陽和湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎大鼠的治療作用*

馬丙娥，王建華，趙正平，周國威，王 瓊，馬朝群

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

自身免疫性甲狀腺炎又稱橋本甲狀腺炎（hashimoto’s thyroiditis，HT）和慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，是多發(fā)于中年女性的自身免疫性甲狀腺疾病，患者數(shù)量約占全球總?cè)丝诘?%[1]。HT的主要特征包括甲狀腺組織彌散性淋巴浸潤和甲狀腺自身抗體顯著升高，包括甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody，TgAb）、抗甲狀腺過氧化物酶抗體（anti-thyroperoxidase antibody，TPO-Ab），這也是引起甲狀腺功能減退的主要原因[2]。甲狀腺淋巴細(xì)胞的浸潤和甲狀腺組織的進(jìn)行性損害進(jìn)一步加重了疾病的進(jìn)展[3]。西醫(yī)目前對(duì)于該病治療手段主要有激素治療、免疫治療等，但只能改善HT引起的甲狀腺功能異常，無法有效降低患者血清中高度富集的甲狀腺自身抗體，副作用大，療效有限[4]。中藥具有多靶點(diǎn)、副作用低、療效穩(wěn)定等優(yōu)勢，近年來成為研究治療免疫性疾病的熱點(diǎn)。陽和湯出自清代名醫(yī)王洪緒《外科證治全生集》，本課題組前期臨床研究[5]已經(jīng)證實(shí)陽和湯對(duì)HT有良好的療效。本研究利用實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎（experimental autoimmune thyroiditis，EAT）大鼠模型，從分子水平檢測陽和湯對(duì)EAT大鼠血清中甲狀腺自身抗體TgAb、TPO-Ab水平及IL-35表達(dá)的影響，深入探究陽和湯對(duì)橋本甲狀腺炎的治療效果，以期為中藥治療橋本甲狀腺炎（HT）提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10周齡SPF級(jí)雌性SD大鼠24只，體質(zhì)量120~140 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：NO1908230043。于照明黑暗交替12h/12h、室溫（22±1）℃、濕度50%~70%條件下飼養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)江蘇省中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批許可，倫理號(hào)：2020 DW-02-02。

1.2 藥物與試劑

1.2.1 藥物 陽和湯處方組成：熟地黃30 g，肉桂3 g，麻黃2 g，鹿角膠9 g，白芥子6 g，姜炭2 g，生甘草3 g。取自南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。將生藥（除鹿角膠）用5倍體積量自來水浸泡2 h，煮沸40 min，過濾分離藥液及藥渣，藥渣再加入3倍體積自來水煎煮20 min，過濾后留藥液。合并兩次藥液于70℃水浴中濃縮至30 mL，再將鹿角膠烊化加入其中。用蒸餾水倍比稀釋成濃度1 g/mL的水煎劑。

1.2.2 試劑 豬甲狀腺球蛋白PTg（sigma，批號(hào)：018K7012）；完全弗氏佐劑（sigma，批號(hào)：SLBW5971）；不完全弗氏佐劑（sigma，批號(hào)：SLBW0366）；盧戈氏液（江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室提供）；甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）和甲狀腺過氧化物酶抗體（TPO-Ab）、IL-35放射免疫檢測試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所，批號(hào)：20190218）；Anti-STAT3（Abcam，貨號(hào)：ab68153）；Anti-p-STAT3（Abcam，貨號(hào)：ab76315）；Anti-STAT1（Abcam，貨號(hào)：ab31369）；Anti-p-STAT1（Abcam，貨號(hào)：ab29045）；Anti-beta Tubulin（Invitrogen，貨號(hào)：PA5-27108）。

1.3 主要儀器IX51-A12PH型顯微鏡（日本奧林巴斯）；Scientific Sorvall ST 40離心機(jī)（Thermo公司）；酶標(biāo)儀（Thermo公司）；NanoDrop 2000光度計(jì)（Thermo公司）；SAGA-D超純水儀（上海賽鴿）；FE28-Standard酸度計(jì)（瑞士梅特勒托利多）；ME155DU微量電子天平（瑞士梅特勒托利多）。

1.4 造模與分組24只SD雌性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽和湯治療組、陽和湯預(yù)防組。除正常組外，其他大鼠復(fù)制EAT模型，造模方法參考文獻(xiàn)[6]，具體步驟如下：無菌PBS將PTg溶解，再與完全弗氏佐劑（CFA）等體積混合，配制成PTg（濃度8 mg/mL），充分震蕩制成油包水乳劑（滴在水中不化開即乳化完全）。將PTg溶液與不完全弗氏佐劑（IFA）1∶1混勻配置PTg注射液，對(duì)造模組大鼠后足趾、背部、腹腔皮下多點(diǎn)注射（0.8 mg/只），共注射2次，間隔2 d，為初次免疫。初次免疫后每隔1周注射1次，連續(xù)6周，為加強(qiáng)免疫。第6周結(jié)束時(shí)檢測大鼠血清中甲狀腺過氧化酶抗體（TPO-Ab）、甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）明顯升高，甲狀腺組織內(nèi)見淋巴細(xì)胞浸潤即為造模成功。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥陽和湯預(yù)防組大鼠在造模同時(shí)灌胃給予陽和湯浸膏，1.5 g/(100 g·d），連續(xù)給藥6周；陽和湯治療組在完成造模后次日開始給藥，劑量同陽和湯預(yù)防組，連續(xù)給藥6周；模型組在造模完成后次日給予生理鹽水灌胃，1 mL/（100 g·d），持續(xù)6周；正常組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，飲用蒸餾水。除正常組外，其他3組大鼠造模期間飲用5%盧戈氏液（10 mL盧戈氏液加入1 180 mL自來水中，現(xiàn)配現(xiàn)用），其他飼養(yǎng)條件同正常組。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 甲狀腺抗體檢測 給藥結(jié)束后，毛細(xì)玻璃管采集眶靜脈血，常溫凝血15 min后，2 000 r/min離心5 min，取上層血清。分別按照大鼠TgAb、TPO-Ab、IL-35檢測試劑盒使用說明書操作步驟測定大鼠血清中TgAb、TPO-Ab、IL-35含量。

1.6.2 組織病理學(xué)檢測 眼眶取血完成后用頸椎脫臼法處死所有大鼠，取大鼠甲狀腺組織，并用10%中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，行HE染色。光鏡下觀察甲狀腺組織病理形態(tài)改變，包括濾泡大小、上皮形態(tài)、上皮及濾泡間的淋巴細(xì)胞浸潤等。

1.6.3 Western blotting法檢測STAT3、p-STAT3、STAT1、p-STAT1蛋白的表達(dá)情況 常規(guī)方法提取甲狀腺組織總蛋白，調(diào)整蛋白濃度至2.5 g/L，以30 μg/孔上樣經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，按照抗體說明書分別加入特異性一抗（STAT3，p-STAT3，STAT1，p-STAT1）4℃孵育過夜。次日，TBST漂洗15 min，更換為HRP偶聯(lián)的二抗常溫孵育2 h。棄二抗，TBST漂洗15 min后加入ECL發(fā)光液顯影并采集圖像分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，對(duì)各組進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)與方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中TgAb、TPO-Ab水平比較造模完成后，與正常組比較，模型組大鼠血清中TgAb和TPO-Ab水平明顯升高（P＜0.05）。而陽和湯預(yù)防組大鼠血清中TgAb和TPO-Ab水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模完成，繼續(xù)給藥6周后，與模型組比較，陽和湯治療組和陽和湯預(yù)防組大鼠血清中TgAb和TPO-Ab水平明顯降低，同時(shí)兩組大鼠血清中TgAb和TPO-Ab水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖1）

圖1 各組大鼠血清中TgAb和TPO-Ab水平比較（±s，n=6）

2.2 各組大鼠甲狀腺組織病理學(xué)形態(tài)觀察正常組大鼠甲狀腺濾泡呈類圓形或多邊形，濾泡上皮細(xì)胞排列整齊，濾泡腔內(nèi)充滿淡紅色的膠質(zhì)，未見巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞炎癥浸潤；模型組大鼠甲狀腺濾泡腔萎縮，膠質(zhì)明顯減少，大部分濾泡上皮組織增生，出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤；陽和湯治療組大鼠甲狀腺濾泡形態(tài)較規(guī)則，與模型組比較，淋巴細(xì)胞炎癥浸潤有明顯改善；陽和湯預(yù)防組大鼠甲狀腺濾泡形態(tài)基本規(guī)則，含少量膠質(zhì)，邊間不清楚，少量淋巴細(xì)胞浸潤，與陽和湯治療組相比無明顯區(qū)別。

2.3 各組大鼠血清炎癥因子IL-35水平比較與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-35表達(dá)明顯降低，且IL-35與TPO-Ab表達(dá)水平呈密切負(fù)相關(guān)。而陽和湯治療組大鼠體內(nèi)該現(xiàn)象部分緩解，IL-35表達(dá)明顯升高，同時(shí)陽和湯預(yù)防組大鼠血清IL-35表達(dá)水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖3～4）

圖3 各組大鼠血清炎癥因子IL-35水平比較（±s，n=6）

圖4 EAT大鼠外周血IL-35和TPO-Ab表達(dá)水平相關(guān)性分析

2.4 各組大鼠PBMC中STAT1/STAT3信號(hào)通路激活情況比較各組大鼠PBMC中STAT1和STAT3的表達(dá)無明顯變化，而模型組大鼠PBMC中p-STAT1表達(dá)明顯降低，p-STAT3明顯升高。陽和湯治療大鼠PBMC中p-STAT1表達(dá)高于模型組，而p-STAT3表達(dá)低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明陽和湯治療可以調(diào)控p-STAT1和p-STAT3的表達(dá)，有效干擾EAT大鼠體內(nèi)STAT信號(hào)通路的異常激活。（見圖5）

圖2 各組大鼠甲狀腺組織病理形態(tài)觀察（HE，×200）

圖5 各組大鼠PBMC中STAT信號(hào)通路激活情況（±s，n=6）

3 討 論

近年來，橋本甲狀腺炎（HT）發(fā)病率逐步上升且呈年輕化趨勢[7]。該病的臨床特點(diǎn)是甲狀腺腫大，血清TgAb和TPO-Ab明顯升高，其中TPO-Ab指標(biāo)升高更為顯著[4]。隨著病情進(jìn)展，甲狀腺自身抗體過度合成，嚴(yán)重的自身免疫炎癥損傷甲狀腺濾泡細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，引發(fā)成一系列惡性疾病，包括甲狀腺功能亢進(jìn)癥、甲狀腺功能減退、甲狀腺結(jié)節(jié)甚至甲狀腺癌[8-10]。HT起病較緩，早、中期患者因癥狀隱匿臨床較少發(fā)現(xiàn)，后期患者確診時(shí)常合并甲狀腺功能減退，臨床表現(xiàn)以代謝功能降低為特征，主要為甲狀腺彌漫性或結(jié)節(jié)性腫大、質(zhì)地韌。患者全身乏力，精神萎靡，表情淡漠；面色白光白，瞼結(jié)膜蒼白，皮膚粗厚脫屑，可有浮腫，腹部脹滿，下肢呈非指凹性浮腫，手足清冷，腰膝酸痛，小便清長，下肢羸弱等。目前西醫(yī)治療HT的主要方法是甲狀腺激素替代治療（僅適用于甲狀腺功能減退患者）、免疫抑制治療、糖皮質(zhì)激素治療，但這些治療均伴隨不同程度的副作用。近幾年來，中醫(yī)藥療法逐漸成為研究熱點(diǎn)。

祖國醫(yī)學(xué)中無HT相應(yīng)的中醫(yī)病名記載，根據(jù)其癥狀表現(xiàn)，其前期屬于“癭病”“心悸”等范疇，后期則可以“虛勞”“水腫”“膚脹”等論之[11-12]，諸多醫(yī)家認(rèn)為稟賦不足、情志內(nèi)傷、風(fēng)熱邪毒損傷[13]、飲食失調(diào)及地理環(huán)境等是本病發(fā)生的主要原因。病位以肝脾腎三臟為主，與心相關(guān)。本病初起多實(shí)，病情遷延則因?qū)嵵缕⒛I陽虧，從而形成本虛標(biāo)實(shí)之證[5]。陽虛不運(yùn)或是本病的病機(jī)核心[14]。后期出現(xiàn)脾腎陽虛、寒痰凝結(jié)的中醫(yī)證候。

清代名醫(yī)王洪緒創(chuàng)立了以陽和湯系列為代表的諸多治療陰疽的名方。陽和湯由熟地黃、肉桂、麻黃、鹿角膠、白芥子、姜炭、生甘草組成。王氏認(rèn)為：“陰疽治之之法，非麻黃不能開腠理，非肉桂、炮姜不能解其寒凝，此三味雖酷暑，不可缺一也。腠理一開，寒凝一解，氣血乃行，毒邪隨之消矣。”陽和湯全方有溫陽補(bǔ)血、宣通血脈、散寒祛痰之功，用于陰疽之證，猶如離照當(dāng)空，陰霾自散，可化陰凝而使陽和，故以“陽和”名之[15]。臨床上用此治療陰疽，療效確切。近代外科名家馬培之嘗謂：“以陽和湯治陰疽，無出其右，用之得當(dāng)，應(yīng)手而愈”。

免疫誘導(dǎo)法是目前構(gòu)建HT實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的最常用方法，建模成功的標(biāo)準(zhǔn)主要為出現(xiàn)甲狀腺自身抗體及甲狀腺組織有淋巴細(xì)胞浸潤[16]。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠血清中TPO-Ab和TgAb水平明顯高于正常組（P＜0.01），甲狀腺組織濾泡形態(tài)皺縮，濾泡腔內(nèi)膠質(zhì)明顯減少，可見大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞炎性浸潤，表明EAT大鼠模型構(gòu)建成功，該模型用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。陽和湯連續(xù)灌胃6周后，陽和湯治療組較模型組大鼠血清中TPO-Ab、TgAb水平顯著降低。而陽和湯預(yù)防組大鼠血清中TPO-Ab、TgAb水平與模型組大鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在橋本甲狀腺炎早期，陽和湯治療無效。體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治的精髓。以方測證，橋本甲狀腺炎早期并非陽虛痰凝證，不能達(dá)到降抗體的作用。以上結(jié)果表明陽和湯對(duì)自身免疫性甲狀腺炎有改善作用。

目前橋本甲狀腺炎發(fā)病機(jī)制并不明確，TPO-Ab升高可引起多種免疫性疾病，增加流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，長期血清TPO-Ab抗體升高伴隨發(fā)生抑郁、焦慮等神經(jīng)行為學(xué)改變。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清中IL-35水平明顯降低，說明EAT大鼠體內(nèi)免疫抑制。陽和湯干預(yù)后，血清中IL-35表達(dá)水平升高，且IL-35表達(dá)與TPO-Ab水平呈密切負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果提示陽和湯通過升高血清IL-35水平來降低TPO-Ab水平。IL-35作為刺激Treg細(xì)胞分化的免疫因子，其表達(dá)顯著升高標(biāo)志著EAT病理進(jìn)程中Treg細(xì)胞比例顯著升高。此外，許多研究證明STAT3信號(hào)通路異常與EAT進(jìn)展密切相關(guān)，如何有效抑制STAT3通路激活可作為EAT治療的切入點(diǎn)進(jìn)行深入研究。EAT發(fā)病伴隨著p-STAT3表達(dá)升高，而適量的依達(dá)拉奉和木犀草素均可有效抑制EAT大鼠體內(nèi)p-STAT3的升高[17-18]。本研究表明陽和湯也有類似的功效，有效抑制了STAT3信號(hào)通路的激活。根據(jù)以上結(jié)果，我們猜想陽和湯通過促進(jìn)血清中IL-35水平升高，刺激體內(nèi)Treg細(xì)胞分化，進(jìn)而降低自身免疫抗體表達(dá)水平，減少甲狀腺淋巴細(xì)胞的浸潤，緩解甲狀腺功能。陽和湯中發(fā)揮功能的有效成分和上調(diào)IL-35的直接作用靶點(diǎn)是我們下一步的研究重點(diǎn)。

綜上，針對(duì)方證相關(guān)的中醫(yī)藥學(xué)核心問題，以經(jīng)典陽和湯方為研究的切入點(diǎn)，本研究應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測技術(shù)和方法，在陽和湯臨床治療有效的前提下，深入探究分子機(jī)制，為陽和湯治療橋本甲狀腺炎提供理論依據(jù)，提出并驗(yàn)證橋本甲狀腺炎發(fā)病的實(shí)質(zhì)為免疫失衡這一假說，而陽和湯的治療基礎(chǔ)亦在于可以糾正這種失衡狀態(tài)。