神經(jīng)激肽-1受體在GERD模型豚鼠咳嗽反射敏感性中的作用

劉娜，董榕，林勇，賴克方

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué) 生理藥理學(xué)系，江蘇 南京 210009； 3.東南大學(xué)附屬胸科醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，江蘇 南京 210029； 4.廣州醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510000)

·論 著·

神經(jīng)激肽-1受體在GERD模型豚鼠咳嗽反射敏感性中的作用

劉娜1，董榕2，林勇3，賴克方4

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué) 生理藥理學(xué)系，江蘇 南京 210009； 3.東南大學(xué)附屬胸科醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，江蘇 南京 210029； 4.廣州醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510000)

目的：探究胃食管反流性豚鼠模型肺組織神經(jīng)激肽-1受體(NK-1R)與咳嗽反射敏感性(CRS)之間的關(guān)系。方法：分組建模后評估豚鼠CRS，免疫組化染色檢測肺組織NK-1R的表達(dá)。結(jié)果：模型組CRS增加，肺內(nèi)NK-1R表達(dá)增加(108.48±25.71vs38.54±17.62，P<0.05)。肉毒毒素-A注射后較模型組咳嗽次數(shù)減少(23.33±7.53vs51.17±10.19，P<0.05)，NK-1R表達(dá)減少(21.59±13.45vs108.48±25.71，P<0.05)，潛伏時(shí)間未見改變(11.76±3.29vs8.24±4.73，P>0.05)。結(jié)論：胃食管反流性豚鼠氣道CRS增高可能與肺組織中NK-1R表達(dá)增加有關(guān)。

胃食管反流性疾??； 神經(jīng)激肽-1受體； 咳嗽反射敏感性； 肉毒毒素-A； 豚鼠

胃食管反流性疾病(gastroesophageal reflux disease，GERD)除伴有食管癥狀外，亦和咳嗽、哮喘、肺炎[1]等呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)?，F(xiàn)多認(rèn)為胃內(nèi)反流物刺激食管下端感受器，經(jīng)食管-支氣管反射致肺內(nèi)P物質(zhì)(substance P，SP)等神經(jīng)源性炎癥因子表達(dá)增加，產(chǎn)生神經(jīng)源性炎癥損傷氣道，從而更易產(chǎn)生呼吸系統(tǒng)癥狀。SP主要與神經(jīng)激肽-1受體(neurokinin-1 receptor，NK-1R)結(jié)合發(fā)揮作用。A型肉毒毒素(botulinum toxin-A，BTX-A)可阻斷神經(jīng)源性炎癥，且作用持久[2]。GERD豚鼠模型中氣道咳嗽反射敏感性(cough reflex sensitivity，CRS)的變化及肺內(nèi)NK-1R在其增高過程中的作用尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建豚鼠GERD模型，利用檸檬酸霧化評估造模前后CRS改變；在使用或不使用BTX-A下檢測肺內(nèi)NK-1R的表達(dá)，探討神經(jīng)源性炎癥因子受體NK-1R與GERD豚鼠氣道CRS之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性Hartly豚鼠，體重250～300 g，購自東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，在安靜、溫暖(18～25 ℃)、避強(qiáng)光、晝夜光照節(jié)律(明暗周期為14/10 h)下飼養(yǎng)。給予足量豚鼠飼料、飲食和適量青菜，保持墊料清潔干燥。

1.2 藥品與儀器

主要儀器：RM 6240 B型四道生理信號采集處理系統(tǒng)、聲能咳嗽記錄儀(成都儀器廠)，402 AI超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備公司)，5 F胃管、輸液裝置、脫色搖床(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)，冰凍切片機(jī)(Leica)，光學(xué)顯微鏡(Olympus)。

主要藥品與試劑：含0.5%胃蛋白酶(Sigma)的稀釋鹽酸(pH=1)：1 000 ml雙蒸水中滴入濃鹽酸，搖勻后調(diào)pH至1.0，加入5 g胃蛋白酶混勻4 ℃保存；兔抗NK-1R多克隆抗體、一水合檸檬酸、多聚甲醛(Sigma)，BTX-A(蘭州生物制品研究所)，氯胺酮注射液(福建古田藥業(yè))，SP-9001試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，烏拉坦(上海國藥集團(tuán))，PBS粉末(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1檸檬酸引咳 實(shí)驗(yàn)使用檸檬酸霧化激發(fā)豚鼠咳嗽，通過記錄咳嗽次數(shù)及咳嗽潛伏時(shí)間(從開始噴霧到第1聲咳嗽之間的時(shí)間)，評估豚鼠氣道CRS。

將聲能咳嗽記錄儀與RM 6240 B型四道生理信號采集處理系統(tǒng)連接，即可通過計(jì)算機(jī)自動生成豚鼠的咳嗽波形。豚鼠置于聲能咳嗽記錄儀中記錄正常呼吸波10 s后，用超聲霧化器(電壓220 V，最大霧化率≥3 ml·min-1)將17.5%的檸檬酸霧化，通過管道向咳嗽記錄儀內(nèi)噴霧15 s[3]，記錄豚鼠20 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)及咳嗽潛伏時(shí)間。

根據(jù)引咳數(shù)據(jù)剔除咳嗽反射不敏感或過敏感的動物，剔除標(biāo)準(zhǔn)[3]： 5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)≤10次或≥50次，和(或)噴霧后咳嗽潛伏時(shí)間≤10 s或≥120 s。選取CRS正常的30只豚鼠分組實(shí)驗(yàn)。

1.3.2動物分組與模型建立 將CRS正常的豚鼠隨機(jī)分為：(1) 模型組[4]：禁食后4 h氯胺酮(50 mg·kg-1)注射輕度麻醉后取仰臥位，自口腔插入5 F胃管至食管中、下段(7～8 cm)，觀察30 s無異常后，以8滴·min-1的速度灌注含0.5%胃蛋白酶的稀釋鹽酸15～20 min·d-1，連續(xù)15 d；(2) 空白組：飼養(yǎng)環(huán)境下15 d；(3) 生理鹽水(NS)組：方法同模型組，換用NS食管內(nèi)灌注；(4) 模型加BTX-A組：同模型組，第6天食管灌注12 h后氣道內(nèi)注射BTX-A(2 U·kg-1)，12 h后繼續(xù)食管內(nèi)灌注；(5) 模型加NS組：方法同模型加BTX-A組，改用NS(0.2 ml·kg-1)氣道內(nèi)注射。以上豚鼠第14天食管操作后12 h再次檸檬酸引咳；第15天食管操作后4 h行心臟灌流取肺組織。

1.3.3氣道內(nèi)藥物注射 (1) 按氯胺酮75 mg·kg-1加0.5 ml烏拉坦腹腔內(nèi)注射，麻醉后固定；(2) 消毒頸部皮膚后剪開(2～3 cm)，逐層分離至氣管暴露；(3) 注入藥物，停針30 s后拔出，消毒并逐層縫合。

1.3.4心臟灌流固定及組織取材 25%烏拉坦(1 g·kg-1)腹腔注射后打開胸腔暴露心臟，左心室穿刺后NS快速灌注，直至右心耳流出的液體清亮(約400 ml)，再灌注4%多聚甲醛至僵硬為止(約500 ml，總時(shí)間90～120 min)。取肺組織置于4 ℃ 4%多聚甲醛中后固定6 h，轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液中3 d。

1.3.5肺內(nèi)NK-1R的免疫組化染色實(shí)驗(yàn)及陽性反應(yīng)物計(jì)數(shù) 取肺組織塊予OCT包埋后冰凍切片機(jī)中制冷10 min，-20 ℃連續(xù)切片(片厚40 μm)，經(jīng)0.3% H2O2去離子水室溫孵育30 min、山羊血清封閉液室溫1 h后，直接轉(zhuǎn)入兔抗NK-1R多克隆抗體稀釋液(1∶400)中4 ℃冰箱過夜。取出復(fù)溫1 h后滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗工作液室溫1 h，再滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫1 h，最后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)室溫下鏡控顯色并貼片。以上每一步驟前均經(jīng)0.01 mol·L-1PBS漂洗10 min 3遍。晾干后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。每只動物測定5張切片，每張切片3個(gè)視野，使用專業(yè)軟件分析隨機(jī)視野下的平均光密度值。

空白對照組以PBS緩沖液代替一抗，其它染色步驟相同。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 造模期間動物一般情況

造模過程中食管內(nèi)酸性溶液灌注的豚鼠第1～3天均出現(xiàn)進(jìn)食減少，體重略下降，后進(jìn)食水逐漸恢復(fù)，體重漸增長。灌注7～8 d后，模型組豚鼠食管灌注時(shí)易出現(xiàn)不同程度的咳嗽，對照組未見明顯上述改變。

2.2 檸檬酸引咳記錄的咳嗽波形

17.5%檸檬酸噴霧15 s可引起豚鼠咳嗽，在透明裝置中觀察到豚鼠胸廓起伏、前腳伸出、頸部伸向前、抓耳撓腮和擺頭等特征性動作。人工聯(lián)合儀器同時(shí)記錄，結(jié)果以能聽到的咳嗽聲音并伴隨特征性咳嗽動作計(jì)算，利用軟件描計(jì)出咳嗽波形，見圖1。

圖1 咳嗽聲能記錄儀轉(zhuǎn)化后的咳嗽波形

Fig 1 Cough waves were recordered by sound energy converter

2.3 咳嗽次數(shù)及潛伏時(shí)間

咳嗽次數(shù)：造模前組間未見明顯差異(P>0.05)，造模后模型組較空白組及NS組咳嗽次數(shù)增多(P<0.05)，氣道內(nèi)BTX-A注射后與模型組相比咳嗽次數(shù)下降(P<0.05)，見表1。

組 別咳嗽次數(shù)造模前造模后空白組22.50±8.1229.50±13.40NS組24.00±9.1726.80±9.83模型組29.83±13.6051.17±10.19ab模型+BTX-A組29.00±6.4523.33±7.53c模型+NS組26.33±9.6961.17±16.27ab

a 與NS組和空白組比較，P<0.05； b 與造模前模型組比較，P<0.05； c 與模型組比較，P<0.05

咳嗽潛伏時(shí)間：造模前組間未見明顯差異(P>0.05)，造模后模型組較對照組縮短(P<0.05)。BTX-A氣道注射后咳嗽潛伏時(shí)間較模型組有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

組 別咳嗽潛伏時(shí)間/s造模前造模后空白組51.50±12.3738.17±9.91NS組49.10±18.9731.92±4.78模型組54.80±25.048.24±4.73ab模型+BTX-A組41.10±17.8011.76±3.29模型+NS組53.00±33.123.88±1.88ab

a 與NS組和空白組比較，P<0.05； b 與造模前模型組比較，P<0.05

結(jié)果表明：多次食管內(nèi)酸性溶液灌注構(gòu)建的GERD模型可使豚鼠CRS增高，表現(xiàn)為咳嗽次數(shù)增多及潛伏時(shí)間縮短；氣道內(nèi)注射BTX-A阻斷神經(jīng)源性因子釋放后可減少檸檬酸引咳的咳嗽次數(shù)，但潛伏時(shí)間未見明顯改變。

2.4 免疫組化染色法檢測肺組織NK-1R的表達(dá)

空白組及NS組豚鼠肺組織切片鏡下可見少量NK-1R免疫陽性反應(yīng)物分布表達(dá)，呈棕黃色顆粒狀，主要分布于氣道支氣管及血管周圍，以胞漿染色為主。模型組及模型加NS組豚鼠氣道、血管及肺泡周圍肺內(nèi)可見大量NK-1R陽性物質(zhì)表達(dá)，呈深棕黃色圓形或橢圓形顆粒，相較于對照組其表達(dá)明顯增多(圖2A～

E)。測量平均光密度值表明，模型組NK-1R的平均光密度值明顯高于空白組(108.48±25.71vs38.54±17.62，P<0.05)及NS組(108.48±25.71vs43.51±19.43，P<0.05)；氣道內(nèi)使用BTX-A后NK-1R的表達(dá)較模型組明顯減少，平均光密度值降低(21.59±13.45vs108.48±25.71，P<0.05)。見圖3。

A～E依次為空白組、NS組、模型組、模型+BTX-A組、模型+NS組

圖2 各組豚鼠造模后肺組織NK-1R免疫陽性物的表達(dá)(箭頭所示)(LSAB法，DAB染色×200)Fig 2 Expression of neurokinin-1 receptor in lung by immunohistochemical staining(LSAB，DAB×200)

圖3 造模后肺組織NK-1R免疫陽性物表達(dá)的平均光密度值

Fig 3 The IOD of neurokinin-1 receptor expression in lung

以上PBS空白組實(shí)驗(yàn)鏡下未見陽性物質(zhì)表達(dá)。

結(jié)果表明，GERD豚鼠模型肺組織中NK-1R表達(dá)增加，氣道內(nèi)注射BTX-A后可使其表達(dá)下降。

3 討 論

神經(jīng)源性炎癥因子SP及其受體NK-1R參與多種疾病發(fā)病過程[5]，GERD即可通過食管-支氣管反射導(dǎo)致肺內(nèi)神經(jīng)源性炎癥，產(chǎn)生一系列呼吸系統(tǒng)癥狀。實(shí)驗(yàn)中我們采用食管內(nèi)多次酸性溶液灌注的方法建立豚鼠GERD模型[4]，實(shí)驗(yàn)室前期及Liu等[6]通過一系列方法驗(yàn)證了該模型肺組織中神經(jīng)源性炎癥的存在。人體試驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)GERD患者支氣管肺泡灌洗液中SP、神經(jīng)激肽A(NKA)等神經(jīng)源性炎癥因子表達(dá)增高[7]。神經(jīng)源性炎癥的產(chǎn)生和持續(xù)存在可能是GERD呼吸系統(tǒng)癥狀產(chǎn)生的根源。

建模過程中發(fā)現(xiàn)，酸性溶液灌注數(shù)天后豚鼠更易出現(xiàn)刺激性咳嗽。檸檬酸檢測氣道CRS時(shí)發(fā)現(xiàn)，食管酸灌注可使外界刺激物激發(fā)咳嗽的濃度閾值下降，提示食管酸化可能導(dǎo)致氣道CRS的增加。有學(xué)者認(rèn)為反流導(dǎo)致的神經(jīng)源性炎癥可使機(jī)體呈現(xiàn)內(nèi)臟高敏狀態(tài)，此病理過程涉及SP和NK-1R表達(dá)的增加[8]，食管高敏感性亦可能是反流疾病中食管癥狀產(chǎn)生的主要原因[9]。

本實(shí)驗(yàn)檢測NK-1R的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，GERD豚鼠肺組織中NK-1R表達(dá)增加。神經(jīng)源性炎癥因子SP主要與NK-1R結(jié)合發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)此模型中SP的表達(dá)亦存在明顯升高，上調(diào)的NK-1R可結(jié)合更多的SP，產(chǎn)生更明顯的神經(jīng)源性炎癥表現(xiàn)，從而加重氣道結(jié)構(gòu)損傷，使感覺神經(jīng)纖維末梢感受器裸露，更易接收外界刺激信號導(dǎo)致咳嗽反射的激活。哮喘[10]及煙霧刺激模型[11]亦存在與表達(dá)增加的NK-1R有關(guān)的氣道敏感性增高，并可通過NK-1R拮抗劑阻斷[12]。

顯微鏡下可見增多的NK-1R主要分布于細(xì)支氣管、終末細(xì)支氣管及血管周圍，文獻(xiàn)亦報(bào)道SP及NK-1R主要表達(dá)于小氣道及血管周圍[13]，但實(shí)驗(yàn)過程中由于取材及切片時(shí)未能保留完整的主支氣管及段支氣管結(jié)構(gòu)，故未能驗(yàn)證大氣道周圍是否存在NK-1R的表達(dá)改變。下一步實(shí)驗(yàn)可考慮單獨(dú)取材大氣道，檢測其分布及表達(dá)情況。

神經(jīng)源性炎癥在GERD豚鼠氣道CRS增高中起到重要作用。BTX-A可通過阻斷神經(jīng)源性炎癥因子的釋放阻斷神經(jīng)源性炎癥[2]，實(shí)驗(yàn)中被用來治療過敏性鼻炎[14]及慢性頑固性咳嗽[15]。本次實(shí)驗(yàn)使用BTX-A阻斷神經(jīng)源性炎癥，再使用檸檬酸測量豚鼠氣道CRS，發(fā)現(xiàn)咳嗽次數(shù)下降，但潛伏時(shí)間未見明顯改變，與實(shí)驗(yàn)最初設(shè)想部分不符。分析原因可能為：氣道內(nèi)的咳嗽感受器分為快適應(yīng)感受器(rapidly adapting mechanoreceptors，RARs)和C-纖維感受器兩類。RARs主要感受氣道機(jī)械刺激；C-纖維屬于無髓鞘感覺神經(jīng)，主要接受氣道化學(xué)性傷害刺激，以神經(jīng)源性炎癥因子SP、NKA等為遞質(zhì)；二者在氣道中均可激發(fā)咳嗽。BTX-A阻斷了C纖維的遞質(zhì)釋放，但對RARs的阻斷作用并不明顯。BTX-A對咳嗽傳入沖動的部分阻斷導(dǎo)致咳嗽潛伏時(shí)間未見明顯改變，但咳嗽次數(shù)減少。同時(shí)檢測BTX-A氣道注射后肺組織NK-1R的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)下降，進(jìn)一步提示氣道神經(jīng)源性炎癥對肺組織NK-1R及氣道CRS的影響，其中NK-1R對氣道CRS的增高可能有間接作用。但本實(shí)驗(yàn)對BTX-A阻斷神經(jīng)源性炎癥因子的釋放缺少驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，擬在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中梯度注射BTX-A后定量檢測SP等神經(jīng)源性因子的表達(dá)，以明確是否存在一定的量-效關(guān)系。

綜上所述，GERD引起的氣道神經(jīng)源性炎癥與氣道CRS增高的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)，其機(jī)制可能涉及肺內(nèi)NK-1R表達(dá)的增加，即通過上調(diào)突觸后受體的表達(dá)，加劇肺內(nèi)神經(jīng)源性炎癥表現(xiàn)，使氣道CRS增加。

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The role of neurokinin-1 receptor in gastroesophageal reflux model of guinea pigs with the increase of cough reflex sensitivity

LIU Na1，DONG Rong2，LIN Yong3，LAI Ke-fang4

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 2.DepartmentofPhysiologyandPharmacology，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 3.DepartmentofRespiratory，AffiliatedNanjingChestHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210029，China； 4.AffiliatedFirstHospital，GuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510000，China)

Objective: To explore the relationships between cough reflex sensitivity and the neurokinin-1 receptor expression in lung in the gastroesophageal reflux model. Methods: We built the model and measured cough reflex sensitivity， observed neurokinin-1 receptor in lung by immunohistochemical staining. Results: The cough reflex sensitivity and the numbers of neurokinin-1 receptor-immunoreactive substances increased(108.48±25.71vs38.54±17.62，P<0.05)in the model group. Injected botulinum toxin-A into airway， the cough times dropped(23.33±7.53vs51.17±10.19，P<0.05)， and the number of neurokinin-1 receptor also lowered(21.59±13.45vs108.48±25.71，P<0.05)，but the cough latency was not significantly different(11.76±3.29vs8.24±4.73，P>0.05) compared to the model group. Conclusion: GERD increases the cough reflex sensitivity， and neurokinin-1 receptor in lung may play an important role in it．

gastroesophageal reflux disease； neurokinin-1 receptor； cough reflex sensitivity； botulinum toxin-A； guinea pigs

2015-04-01

2015-05-04

廣州呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目(2007DA780154F0905)

劉娜(1988-)，女，湖北神農(nóng)架人，在讀碩士研究生。E-mail:liuna860@163.com

董榕 E-mail：dongrongshengli@163.com

劉娜，董榕，林勇，等.速激肽-1受體在GERD模型豚鼠咳嗽反射敏感性中的作用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2015，34(5)：731-735．

R-33

A

1671-6264(2015)05-0731-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.010