗較為便捷；而新鮮血液采集需健康志愿者提供，需每天采集新鮮血液，在洗滌濃縮過程中發(fā)生凝集較濃縮血小板多。A組較易濃縮到實驗濃度且血小板不易凝結(jié)，使得試驗中有效血小板量較大，獲得更高的陽性率，其中包括真陽性率及假陽性率都高于B組。A組雖然敏感性(43.7%～96.7%)高于B組(37.5%～84.4%)，但因假陽性率的升高使得特異性下降(77.4%～93.5%)，降低了檢測效率；B組特異性(90.3%～93.5%)略低于MAIPA(93.5%～100%)，而敏感性(37.5%～84.4%)高于MAIPA(31.2%～75.0%)，較MAIPA有更高的檢測效率。

綜上，在確診ITP患者時采用新鮮血液分離血小板進行光子晶體技術(shù)檢測血小板特異性抗體的方法更可靠；采用濃縮血小板檢測易于操作且更便捷，有更高的敏感性，可用于篩選是否存在血小板特異性抗體。

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Comparing the detections of platelet antibodies based on photonic crystal technology of platelets from two different sources

LING Yun1，2，KONG Xin2，CHEN Bao-an1

(1.DepartmentofHematology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 2.3rdAffiliatedHospital，SoochowUniversity，ChangzhouFirstPeople’sHospital，Changzhou213000，China)

Objective: To compare the efficiencies of detections of platelet antibodies based on photonic crystal technology of platelets lysate solution obtained from concentrated platelet sample and platelets separated from fresh blood. Methods: The samples for detection came from 32 primary immune thrombocytopenia(ITP) patients and 31 healthy subjects as the control group. MAIPA was used to examine all samples，and the result was used as a reference for the results of photonic crystal detection. Result: The sensitivity of the two different sources of platelet to the detection based on photonic crystals were both higher than MAIPA， especially for the platelet concentration group.The specificity of freshly isolated blood group was higher than MAIPA， and that of the platelet concentration group was lower than MAIPA. Conclusion: It is most efficient for the specificity antibodies in platelets separated from fresh blood to be examined with photonic crystal-based technology．

sources of platelets； platelet antibody； liquid chip technology

2015-02-09

2015-04-06

中國博士后科學(xué)基金面上項目(2012M511181)

凌云(1970-)，女，江蘇常州人，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士。E-mail:a110426007@hotmail.com

陳寶安 E-mail:cba8888@hotmail.com

凌云，孔欣，陳寶安.兩種不同來源血小板進行基于光子晶體技術(shù)的血小板抗體檢測的對比研究[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2015，34(5)：758-761．

R446

A

1671-6264(2015)05-0758-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.016