納米銀聯(lián)合輻射后腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡與小膠質(zhì)細(xì)胞的變化及其關(guān)系

劉培黨，金海振，趙靜，唐萌

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)生物學(xué)研究所，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué) 江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇 南京 210009)

·論 著·

納米銀聯(lián)合輻射后腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡與小膠質(zhì)細(xì)胞的變化及其關(guān)系

劉培黨1，2，金海振1，趙靜1，唐萌2

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)生物學(xué)研究所，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué) 江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇 南京 210009)

目的：研究納米銀聯(lián)合輻射后大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡與瘤內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的變化及其關(guān)系。方法：將C6細(xì)胞立體定向接種于大鼠右側(cè)尾狀核，建模后第8天將荷瘤鼠隨機分成輻射對照組和納米銀聯(lián)合輻射組，分別立體定向注入等體積的去離子水及20 μg的納米銀，并行單次電離輻射。應(yīng)用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)法和OX42免疫組織化學(xué)染色分別檢測輻射后瘤組織內(nèi)細(xì)胞凋亡及小膠質(zhì)細(xì)胞活性的動態(tài)變化。結(jié)果：TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目在輻射后6 h顯著增加，24 h明顯減少；輻射后6 h膠質(zhì)瘤內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞開始激活，隨著時間的延長活性進一步增強。輻射后6 h 和24 h，納米銀聯(lián)合輻射組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目和小膠質(zhì)細(xì)胞活性均較輻射對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。小膠質(zhì)細(xì)胞活化與膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的變化趨勢不同，前者遲于后者。結(jié)論：納米銀聯(lián)合輻射后膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡增加，小膠質(zhì)細(xì)胞活化；激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可能沒有參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的急性凋亡過程。

納米銀； 膠質(zhì)瘤； 電離輻射； 細(xì)胞凋亡； 小膠質(zhì)細(xì)胞

腦膠質(zhì)瘤約占全部顱內(nèi)腫瘤的50%，是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。由于惡性膠質(zhì)瘤具有侵襲性生長特性，手術(shù)難以完全切除，復(fù)發(fā)率高。輻射治療是腦膠質(zhì)瘤重要的治療手段之一，但大部分膠質(zhì)瘤對射線不敏感，輻射治療效果亦不佳[2]。如何增強膠質(zhì)瘤細(xì)胞的輻射敏感性，一直是臨床上亟待解決的熱點問題。納米技術(shù)的出現(xiàn)為腫瘤的成像、診斷和治療提供了新的有力工具。金屬銀納米材料由于其獨特的抗菌、催化及非線性光學(xué)等性能，使其在生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，納米銀顆粒能夠顯著提高射線對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用[3-4]。

大量研究表明，細(xì)胞凋亡失衡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。更重要的是，輻射、化療等多種抗腫瘤治療的部分機制與誘導(dǎo)凋亡有關(guān)[5]。另外，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)及其疾病中主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞參與許多生理和病理過程，尤其在殺傷腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6-7]。納米銀聯(lián)合輻射后，小膠質(zhì)細(xì)胞是否參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡過程尚不清楚。本研究在建立大鼠膠質(zhì)瘤腦內(nèi)模型的基礎(chǔ)上，通過立體定位向腫瘤內(nèi)注入一定劑量的納米銀并進行電離輻射，觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和小膠質(zhì)細(xì)胞的動態(tài)改變，以了解其在納米銀聯(lián)合輻射中的作用及關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2主要儀器 單臂數(shù)字式腦立體定向儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，電離輻射儀(德國Siemens公司)，Olympus光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，CM-1900冰凍切片機和Leica圖像處理系統(tǒng)(德國Leica公司)，JEM-2000EX透射電子顯微鏡(TEM，日本JEOL公司)。

1.1.3動物和細(xì)胞 健康雄性Wistar大鼠24只，2～3月齡，體重220～260 g，購于東南大學(xué)動物實驗中心。大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海生物研究所。

1.2 方法

1.2.1C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以不含乙二胺四乙酸二鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶消化，離心后去除上清液，制成細(xì)胞懸液。臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108ml-1，置于37 ℃恒溫?fù)u床待接種。

1.2.2荷瘤鼠模型制作及動物分組 大鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，將頭部固定在腦立體定向儀上，參照Paxinos-Watson大鼠圖譜確定右側(cè)紋狀體移植靶點(前囟前1 mm、右旁開3 mm、硬腦膜下5 mm)。每只大鼠注入10 μl單細(xì)胞懸液，注射速度1 μl·min-1，注射完畢后留針5 min。將4只荷瘤鼠經(jīng)灌注后蘇木素-伊紅(HE)染色，確定腫瘤分化程度；GFAP免疫組織化學(xué)染色，驗證膠質(zhì)瘤的性質(zhì)。將其余20只荷瘤大鼠隨機分為輻射對照組(瘤內(nèi)注射去離子水加電離輻射)和納米銀聯(lián)合輻射組(瘤內(nèi)注射20 μg納米銀加電離輻射)。每組根據(jù)輻射后不同時間再分為輻射后6 h和24 h兩個時間點，觀察細(xì)胞凋亡和小膠質(zhì)細(xì)胞活性的變化。

1.2.3納米銀瘤內(nèi)注入及輻射 建模后第8天，將各輻射組荷瘤大鼠麻醉后固定于腦立體定向儀上，原切口切開頭皮，尋找到原骨孔，分別抽取10 μl去離子水及等體積的納米銀懸液(20 μg，去離子水配制)立體定向注入相應(yīng)瘤區(qū)。注射后24 h行6 MV電子線照射。每只動物共接受單次10 Gy照射，劑量率為200 cGy·min-1。

1.2.4組織學(xué)和免疫組織化學(xué)染色 將大鼠進行常規(guī)灌注固定，斷頭取腦，置于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(PB)后固定24 h后，入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%蔗糖的PB液至沉底。取瘤區(qū)所在腦組織行冠狀冰凍切片，片厚10 μm。相應(yīng)組瘤組織行常規(guī)HE染色。將部分切片移入體積分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫溶液，室溫下作用15 min。山羊血清封閉非特異性抗原，室溫下30 min。分別滴加一抗GFAP(1∶80)、OX42(1∶50)，4 ℃孵育過夜。加入生物素標(biāo)記二抗工作液，37 ℃孵育60 min，PBS清洗3次，再加入堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉卵白素37 ℃反應(yīng)30 min。DAB顯色后，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。

1.2.5TUNEL染色 取各輻射組剩余切片，按TUNEL試劑盒說明書原位檢測凋亡細(xì)胞，陰性對照為不加TDT酶。結(jié)果判定：細(xì)胞核中有棕色顆粒者為陽性細(xì)胞。每個標(biāo)本選2張切片，計數(shù)每高倍視野中的凋亡細(xì)胞，共選6個高倍(400倍)視野，其均值為該標(biāo)本的代表值。

由上述研究可知,超聲輔助對于食品原料中的類黑精提取有非常大的促進作用。類比其輔助萃取時的優(yōu)點,例如破壞細(xì)胞壁細(xì)胞膜,促進生物活性物質(zhì)釋放等,可以預(yù)測一些非熱加工技術(shù)在類黑精方面的輔助提取的前景,如高靜水壓萃取、高壓脈沖電場等。此外,超臨界流體萃取等技術(shù)還有綠色、清潔,減少有機試劑使用的優(yōu)點。然而,這些技術(shù)在類黑精提取方面的應(yīng)用報道較少,屬于較新領(lǐng)域。

1.2.6累積光密度的測定 累積光密度為OX42免疫組織化學(xué)染色陽性區(qū)域的每個像素點的光密度總和。累積光密度的大小反映OX42的活性變化。用Leica攝影顯微鏡進行圖像采集，用Image pro-Plus 6.0分析圖像中的累積光密度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 納米銀的表征結(jié)果

TEM結(jié)果顯示，納米銀顆粒在形態(tài)上以球形為主，分散均勻，無團聚現(xiàn)象(圖1)。粒徑統(tǒng)計結(jié)果顯示，納米銀粒子單分散性較好，平均粒徑為(10.2±1.1) nm。

圖1 納米銀TEM照片

Fig 1 Image of nanosilver taken by TEM

2.2 膠質(zhì)瘤組織學(xué)和GFAP免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

腦膠質(zhì)瘤HE染色結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞密集成群，形態(tài)多樣，分化程度低，異型性高；免疫組化染色結(jié)果顯示腫瘤組織內(nèi)GFAP表達(dá)較弱。

2.3 TUNEL染色結(jié)果

納米銀聯(lián)合輻射組膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡數(shù)目均比輻射對照組相應(yīng)期瘤內(nèi)細(xì)胞凋亡數(shù)目高(圖2)。輻射后6 h，聯(lián)合輻射組瘤內(nèi)細(xì)胞凋亡數(shù)目與相應(yīng)期的對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。輻射后24 h細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著減少，但聯(lián)合輻射組凋亡細(xì)胞數(shù)目仍較輻射對照組多(P<0.001)。

a 與相應(yīng)期對照組相比，P<0.001

圖2 納米銀聯(lián)合輻射后膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的變化

Fig 2 Changes in apoptosis of glioma cells following nanosilver plus radiation

2.4 小膠質(zhì)細(xì)胞OX42染色結(jié)果

輻射后6 h兩組動物腦膠質(zhì)瘤內(nèi)OX42均有表達(dá)，但陽性細(xì)胞胞體多小而圓，突起較短，胞漿淺染，納米銀聯(lián)合輻射組OX42活性與輻射對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖3A、B，圖4)。輻射后24 h OX42活性明顯增強，表現(xiàn)為OX42陽性細(xì)胞胞體增大，胞漿染色較深，部分細(xì)胞突起粗長，聯(lián)合輻射組OX42活性較輻射對照組明顯增高(P<0.001，圖3C、D，圖4)。輻射后24 h聯(lián)合輻射組可見大量OX42陽性細(xì)胞從瘤周組織向瘤區(qū)浸潤。

2.5 小膠質(zhì)細(xì)胞活性變化與膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系

小膠質(zhì)細(xì)胞活化與膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的變化趨勢不同，前者遲于后者。OX42累積光密度與膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)(P<0.001)。

圖3 納米銀聯(lián)合輻射后OX42陽性細(xì)胞的變化(×400) A.輻射對照組，輻射后6 h； B.聯(lián)合輻射組，輻射后6 h； C.輻射對照組，輻射后24 h； D.聯(lián)合輻射組，輻射后24 h

Fig 3 Changes of OX42 positive cells following nanosilver plus radiation(×400) A.irradiated control group，6 h postirradiation; B.combined treatment group， 6 h postirradiation; C.irradiated control group，24 h postirradiation; D.combined treatment group，24 h postirradiation

a 與相應(yīng)期對照組相比，P<0.001

圖4 納米銀聯(lián)合輻射后OX42陽性區(qū)域累積光密度的變化

Fig 4 Changes of the integrated optical densities of OX42 positive areas following nanosilver plus radiation

3 討 論

作為星形膠質(zhì)細(xì)胞的主要中間絲蛋白，GFAP常被用作識別正常或病理情況下星形膠質(zhì)細(xì)胞來源組織的標(biāo)志物。大量研究證實，GFAP表達(dá)強度與膠質(zhì)瘤惡性程度呈負(fù)相關(guān)[8]。本實驗結(jié)果顯示，C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞GFAP反應(yīng)呈弱陽性，提示腫瘤分化程度低，惡性程度高。近年來，荷C6膠質(zhì)瘤大鼠已作為高度惡性多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤動物模型廣泛用于腦膠質(zhì)瘤病因?qū)W和藥效學(xué)等的研究[9-10]。

凋亡又稱為Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞死亡的機制之一。本研究結(jié)果顯示，輻射后6 h膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡數(shù)目比輻射后24 h明顯增多，這與文獻(xiàn)報道[11-12]一致。放射線能夠引起細(xì)胞凋亡，且凋亡高峰期主要發(fā)生在輻射后的最初幾個小時[11-12]。輻射后6 h和24 h，納米銀聯(lián)合輻射組膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡數(shù)目均比相應(yīng)期輻射對照組高，提示納米銀輻射增敏殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的部分機制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

我們發(fā)現(xiàn)納米銀聯(lián)合輻射后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化具有時程效應(yīng)，其活性較輻射對照組明顯增高。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中功能活躍的免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞在損傷性刺激誘導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)中起到重要作用[13]。首先，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞通過吞噬清除腫瘤組織，發(fā)揮殺瘤效應(yīng)。其次，促使多種炎癥細(xì)胞因子釋放增加，如腫瘤壞死因子α、白介素1等，加重炎癥反應(yīng)[14]。第三，通過活化誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，可以長時間地產(chǎn)生一氧化氮[15]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)納米銀聯(lián)合輻射后腦膠質(zhì)瘤內(nèi)一氧化氮水平顯著增高[16]。過量的一氧化氮會由生理狀態(tài)下的調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒效應(yīng)因子，直接或間接地促進腫瘤細(xì)胞死亡[15]。本研究觀察到，小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)明顯增強時間遲于膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡高峰時間，兩者的變化趨勢不同，提示小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可能沒有參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的急性凋亡過程。

綜上所述，納米銀聯(lián)合輻射能夠促進膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可能在納米銀聯(lián)合輻射殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的效應(yīng)中發(fā)揮一定的作用，但可能沒有參與納米銀增加輻射所誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的急性凋亡過程，其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)期命運及轉(zhuǎn)歸的影響有待于進一步明確。對細(xì)胞死亡方式及相關(guān)介導(dǎo)因素的深入研究，有助于揭示納米銀輻射增敏殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用機制。

[1] HUANG R Y，NEAGU M R，REARDON D A，et al.Pitfalls in the neuroimaging of glioblastoma in the era of antiangiogenic and immuno/targeted therapy-detecting illusive disease，defining response[J].Front Neurol，2015，6:33．

[2] BRETT-MORRIS A，WRIGHT B M，SEO Y，et al.The polyamine catabolic enzyme SAT1 modulates tumorigenesis and radiation response in GBM[J]. Cancer Res，2014，74(23):6925-6934．

[3] XU R，MA J，SUN X，et al.Ag nanoparticles sensitize IR-induced killing of cancer cells[J].Cell Res，2009，19(8):1031-1034．

[4] LIU P，HUANG Z，CHEN Z，et al.Silver nanoparticles:a novel radiation sensitizer for glioma？[J].Nanoscale，2013，5(23):11829-11836．

[5] CUI Y，MENG H，LIU W，et al.Huaier aqueous extract induces apoptosis of human fibrosarcoma HT1080 cells through the mitochondrial pathway[J].Oncol Lett，2015，9(4):1590-1596．

[6] GUTMANN D H.Microglia in the tumor microenvironment:taking their TOLL on glioma biology[J].Neuro Oncol，2015，17(2):171-173．

[7] SARKAR S，D?RING A，ZEMP F J，et al.Therapeutic activation of macrophages and microglia to suppress brain tumor-initiating cells[J].Nat Neurosci，2014，17(1):46-55.

[8] SHAO W，GU J，HUANG C，et al.Malignancy-associated metabolic profiling of human glioma cell lines using 1H NMR spectroscopy[J]. Mol Cancer，2014，13:197．

[9] MIYAKE J A，BENADIBA M，RIBEIRO G，et al.Novel ruthenium-gamma-linolenic acid complex inhibits C6 rat glioma cell proliferationinvitroand in the orthotopic C6 modelinvivoafter osmotic pump infusion[J].Anticancer Res，2014，34(4):1901-1911．

[10] AN Y，GUO W，LI L，et al.Micheliolide derivative DMAMCL inhibits glioma cell growthinvitroandinvivo[J].PLoS One，2015，10(2):e0116202．

[11] GARCIA-BARROS M，PARIS F，CORDON-CARDO C，et al.Tumor response to radiotherapy regulated by endothelial cell apoptosis[J].Science，2003，300(5622):1155-1159．

[12] LU F，LI Y Q，AUBERT I，et al.Endothelial cells regulate p53-dependent apoptosis of neural progenitors after irradiation[J]. Cell Death Dis，2012，3:e324．

[13] 梁瑞，吳鶴，戚基萍.活化的小膠質(zhì)細(xì)胞在腦出血后的作用[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2015，43(2):262-265．

[14] LOURBOPOULOS A，ERTüRK A，HELLAL F.Microglia in action:how aging and injury can change the brain’s guardians[J].Front Cell Neurosci，2015，9:54．

[15] CHAO T H，CHANG M Y，SU S J，et al.Inducible nitric oxide synthase mediates MG132 lethality in leukemic cells through mitochondrial depolarization[J].Free Radic Biol Med，2014，74:175-187．

[16] 劉培黨，史婷婷，朱建寶，等.納米銀聯(lián)合放療對大鼠膠質(zhì)瘤內(nèi)iNOS表達(dá)和NO水平的影響[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2013，29(3):275-279．

Changes in apoptosis of glioma cells and microglia activity and their correlation following nanosilver plus radiation

LIU Pei-dang1，2，JIN Hai-zhen1，ZHAO Jing1，TANG Meng2

(1.InstituteofNeurobiology，SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 2.JiangsuKeyLaboratoryforBiomaterialsandDevices，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To study the changes in apoptosis of glioma cells and microglia activity and their correlation following nanosilver plus radiation. Methods: C6 glioma cells were stereotactically transplanted into the rat’ right caudate nucleus. 8 days after inoculation， the tumor-bearing animals were randomly divided into the irradiated control group and combined treatment group， which then received intratumoral injections of deionized water or nanosilver of the same volume(20 μg)， followed by a single dose of ionizing radiation. The dynamic changes of apoptosis and microglia activity in the tumor tissue were examined by TUNEL assay and OX42 immunohistochemical staining， respectively. Results: The number of TUNEL-positive cells increased significantly 6 h after irradiation， and then dropped significantly 24 h postirradiation. Microglia activity was expressed 6 h after the radiation， and it grew further over time. Furthermore， compared with that in the irradiated control group， the number of TUNEL-positive cells and microglia activity increased significantly in the combined treatment group 6 h and 24 h after the radiation(P<0.001).The expression trends of microglia activity and TUNEL-positive cells were different， with the former being later. Conclusion: The combination of nanosilver with radiation can promote glioma cells apoptosis and activate microglia. The activated microglia may not participate in the acute process of glioma cell apoptosis．[Key words] nanosilver； glioma； ionizing radiation； apoptosis； microglia

2015-04-15

2015-05-04

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2013CB933904，2011CB933500)

劉培黨(1969-)，男，山東棗莊人，副教授，醫(yī)學(xué)博士。E-mail:seulpd@163.com

劉培黨，金海振，趙靜，等.納米銀聯(lián)合輻射后腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡與小膠質(zhì)細(xì)胞的變化及其關(guān)系[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2015，34(5)：679-683．

R739.41; R329.25

1671-6264(2015)05-0679-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.001