微生物藥物生物合成途徑解析與優(yōu)化

白林泉毛旭明李永泉王浩鑫沈月毛孫宇輝（ 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 000； 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 0058； 山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 5000； 武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢 007）

微生物藥物生物合成途徑解析與優(yōu)化

白林泉1毛旭明2李永泉2王浩鑫3沈月毛3孫宇輝4
（1 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240；2 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310058；3 山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250100；4 武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430072）

白林泉，上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院教授。主要從事抗腫瘤安絲霉素、抗水稻紋枯病井岡霉素和抗真菌殺念菌素等的生物合成機(jī)理研究、合成生物學(xué)結(jié)構(gòu)改造和比較功能基因組研究。

E-mail:bailq@sjtu.edu.cn

天然微生物藥物的生物合成存在產(chǎn)量低、組分復(fù)雜、周期長、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控等特征，同時(shí)與藥物生物合成相關(guān)的催化基因、調(diào)節(jié)基因、抗性基因和外排基因等成簇排列，初具模塊化特征。在充分挖掘、解析和優(yōu)化多種生物合成元件、模塊、系統(tǒng)及高效底盤的基礎(chǔ)上，合成生物學(xué)整合工程學(xué)理念，采用先設(shè)計(jì)、后實(shí)驗(yàn)的策略，修補(bǔ)和強(qiáng)化微生物藥物合成機(jī)器，高效對接優(yōu)良底盤，實(shí)現(xiàn)微生物藥物合成的高產(chǎn)、高效、降耗和減排，最終推動微生物藥物產(chǎn)業(yè)升級。

微生物藥物被廣泛用于臨床疾病治療、農(nóng)牧林漁業(yè)病害防治和環(huán)境保護(hù)，在保障人類健康和生活質(zhì)量中發(fā)揮著重要作用。目前臨床上使用的藥物中，有一半以上直接來自于微生物天然產(chǎn)物或是其結(jié)構(gòu)修飾衍生物，被用于防治細(xì)菌或真菌感染、腫瘤、糖尿病、免疫性疾病等 。放線菌、真菌、假單胞菌、芽孢桿菌等是主要的藥物產(chǎn)生菌，其中筆者所研究的以鏈霉菌屬為主的放線菌是微生物藥物的主要來源，產(chǎn)生了包括以利福霉素為代表的安莎類、以慶大霉素為代表的氨基糖苷類、以那他霉素為代表的多烯大環(huán)內(nèi)酯類、以井岡霉素為代表的氨基環(huán)醇類等多種結(jié)構(gòu)類型的天然生物活性物質(zhì)。

放線菌等微生物作為土壤、海洋等環(huán)境中復(fù)雜微生物區(qū)系的成員，產(chǎn)生的活性物質(zhì)具有一定的生態(tài)學(xué)意義。一是具有保護(hù)自身免受周圍其他病原侵染的作用，二是作為微生物間的信號分子傳遞種群信息 。因此，微生物天然活性物質(zhì)的產(chǎn)生存在產(chǎn)量低、多菌共存、調(diào)控信號復(fù)雜、結(jié)構(gòu)多樣、產(chǎn)生菌依附于固體基質(zhì)表面等自然屬性。而將其放入發(fā)酵罐作為微生物藥物細(xì)胞工廠后，其生物技術(shù)特征應(yīng)該是產(chǎn)量高、組分單一、單菌發(fā)酵、調(diào)控單一有效、大規(guī)模液體發(fā)酵。長期的常規(guī)育種和工藝優(yōu)化，以及基于生物合成機(jī)理研究的代謝工程改造，使得微生物藥物的發(fā)酵生產(chǎn)有了長足的改善，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化和臨床應(yīng)用。但是，對多種重要的臨床藥物來講，尤其是與大宗初級代謝生物產(chǎn)品相比，其產(chǎn)量仍然太低，還存在多組分并存、基質(zhì)利用率低、有機(jī)質(zhì)排放量高、得率低等瓶頸問題，制約著微生物藥物生產(chǎn)的全面升級。

功能基因組學(xué)基礎(chǔ)上的系統(tǒng)生物學(xué)研究使得我們對微生物藥物合成的反應(yīng)、途徑、調(diào)控、產(chǎn)生菌與發(fā)酵環(huán)境互作等有了全面的認(rèn)識。但只有合成生物學(xué)新領(lǐng)域的誕生，才能夠打破菌種甚至物種的界限，廣泛收集與微生物藥物合成的催化、輔因子、調(diào)控、外排、抗性等相關(guān)的元件與模塊，并改造和利用優(yōu)勢明顯的底盤宿主，系統(tǒng)考慮元件、模塊、系統(tǒng)和底盤等的適配性、魯棒性、進(jìn)行性，定向?qū)崿F(xiàn)單一組份微生物藥物的高效、綠色生產(chǎn)，大幅降低生產(chǎn)成本。接下來，筆者以安莎類和氨基糖苷類的生物合成催化元件挖掘、那他霉素和達(dá)托霉素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析與改造、井岡霉素產(chǎn)生菌為基礎(chǔ)的底盤改造等為主來闡述這幾類微生物藥物的合成生物學(xué)進(jìn)展。

1 安莎類藥物生物合成催化元件的挖掘和適配性研究

安莎類是一類重要的大環(huán)內(nèi)酰胺類活性化合物，其中最著名的有抗結(jié)核病的利福霉素、抗腫瘤的格爾德霉素和美登木素。安莎類化合物以特殊的3-氨基-5-羥基苯甲酸為起始單元，經(jīng)由I型聚酮途徑裝配，通過獨(dú)特的酰胺合酶進(jìn)行聚酮鏈的釋放與環(huán)化。安莎類化合物的

Koehn F, Carter G. The evolving role of natural products in drug discovery. Nat Rev Drug Discov, 2005, 4: 206-220.

Liu G, Chater K F, Chandra G, et al. Molecular regulation of antibiotic biosynthesis in Streptomyces. Microbiol Mol Biol Rev, 2013, 77: 112-143.

Kang Q, Shen Y, Bai L. Biosynthesis of 3,5-AHBA-derived natural products. Nat Prod Rep, 2012, 29: 243-263.

Zhang J, Qian Z, Wu X, et al. Juanlimycins A and B, ansamycin macrodilactams from Streptomyces sp. Org Lett, 2014, 16: 2752-2755.

Li S, Li Y, Lu C, et al. Activating a cryptic ansamycin biosynthetic gene cluster to produce three new naphthalenic octaketide ansamycins with n-pentyl and n-butyl side chains. Org Lett, 2015, 17:3706-2709.

Kase H, Odakura Y, Nakayama K. Sagamicin and the related aminoglycosides: fermentation and biosynthesis. I. Biosynthetic studies with the blocked mutants of Micromonospora sagamiensis. The Journal of Antibiotics, 1982, 35:1-9.

Unwin J, Standage S, Alexander D, et al. Gene cluster in Micromonospora echinospora ATCC15835 for the biosynthesis of the gentamicin C complex. The Journal of Antibiotics, 2004, 57: 436-445.

Kharel M K, Basnet D B, Lee H C, et al. Molecular cloning and characterization of a 2-deoxystreptamine biosynthetic gene cluster in gentamicin-producing Micromonospora echinospora ATCC15835. Molecules and Cells,2004, 18: 71-78.生物合成基因可以劃分為3個(gè)相對獨(dú)立的模塊：起始單元與延伸單元合成模塊、聚酮延伸模塊和后修飾模塊 。這種模塊化結(jié)構(gòu)使得通過合成生物學(xué)方法制造新安莎藥物成為可能。深度解析已知安莎類化合物的生物合成、調(diào)控機(jī)制，發(fā)掘自然界中存在的其他安莎類產(chǎn)物，建立相應(yīng)的生物合成元件庫，并在此基礎(chǔ)上通過對功能元件與調(diào)控元件的兼容性及適配性優(yōu)化，才可能實(shí)現(xiàn)人工設(shè)計(jì)制造新的安莎類產(chǎn)物，從而獲得具有藥用開發(fā)價(jià)值的候選藥物。

安莎類化合物的多樣性主要源自其生物合成的3個(gè)層次：延伸單元數(shù)目和類型的變化、萘環(huán)形成與否、多樣的后修飾過程。目前，對已知安莎類化合物生物合成與調(diào)控的研究后，已發(fā)現(xiàn)許多催化元件和調(diào)控元件，具體包括負(fù)責(zé)AHBA起始單元合成、不同聚酮鏈延伸單元（乙基、丙基、丁基、異丁基丙二酰CoA和甲氧基丙二酰ACP）合成與加載、延伸和修飾的相關(guān)功能元件；參與萘環(huán)形成和聚酮鏈環(huán)化釋放的功能元件；多樣的后修飾元件（甲基化、羥基化、鹵化、酰基化、糖基化、環(huán)氧化、氧化斷裂和脫水等）。基于高特異性和保守性的AHBA合酶基因序列對自然界中的安莎類化合物多樣性進(jìn)行估計(jì)，顯示自然界中仍存在數(shù)量可觀的安莎類化合物資源。在AHBA合酶基因序列的指導(dǎo)下，筆者成功發(fā)現(xiàn)了兩類新骨架安莎類化合物。Zhang等 從鏈霉菌LC6中首次發(fā)現(xiàn)了二聚化的5酮安莎霉素juanlimycin A 和juanlimycin B。Li等 通過組成型表達(dá)沉默安莎類化合物基因簇中的正調(diào)控基因，從鏈霉菌LZ35中發(fā)現(xiàn)了新的8酮萘安莎neoansamycins A-C，該安莎類化合物具有獨(dú)特的長鏈烷烴延伸單元。這兩類新安莎類化合物的發(fā)現(xiàn)，增加了催化安莎二聚化、長鏈烷烴延伸單元加載的功能元件，擴(kuò)展了安莎類化合物的設(shè)計(jì)空間。

盡管研究者們通過對十余種安莎類化合物生物合成途徑的解析，發(fā)現(xiàn)并鑒定了一系列生物合成元件，但是迄今為止尚未實(shí)現(xiàn)用合成生物學(xué)手段成功獲得新安莎類化合物，主要困難是人造合成體系的適配性問題。要解決不適配問題，還需更深入地理解安莎類化合物的生物合成機(jī)制，包括萘安莎中的萘環(huán)形成、酰胺合酶催化的鏈釋放與環(huán)化、復(fù)雜后修飾等。這些機(jī)理的闡明，將使制造任意大小環(huán)系的安莎類化合物成為可能，極大地?cái)U(kuò)展結(jié)構(gòu)空間，實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)修飾的多元化。簡言之，在深度解析生物合成機(jī)理的基礎(chǔ)上，充分考察安莎類化合物合成途徑中各元件的兼容性，并進(jìn)一步利用計(jì)算手段進(jìn)行輔助設(shè)計(jì)和改造，同時(shí)兼顧重構(gòu)途徑與底盤生物的適配性，才有可能真正實(shí)現(xiàn)新安莎類藥物的定向制造。

Park J W, Hong J S, Parajuli N, et al. Genetic dissection of the biosynthetic route to gentamicin A2 by heterologous expression of its minimal gene set. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008, 105: 8399-8404.

Li D, Li H, Ni X, et al. Construction of a gentamicin C1a-overproducing strain of Micromonospora purpurea by inactivation of the gacD gene. Microbiological Research, 2013, 168: 263-267.

Kim H J, Mccarty R M, Ogasawara Y, et al. The GenK-catalyzed C-6' methylation in the biosynthesis of gentamicin: isolation and characterization of a cobalamin-dependent radical SAM enzyme. J Am Chem Soc, 2013, 135: 8093-8096.

S h a o L, C h e n J, Wa n g C, e t a l. Characterization of a key aminoglycoside phosphotransferase in gentamicin biosynthesis. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2013, 23: 1438-1441.

Guo J, Huang F, Huang C, et al. Specificity and promiscuity at the branch point in gentamicin biosynthesis. Chem Biol, 2014, 21:608-618.

Huang C, Huang F, Moison E, et al. Delineating the biosynthesis of gentamicin x2, the common precursor of the gentamicin C antibiotic complex. Chem Biol, 2015, 22: 251-261.

2 氨基糖苷類慶大霉素的生物合成解析

慶大霉素是典型的氨基糖苷類抗生素，其抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，多用于與其他抗菌藥物聯(lián)合用藥治療革蘭陰性桿菌或耐藥革蘭陽性菌所致的嚴(yán)重感染，曾在臨床上得到廣泛應(yīng)用。對慶大霉素生物合成的探究始于各藥用組分及中間產(chǎn)物的分離。通過對小單孢菌及其突變株的大量發(fā)酵和產(chǎn)物分析，逐步鑒定出了慶大霉素A、A1、A2、A3、B、X2、JI-20A以及JI-20B等含量較低的氨基糖苷類化合物。Tilley和Nakayama等 基于代謝缺陷型突變株的一系列底物喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，提出了慶大霉素可能的生物合成路線，其中慶大霉素X2位于分支點(diǎn)的位置，之后涉及一系列的氧化、還原、轉(zhuǎn)氨、C-和N-甲基化及從單糖上脫去兩個(gè)羥基等的反應(yīng)。

2004年，Wellington等 三個(gè)研究組分別完成了慶大霉素生物合成基因簇的克隆及測序，并通過生物信息學(xué)比對預(yù)測了各基因可能的功能。Sohng研究組在大腸桿菌中表達(dá)了GtmA，通過體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)確證了其可將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為2-DOI，并且發(fā)現(xiàn)含有g(shù)tmJ的變鉛青鏈霉菌表現(xiàn)出對慶大霉素的抗性；4年后，Yoon 研究組 在不產(chǎn)生氨基糖苷抗生素的委內(nèi)瑞拉鏈霉菌中，實(shí)現(xiàn)了慶大霉素生物合成部分基因的異源表達(dá)，確證了從葡萄糖-6-磷酸到慶大霉素A2的生物合成路徑；夏煥章研究組 同框敲除了野生型中的genK，從而阻斷了慶大霉素X2到G418的轉(zhuǎn)化，且使終產(chǎn)物C2、C2a和C1消失，再次確證了genK的功能；劉鴻文研究組 以重組GenK蛋白進(jìn)行了體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)，確證了GenK催化慶大霉素X2上6'-C的甲基化形成G418的過程，并通過定量分析和動力學(xué)監(jiān)測，對GenK的體外催化機(jī)制進(jìn)行了探討；劉文研究組和陳代杰研究組 合作，使用GenP蛋白進(jìn)行體外催化卡那霉素和阿米卡星，表明GenP負(fù)責(zé)3'-OH的磷酸化，由此推測GenP參與慶大霉素生物合成中二號環(huán)位脫羥基過程。

2014年，筆者課題組與Leadlay研究組 合作，通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地揭示了由中間體G418到JI-20A和JI-20B的轉(zhuǎn)化過程，以及相應(yīng)的genQ和genB1的功能，同時(shí)證明了GenB2催化慶大霉素C2和C2a之間的相互轉(zhuǎn)化，并對脫氫酶GenB3 和GenB4的功能進(jìn)行了詳細(xì)的探究 。另外，筆者課題組還嚴(yán)密地從分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)和化學(xué)生物學(xué)的角度解析了由慶大霉素A2到最終慶大霉素C復(fù)合物的關(guān)鍵共同中間體——慶大霉素X2的生物合成機(jī)制。即在氧化還原酶GenD2和轉(zhuǎn)氨酶GenS2連續(xù)催化下，慶大霉素A2 C-3''位的仲醇首先轉(zhuǎn)變成了胺。隨后，SAM依賴型N-甲基轉(zhuǎn)移酶GenN促使胺發(fā)生特異性甲基化，形成了慶大霉素A。最后，在SAM 依賴型和鈷胺素酶GenD1的催化下，C-4''位發(fā)生C-甲基化形成了慶大霉素X2。這一結(jié)果為后續(xù)慶大霉素完整生物合成機(jī)制的全面破解奠定了基礎(chǔ) 。

慶大霉素從被發(fā)現(xiàn)至今已歷經(jīng)50余年，其大部分的生物合成途徑已被闡明，但仍有部分關(guān)鍵的合成步驟有待破解。徹底闡明其長久以來懸而未決的生物合成機(jī)制將對人們通過合成生物學(xué)進(jìn)行高效、安全的氨基糖苷類抗生素的定向優(yōu)化和創(chuàng)新提供重要依據(jù)。

3 微生物藥物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析與理性重組

生物體內(nèi)啟動子是基因表達(dá)的開關(guān)和調(diào)節(jié)器，對啟動子的理性組合和改造可以人為控制下游基因的表達(dá)強(qiáng)度并可預(yù)測生物體的生理行為。在大腸桿菌中，研究者利用乳糖操縱子啟動子、四環(huán)素操縱子啟動子和BAD啟動子，采用自下而上的思路人工構(gòu)建了基因表達(dá)調(diào)控回路。不同的啟動子組合與誘導(dǎo)物誘導(dǎo)強(qiáng)度可人為控制多種形式的基因表達(dá)調(diào)控形式，包括非調(diào)控型、激活型、抑制型、同時(shí)激活抑制型等。這種人工設(shè)計(jì)和改造的調(diào)控通路為改造和預(yù)測更大規(guī)模的體內(nèi)生物行為奠定了基礎(chǔ)。筆者在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了基因表達(dá)濃度梯度調(diào)控技術(shù)，用于改造那他霉素合成酶之間的適配性，利用合成元件的模塊化，建立了合成過程前體供應(yīng)、高速合成、高效轉(zhuǎn)運(yùn)等過程的耦合技術(shù)，全面優(yōu)化了那他霉素的生物合成途徑，結(jié)合補(bǔ)料分批發(fā)酵，使那他霉素的生產(chǎn)達(dá)到國際領(lǐng)先水平。

筆者在環(huán)脂肽類抗生素達(dá)托霉素的生產(chǎn)菌玫瑰孢鏈霉菌中，利用基因簇啟動子dptEp篩選到了達(dá)托霉素生物合成的調(diào)控因子AtrA，并發(fā)現(xiàn)其受保守的A-因子信號途徑調(diào)控，以此改造達(dá)托霉素的轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑，構(gòu)建了產(chǎn)量提高2.5倍的高產(chǎn)菌株 。同時(shí)篩選到一個(gè)ArsR家族負(fù)調(diào)控因子和一個(gè)TetR家族正調(diào)控因子，這兩個(gè)調(diào)控因子與AtrA都結(jié)合在dptEp的不同位點(diǎn)，表明它們通過介導(dǎo)不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制來調(diào)節(jié)達(dá)托霉素生物合成 。據(jù)此，通過組合遺傳策略利用合成生物學(xué)技術(shù)對調(diào)控途徑進(jìn)行了理性重組，構(gòu)建了高產(chǎn)基因工程菌，建立了發(fā)酵工藝優(yōu)化，在華東醫(yī)藥中試車間完成了中試放大，發(fā)酵單位達(dá)2.5g/L以上，有效促進(jìn)了達(dá)托霉素的產(chǎn)業(yè)化。

4 井岡霉素生物合成的多元調(diào)控及底盤改造

Yu P, Liu S, Bu Q, et al. WblAch, a pivotal activator of natamycin biosynthesis and morphological differentiation in Streptomyces chattanoogensis L10, is positively regulated by AdpAch. Appl Environ Microbiol, 2014, 80: 6879-6887.

Mao X, Luo S, Zhou R, et al. Transcriptional regulation of the daptomycin gene cluster in Streptomyces roseosporus by an autoregulator. AtrA. J Biol Chem, 2015, 290(12): 7992-8001.

Wang F, Ren N, Luo S, et al. DptR2, a DeoR-type auto-regulator, is required for daptomycin production in Streptomyces roseosporus. Gene, 2014, 544: 208-215.

Flatt P M, Mahmud T. Biosynthesis of aminocyclitol-aminoglycoside antibiotics and related compounds. Nat Prod Rep, 2007, 24: 358-392.

Wu H, Qu S, Lu C, et al. Genomic and transcriptomic insights into the thermo-regulated biosynthesis of validamycin in Streptomyces hygroscopicus 5008. BMC Genomics, 2012, 13:337.

Tan G Y, Bai L, Zhong J J. Exogenous 1,4-butyrolactone stimulates A-factor-like cascade and validamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus 5008. Biotechnol Bioeng, 2013, 110: 2984-2993.

Tan G Y, Peng Y, Lu C, et al. Engineering validamycin production by tandem deletion of γ-butyrolactone receptor genes in Streptomyces hygroscopicus 5008. Metab Eng, 2015, 28: 74-81.

Qu S, Kang Q, Wu H, et al. Positive and negative regulation of GlnR in validamycin A biosynthesis by binding to different loci in promoter region. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99:4771-4783.

抗水稻紋枯病的井岡霉素（又稱有效霉素）和糖尿病治療藥物阿卡波糖都屬于氨基環(huán)醇類，包含幾十種天然活性產(chǎn)物。氨基環(huán)醇類天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中的C7N氨基環(huán)醇結(jié)構(gòu)都來自于7-磷酸景天庚酮糖的環(huán)化，并共享最初幾步催化反應(yīng)，而且氨基都來源于谷氨酸，因此在生物合成上具有明顯的共性。而其他修飾反應(yīng)（如糖基化、磷酸化、羥化、環(huán)氧化等）的存在，使得氨基環(huán)醇類的結(jié)構(gòu)和活性多元化，從而成為合成生物學(xué)研究的良好材料 。井岡霉素由吸水鏈霉菌井岡變種5008及其衍生菌株產(chǎn)生，工業(yè)產(chǎn)生菌的產(chǎn)量高達(dá)30g/L，產(chǎn)率達(dá)到15g/ （L·d），幾乎是所報(bào)道的產(chǎn)率最高的微生物藥物。從井岡霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，超常的高產(chǎn)率說明井岡霉素產(chǎn)生菌具有高效的磷酸無糖代謝途徑，以提供大量的7-磷酸景天庚酮糖前體物，也應(yīng)該具有很高的有機(jī)氮源（如谷氨酸等氨基酸）含量，同時(shí)井岡霉素結(jié)構(gòu)中存在葡萄糖基，表明該菌株中UDP-葡萄糖的合成能力也很強(qiáng)。因此，井岡霉素產(chǎn)生菌具有成為氨基環(huán)醇類天然產(chǎn)物異源生產(chǎn)所需的底盤宿主的優(yōu)良特征。

筆者解析了井岡霉素野生型產(chǎn)生菌5008的基因組，并開展了37℃發(fā)酵條件下的轉(zhuǎn)錄組分析，初步揭示了井岡霉素高產(chǎn)的生理遺傳基礎(chǔ)及溫度調(diào)控機(jī)制。在37℃條件下，7.5%的蛋白編碼基因的表達(dá)得到顯著提高，展現(xiàn)出特異性的轉(zhuǎn)錄譜變化。首先，基因缺失發(fā)現(xiàn)催化谷氨酸脫氨生成α-酮戊二酸的谷氨酸脫氫酶參與了井岡霉素的合成，并證實(shí)谷氨酸是井岡霉素生物合成的直接氮來源。其次，基因缺失、回補(bǔ)與轉(zhuǎn)錄分析識別了1個(gè)鏈霉菌抗生素調(diào)控蛋白SARP基因負(fù)責(zé)井岡霉素生物合成的溫度調(diào)控。另外，通過1個(gè)與逆性調(diào)節(jié)有關(guān)的sigma因子和2個(gè)heat-shock蛋白的基因缺失實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)井岡霉素生物合成與鏈霉菌的heat-shock調(diào)控系統(tǒng)緊密相關(guān) 。

通過序列分析發(fā)現(xiàn)，在井岡霉素生物合成基因簇的啟動子區(qū)域存在全局性調(diào)控因子AdpA和GlnR的可能結(jié)合位點(diǎn)，暗示井岡霉素的生物合成除了受到高溫的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控外，還受到群體響應(yīng)信號分子A-因子類似物和胞內(nèi)氮代謝水平的影響。深入研究發(fā)現(xiàn)，1,4-丁內(nèi)酯通過刺激吸水鏈霉菌井岡亞種的類A因子級聯(lián)調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)而加強(qiáng)基因簇的轉(zhuǎn)錄，從而提高了井岡霉素的合成效率；全局調(diào)控蛋白AdpA-H通過與井岡霉素基因簇中啟動子區(qū)域相結(jié)合直接控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)對井岡霉素生物合成的調(diào)控；在5008的多套afsA-arpA同源基因系統(tǒng)中，ShbR1與ShbR3能時(shí)序性地負(fù)調(diào)控adpA-H的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)缺失shbR1和shbR3可解除adpA-H的轉(zhuǎn)錄抑制，使其轉(zhuǎn)錄位于較高水平，進(jìn)而通過提高井岡霉素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)抗生素的高產(chǎn) 。另外，分別對井岡霉素生物合成基因簇啟動子區(qū)域的兩個(gè)GlnR結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變。GlnR結(jié)合位點(diǎn)I突變后，井岡霉素的產(chǎn)量提高150%，但是位點(diǎn)II突變卻使井岡霉素的產(chǎn)量減少了50%，表明GlnR通過與啟動子區(qū)域兩個(gè)不同位點(diǎn)結(jié)合，對井岡霉素的生物合成同時(shí)進(jìn)行正調(diào)控和負(fù)調(diào)控。在工業(yè)菌株中高表達(dá)基因glnR，48h井岡霉素的產(chǎn)量也增加了40%左右 。

上述研究不但揭示了井岡霉素的多元調(diào)控機(jī)制和高產(chǎn)機(jī)理，而且通過對多個(gè)全局性調(diào)節(jié)基因和雙向啟動子的改造，在構(gòu)建氨基環(huán)醇類藥物異源高產(chǎn)所需的底盤宿主和高效啟動子方面走出了堅(jiān)實(shí)的一步。對阿卡波糖等氨基環(huán)醇生物合成基因簇的異源表達(dá)研究正在開展之中。

5 總結(jié)與展望

安莎類、氨基糖苷類、多烯大環(huán)內(nèi)酯類、氨基環(huán)醇類微生物藥物種類繁多，但各類的生物合成核心過程類似，同時(shí)又具有多元的結(jié)構(gòu)衍生反應(yīng)，成為合成生物學(xué)不可多得的研究材料。在充分解析生物合成及其調(diào)控機(jī)理的基礎(chǔ)上，合成生物學(xué)指導(dǎo)下的結(jié)構(gòu)和活性改造又能產(chǎn)生多樣而充足的新結(jié)構(gòu)衍生物，為臨床鑒定和治療提供源源不斷的藥物先導(dǎo)物。微生物藥物工業(yè)近50年的發(fā)展積累了多個(gè)藥物的高產(chǎn)菌株，為不同類型藥物的異源高產(chǎn)提供了候選底盤宿主。在不久的將來，用于氨基環(huán)醇類、安莎類、氨基糖苷類、多烯類等的特定底盤及其配套的啟動子、輔因子、外排泵、前體合成等元件和模塊庫將十分充足，最終實(shí)現(xiàn)這些類型藥物的結(jié)構(gòu)多元化及高產(chǎn)。

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10.3969/j.issn.1674-0319.2015.06.006