微生物藥物合成的放線菌底盤

池淏甜 王連榮（武漢大學(xué)藥學(xué)院組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430071）

微生物藥物合成的放線菌底盤

池淏甜 王連榮
（武漢大學(xué)藥學(xué)院組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430071）

王連榮，武漢大學(xué)藥學(xué)院教授，主持新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金委項(xiàng)目等科研基金。主要致力于DNA磷硫?；揎椷@一新型表觀遺傳的修飾特征以及功能研究。

E-mail:lianrong@whu.edu.cn

合成生物學(xué)作為一門新的工程科學(xué)已然成為全世界關(guān)注的焦點(diǎn)。與傳統(tǒng)的研究手段不同，合成生物學(xué)以工程化的思想引導(dǎo)人們有針對(duì)性地設(shè)計(jì)、制造各種元件和體系，將多樣的“生物磚”按“設(shè)計(jì)圖”組裝并在適當(dāng)?shù)牡妆P體系中有效地生產(chǎn)造福人類的新藥物、化學(xué)制品和燃料等，以解決現(xiàn)在所面臨的健康、能源、材料、環(huán)保等問題。文章簡述了合成生物學(xué)的三大飛躍進(jìn)展、生物底盤構(gòu)建的研究進(jìn)展以及放線菌底盤在微生物藥物合成方面的研究進(jìn)展。

1 合成生物學(xué)的研究進(jìn)展

“合成生物學(xué)”這個(gè)名詞很早就已出現(xiàn)，直到2000年E.Kool在美國化學(xué)年會(huì)上重新提出使其得到真正的發(fā)展。2012年2月，合成生物學(xué)被世界經(jīng)濟(jì)論壇（WEF）評(píng)為對(duì)世界影響最大、最有可能為全球面臨的挑戰(zhàn)提供答案的十大新興科學(xué)技術(shù)之一 。這幾年，合成生物學(xué)的快速進(jìn)展，使自然界中生物體蘊(yùn)含著巨大潛能的開發(fā)利用成為可能。人們可以使用新的生物反應(yīng)進(jìn)程和生物體，來實(shí)現(xiàn)一些特殊的目的，如將生物量（一切直接或間接利用綠色植物光合作用形成的有機(jī)物質(zhì)）轉(zhuǎn)化成化學(xué)物質(zhì)、燃料或者其他材料，研發(fā)新的治療藥物保護(hù)人體免受傷害 。合成生物學(xué)飛躍性發(fā)展主要分為三大類：工程工具、生物底盤、合成的微生物菌群。

1.1 工程工具——生物磚

在基礎(chǔ)工程工具范疇內(nèi)，2000年發(fā)生了兩個(gè)具有標(biāo)志性的飛躍，科學(xué)家創(chuàng)造了可以和任何生物系統(tǒng)協(xié)調(diào)的基本生物元件。以普林斯頓大學(xué)的科學(xué)家Michael Elowitz和Stanislas Leibler為首的團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一個(gè)由3個(gè)連鎖基因組成的振蕩器，它可以調(diào)控某些蛋白的產(chǎn)生 。另一個(gè)團(tuán)隊(duì)是以波斯頓大學(xué)的科學(xué)家James Collins為首，他們讓成對(duì)的兩個(gè)基因組成一個(gè)撥動(dòng)開關(guān)，即每個(gè)基因傾向于關(guān)閉另一個(gè)基因 。對(duì)于工程師來說，這樣的振蕩器和撥動(dòng)開關(guān)是最基本的工具，但在生物學(xué)家看來，這是第一個(gè)以可預(yù)測的方法來調(diào)控生物系統(tǒng)的可靠手段。

隨著越來越多的生物元件被開發(fā)，麻省理工學(xué)院在2003年成立了“標(biāo)準(zhǔn)生物組件登記冊”以促進(jìn)生物元件的分享與使用。2006年，麻省理工學(xué)院的Tom Knight和他的合作者發(fā)起了“生物磚基金會(huì)”，確保了生物元件管理的安全性和可靠性，使生物元件的標(biāo)準(zhǔn)化順利推進(jìn)。目前這些“生物磚”的數(shù)量已達(dá)一萬種且免費(fèi)供應(yīng)。麻省理工學(xué)院舉辦的年度國際基因工程競賽（iGEM）更是吸引了世界各地的大學(xué)生用“生物磚”組裝出多種多樣且充滿創(chuàng)意的產(chǎn)品，如美國加州大學(xué)伯克利分校的學(xué)生創(chuàng)造了Bactoblood，可以利用大腸桿菌制造血紅細(xì)胞替代物，英國劍橋大學(xué)的小組創(chuàng)造了一種對(duì)于特定誘導(dǎo)物的不同級(jí)別能夠產(chǎn)生不同顏色色素的微生物 。

1.2 生物底盤

另一些研究則更注重整體，期望設(shè)計(jì)和構(gòu)建能夠執(zhí)行設(shè)定任務(wù)的生物底盤。人為創(chuàng)造的生物底盤除了基因組不斷精簡外，還必須具有穩(wěn)定的代謝平衡，正常的細(xì)胞生殖和進(jìn)化能力。目前，生物底盤的構(gòu)建主要有兩種技術(shù)路線：自下而上全合成簡約化的基因組；自上而下剔除贅余基因以達(dá)成基因組的簡約化。自下而上的技術(shù)路線是基于合成生物學(xué)與傳統(tǒng)的生物學(xué)完全相反的研究方法，它是將多年以來對(duì)生物體系研究所獲得的知識(shí)和技術(shù)結(jié)合起來從最基本的要素開始將零部件一步步建立成生物體，重塑生命是其核心思想 。2010 年5月20日，D.G. Gibson和他的同事 在文特研究所宣布：世界上第一個(gè)由純?nèi)斯ず铣蓜?chuàng)造的細(xì)菌物種“Synthia”誕生了。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了人工創(chuàng)造生物的可能性和實(shí)踐性。他們將M. mycoides （donor細(xì)菌B）的DNA序列解碼并拷貝到電腦中，設(shè)計(jì)并化學(xué)合成了平均6kb 的DNA鏈，通過同源重組等方法最終組裝得到1.08Mb的基因組。同時(shí)消除Mycoplasma capricolum（細(xì)菌A）的細(xì)胞核，然后將組裝好的細(xì)菌B的DNA移植到細(xì)菌A的細(xì)胞中并激活它。這個(gè)令人興奮的成果是在花費(fèi)了40 000 000美元和15年的等待后得到的，所以采用生物技術(shù)仍是現(xiàn)在最為流行手段去構(gòu)建一個(gè)“人工合成細(xì)胞工廠”。這項(xiàng)研究成果有助于更深入了解生命的起源和生物進(jìn)化。

Lee G N, Na J. The impact of synthetic biology. ACS Synth Biol, 2013, 2(5): 210-212.

Munnelly K. Engineering for the 21st century: synthetic biology. ACS Synthetic Biology, 2013, 2(5): 213-215.

Elowitz M B, Leibler S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature, 2000, 403(6767): 335-338.

Gardner T S, Cantor C R, Collins J J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature, 2000, 403(6767): 339-342.

Vickers C E, Blank L M, Kr?mer J O. Chassis cells for industrial biochemical production. Nature Chemical Biology, 2010, 6:875-877.

Foley P L, Shuler M L. Considerations for the design and construction of a synthetic platform cell for biotechnological applications. Biotechnology and Bioengineering, 2010, 105(1): 26-36.

Gibson D G, Glass J I, Lartigue C, et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science, 2010, 329(5987): 52-56.

Lee S J, Lee S-J, Lee D-W. Design and development of synthetic microbial platform cells for bioenergy. Frontiers in Microbiology, 2014, 4(92): 1-13.

李楊, 陳濤, 趙學(xué)明. 微生物簡化基因組的研究進(jìn)展. 天津大學(xué)2011年博士論壇化工分論壇論文集, 2011: 332-342.

Song H, Ding M Z, Jia X Q, et al. Synthetic microbial consortia: from systematic analysis to construction and applications. Chem Soc Rev, 2014, 43(20): 6954-6981.

Seeberger P H, Werz D B. Synthesis and medical applications of oligosaccharides. Nature, 2007, 446(7139): 1046-1051.

自上而下的技術(shù)路線，主要是針對(duì)遺傳背景已經(jīng)研究的較為清晰的宿主。通過分析基因組的結(jié)構(gòu)和序列，把非必需或贅余的基因序列分批次敲除，使宿主的基因組適度精簡，去除或減小非必需代謝途徑和復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的干擾，使細(xì)胞代謝途徑得以優(yōu)化，細(xì)胞對(duì)底物和能量的利用率以及細(xì)胞的生產(chǎn)性能均得到改善，細(xì)胞生理性能的可預(yù)測性和可控性顯著提高 。關(guān)于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、釀酒酵母、鏈霉菌等模式菌株的簡約化基因組的研究工作已有報(bào)道 。

Cipolla L, Araújo A C, Bini D, et al. Discovery and design of carbohydrate-based therapeutics. Expert Opin Drug Discov, 2010, 5(8): 721-737.

Vogl T, Hartner F S, Glieder A. New opportunities by synthetic biology for biopharmaceutical production in Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol, 2013, 24(6):1094-1101.

Zhou Q M, Wang X F, Liu X J, et al. Curcumin improves MMC-based chemotherapy by simultaneously sensitising cancer cells to MMC and reducing MMC-associated side-effects. Eur J Cancer, 2011, 47(14): 2240-2247.

Du J, Bai W, Song H, et al. Combinational expression of sorbose/sorbosone dehydrogenases and cofactor pyrroloquinoline quinone increases 2-keto-L-gulonic acid production in Ketogulonigenium vulgare-Bacillus cereus consortium. Metab Eng, 2013, 19: 50-56.

Koizumi S, Endo T, Tabata K, et al. Largescale production of UDP-galactose and globotriose by coupling metabolically engineered bacteria. Nat Biotechnol, 1998, 16(9): 847-850.

Endo T, Koizumi S, Tabata K, et al. Largescale production of CMP-NeuAc and sialylated oligosaccharides through bacterial coupling. Appl Microbiol Biotechnol, 2000, 53(3): 257-261.

Tjalsma H, Antelmann H, Jongbloed J D, et al. Proteomics of protein secretion by Bacillus subtilis: separating the "secrets" of the secretome. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2004, 68(2):207-233.

Mizoguchi H, Mori H, Fujio T. Escherichia coli minimum genome factory. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2007, 46(3): 157-167.

Goeddel D V, Heyneker H L, Hozumi T, et al. Direct expression in Escherichia coli of a DNA sequence coding for human growth hormone. Nature, 1979, 281(5732): 544-548.

1.3 合成的微生物菌群

多細(xì)胞微生物菌群的互相作用模型和其潛在的分子機(jī)制的研究是合成生物學(xué)開拓的新領(lǐng)域 ?；谙到y(tǒng)生物學(xué)對(duì)多細(xì)胞生理過程和相互作用的理解，合成的微生物菌群被廣泛用于仿生計(jì)算、化合物和生物能源的生產(chǎn)、藥物和人類健康以及環(huán)境等方面。尤其在微生物藥物方面，合成的微生物菌群主要用于糖核苷酸和低聚糖、腫瘤治療的生物藥品、占全球市場數(shù)十億的抗血凝劑和疫苗的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中～。

在營養(yǎng)制劑方面，K.vulgare和B. megaterium組成的微生物菌群通過兩步發(fā)酵工藝可以用于維生素C的工業(yè)生產(chǎn) 。第一步Gluconobacter oxydans將D-sorbitol轉(zhuǎn)化為L-sorbose，共培養(yǎng)菌K.vulgare和B.megaterium在第二步中將L-sorbose轉(zhuǎn)化成2-keto-L-gulonic acid（2-KLG, 維生素C的前體物）。由于共培養(yǎng)可以加強(qiáng)兩株菌在氨基酸利用時(shí)的合作，共培養(yǎng)菌多次傳代后發(fā)現(xiàn)2-KLG的產(chǎn)量增加了16%。共培養(yǎng)菌中維生素C生產(chǎn)的系統(tǒng)學(xué)分析數(shù)據(jù)（基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)）給之后的優(yōu)化提供了重要信息。Du等 利用這些數(shù)據(jù)對(duì)K.vulgare維生素C的生產(chǎn)途徑進(jìn)行了設(shè)計(jì)、重建和優(yōu)化，將9個(gè)重組克隆轉(zhuǎn)化入K.vulgare后，2-KLG產(chǎn)量增加了20%。在生物藥品方面，Koizumi等 研發(fā)了一個(gè)將乳清酸轉(zhuǎn)化成UDP-galactose和globotriose的大規(guī)模生產(chǎn)體系。這個(gè)合成的微生物菌群主要由兩個(gè)大腸桿菌重組體和產(chǎn)氨短桿菌（Corynebacteriumammoniagenes）組成。表達(dá)galT，galK，galU和ppa的E. coli M522/pNT25/pNT32將半乳糖轉(zhuǎn)化為UDP-Gal，接著表達(dá)IgtC的E. coli NM522/pGT5將乳糖和UDP-Gal轉(zhuǎn)化為globotriose，C.ammoniagenes DN510將乳清酸轉(zhuǎn)化成UTP，而UTP反過來又將被E. coli M522/pNT25/pNT32代謝轉(zhuǎn)化。此外，還有其他低聚糖也用類似方法進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，這些研究包括生態(tài)學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)分析、化學(xué)途徑的設(shè)計(jì)、基因工程等多學(xué)科交叉內(nèi)容，進(jìn)一步表明合成生物學(xué)在生物藥物研發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)中的巨大潛力 。

2 生物底盤的研究進(jìn)展

隨著分析方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷創(chuàng)新，生物底盤成為合成生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，越來越多的研究集中在如何構(gòu)建一個(gè)更容易預(yù)測和控制的生物底盤上，因此很多國家紛紛啟動(dòng)相關(guān)的研究計(jì)劃。歐洲的第五個(gè)框架計(jì)劃中，1998～2002年進(jìn)行“細(xì)胞工程”計(jì)劃。這個(gè)項(xiàng)目旨在全面研究、了解微生物在應(yīng)用領(lǐng)域中的使用。其中杰出的研究成果是將枯草芽孢桿菌的分泌系統(tǒng)概括為“secretome” 。2002年，美國能源部（DOE）科學(xué)局開始基因組到生命（GTL）計(jì)劃。這個(gè)計(jì)劃旨在通過計(jì)算機(jī)模擬和體外實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造一個(gè)人造細(xì)胞。GTL計(jì)劃的一個(gè)重要部分是研究合成基因組學(xué)，John Craig Venter和他的同事試圖創(chuàng)造人工最小基因組用于能量生產(chǎn)和其他應(yīng)用 。2001年，日本由經(jīng)濟(jì)、貿(mào)易和工業(yè)部（METI）及新能源和工業(yè)技術(shù)研發(fā)機(jī)構(gòu)（NEDO）聯(lián)合開展了細(xì)胞工廠項(xiàng)目即基因組簡約化工廠（MGF）項(xiàng)目。在這個(gè)項(xiàng)目中，通過運(yùn)用基因組工程和分析幾種模式菌株的功能基因組學(xué)，構(gòu)建含有可用于工業(yè)用途的必需基因的最小基因組微生物。大腸桿菌基因組精簡幅度高達(dá)38.9%，枯草芽胞桿菌和阿維鏈霉菌的基因組精簡為18%～23%，其他微生物基因組精簡程度低于10%。

大腸桿菌是最好的基因重組宿主之一。20世紀(jì)80年代開始，大腸桿菌生產(chǎn)的商業(yè)產(chǎn)品就被用于醫(yī)藥和發(fā)酵工業(yè)，如重組蛋白、氨基酸和其他化學(xué)制品 。2002年發(fā)表了第一篇大腸桿菌基因組簡約化的報(bào)道 。菌株MG1655中8.1%（376kb）的序列通過將λ噬菌體Red重組酶的同源重組系統(tǒng)與雙鏈斷裂重組修復(fù)系統(tǒng)相結(jié)合的方法被連續(xù)大片段刪除。隨后，Posfai等 報(bào)道大腸桿菌菌株MDS42中15%的基因組序列（0.71Mb）被有計(jì)劃地連續(xù)刪除，消除所有IS序列和毒性基因。與親代菌株MG1655相比，MDS42細(xì)胞生長和蛋白表達(dá)均正常，并且基因組的精簡使菌株具備了意想不到的優(yōu)良屬性，如細(xì)胞電穿孔效率顯著增加。另一個(gè)大腸桿菌菌株MGF-01，基因組精簡比例達(dá)到22%（1.03Mb） 。MGF-01在基本培養(yǎng)基中的生長速率與親代菌株W3110一樣，此外在野生型菌株生長達(dá)到到固定相時(shí)MGF-01還在持續(xù)增長。MGF-01分泌的蘇氨酸量為野生型菌株的兩倍。

Derynck R, Remaut E, Saman E, et al. Expression of human fibroblast interferon gene in Escherichia coli. Nature, 1980, 287(5779): 193-197.

Kolisnychenko V, Plunkett G, Herring C D, et al. Engineering a reduced Escherichia coli genome. Genome Res, 2002, 12(4): 640-647.

Pósfai G, Plunkett G, Fehér T, et al. Emergent properties of reduced-genome Escherichia coli. Science, 2006, 312(5776): 1044-1046.

Westers L, Westers H, Quax W J. Bacillus subtilis as cell factory for pharmaceutical proteins: a biotechnological approach to optimize the host organism. Biochim Biophys Acta, 2004, 1694(1-3): 299-310.

Morimoto T, Kadoya R, Endo K, et al. Enhanced recombinant protein productivity by genome reduction in Bacillus subtilis. DNA Research, 2008, 15(2): 73-81.

Murakami K. Tao E, Ito Y, et al. Large scale deletions in the Saccharomyces cerevisiae genome create strains with altered regulation of carbon metabolism. Appl Microbiol Biotechnol Adv, 2007, 75: 589-597.

Staunton J, Weissman K J. Polyketide biosynthesis：a millennium review. Natural Product Reports, 2001, 18(4): 380-416.

Meier J L, Burkarc M D. Proteomic analysis of polyketide and nonribosomal peptide biosynthesis. Current Opinion in Chemical Biology, 2011, 15(1): 48-56.

Baltz R H. Strain improvement in actinomycetes in the postgenomic era. Journal of Industrial Microbiology Biotechnology, 2011, 38(6): 657-666.

枯草芽孢桿菌是研究最廣泛的模型微生物之一，在工業(yè)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)各種酶 。2008年，Morimoto等 分析了枯草芽孢桿菌中不編碼RNA或基本蛋白質(zhì)的序列片段（大于10kb），排除了部分初級(jí)代謝的基因，采用upp負(fù)選擇標(biāo)記的敲除技術(shù)，獲得了簡化菌株（敲除20.7%基因組，0.874Mb），菌株生長速率比野生型略微降低，但細(xì)胞形態(tài)和染色體分布基本保持不變。利用此菌株表達(dá)堿性纖維素酶及堿性蛋白酶的活性分別比野生株提高1.7和2.5倍。除了在原核生物中進(jìn)行了一系列簡化基因組的研究外，Murakami等 通過軟件分析釀酒酵母染色體，排除已知必需基因及某些刪除可能導(dǎo)致細(xì)胞致死、不利的基因，利用PCR介導(dǎo)染色體分裂技術(shù)，經(jīng)過多步操作獲得了缺失5%（531.5kb）的基因組簡化菌株，此菌株的乙醇產(chǎn)量比野生型增加1.8倍，甘油產(chǎn)量增加2倍。

張能江，姚遠(yuǎn). 組合生物合成研究進(jìn)展. World Notes on Antibiotics, 2011, 32(1):10-15.

Claessen D, de Jong W, Dijkhuizen L, et al. Regulation of Streptomyces development: reach for the sky! Trends Microbiol, 2006, 14(7): 313-319.

Komatsu M, Uchiyama T, Omura S, et al. Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, 107(6): 2646-2651.

Ikeda H, Ishikawa J, Hanamoto A, et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the industrial microorganism Streptomyces avermitilis. Nat Biotechnol, 2003, 21(5): 526-531.

Ikeda H, Kazuo S Y, Omura S. Genome mining of the Streptomyces avermitilis genome and development of genome-minimized hosts for heterologous expression of biosynthetic gene clusters. J Ind Microbiol Biotechnol, 2014, 41(2): 233-250.

Wang T, Bai L, Zhu D, et al. Enhancing macrolide production in Streptomyces by coexpressing three heterologous genes. Enzyme Microb Technol, 2012, 50(1): 5-9.

Komatsu M, Uchiyama T, Omura S, et al. Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107(6): 2646-2651.

Nguyen K D, Au-Young S H, Nodwell J R. Monomeric red fluorescent protein as a reporter for macromolecular localization in Streptomyces coelicolor. Plasmid, 2007, 58(2): 167-173.

Komatsu M, Komatsu K, Koiwai H, et al. Engineered Streptomyces avermitilis host for heterologous expression of biosynthetic gene cluster for secondary metabolites. ACS Synth Biol, 2013, 2(7): 384-396.

3 放線菌底盤的研究進(jìn)展

鏈霉菌是具有顯著優(yōu)良特性的微生物，可以產(chǎn)生多種在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和生物研究等方面具有重要價(jià)值的次級(jí)代謝物，包括抗生素和其他具有生物活性的物質(zhì)。這些結(jié)構(gòu)多樣的代謝物不僅具備抗細(xì)菌、真菌、病毒和腫瘤的活性，而且還有免疫抑制和抗高血壓的性能 。隨著后基因組時(shí)代的來臨，分子遺傳學(xué)和基因工程的發(fā)展，以及基因組學(xué)和蛋白組學(xué)等學(xué)科的深入研究，鏈霉菌代謝途徑的相關(guān)信息變得越發(fā)清晰，使得對(duì)次級(jí)代謝合成途徑中涉及的一些蛋白的編碼基因進(jìn)行操控、改變生物合成途徑變得可能。合成生物學(xué)在鏈霉菌領(lǐng)域的研究成為熱點(diǎn) ，鏈霉菌底盤的研究更為深入。

3.1 底盤的構(gòu)建流程

鏈霉菌的基因組與其他原核生物相比較大，且形態(tài)分化和代謝途徑也較為復(fù)雜 。2011年，Komatsu等 利用CreloxP重組系統(tǒng)分步缺失獲得一系列阿維鏈霉菌基因組最簡化菌株SUKA（精簡比例高達(dá)16.88%～18.54%），并首次將最簡化宿主用于異源表達(dá)次級(jí)代謝生物合成途徑。阿維鏈霉菌9 025 608個(gè)堿基的全基因組測序在2003年完成 。分析發(fā)現(xiàn)線性染色體的復(fù)制起始位點(diǎn)（oriC）與中心區(qū)域偏移了800kb。與其他鏈霉菌的染色體做比對(duì)分析，顯示有1個(gè)6～6.6Mb高度保守的核心區(qū)域，大部分必需基因位于這個(gè)區(qū)域中。另一方面，保守度較低的亞末端染色體區(qū)域主要分布在染色體末端，其中超過半數(shù)的基因都與次級(jí)代謝相關(guān)且沒有發(fā)現(xiàn)必需基因的存在。此外，基因組中分析發(fā)現(xiàn)有111個(gè)基因編碼轉(zhuǎn)座酶，其中左右兩個(gè)亞末端染色體區(qū)域各有87和13個(gè)?；趯?duì)阿維鏈霉菌染色體的深入分析，大片段缺失突變株SUKA2～22的基因組大小是7 509 588～7 352 064 bp，刪除了1 516 020～1 673 544 bp。SUKA可以在無添加的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中正常生長，且不產(chǎn)生任何內(nèi)源次級(jí)代謝物（阿維霉素、寡霉素、菲律賓菌素和萜類化合物）。由于消除了78%的轉(zhuǎn)座酶基因和67%的IS序列，SUKA基因組的穩(wěn)定性增加 。對(duì)于自上而下的技術(shù)路線，通用的構(gòu)建流程是首先結(jié)合比較基因組學(xué)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和代謝、調(diào)控、信號(hào)網(wǎng)絡(luò)模型確定必需基因。然后，選用合適的方法對(duì)非必需基因進(jìn)行缺失得到簡約化的底盤。

3.2 底盤的異源表達(dá)

為了證實(shí)SUKA是一個(gè)通用且高效的宿主，選取了20個(gè)可以合成不同次級(jí)代謝物的異源基因簇在SUKA中進(jìn)行表達(dá)，囊括了氨基糖苷類、核苷類、多肽類、莽草酸酯衍生物和萜類化合物。其中，鏈霉素、頭孢氨芐C以及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素pladienolide的合成相關(guān)基因簇分別導(dǎo)入突變株中并檢測產(chǎn)物表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)鏈霉素和頭孢霉素C產(chǎn)量高于原產(chǎn)菌株，在導(dǎo)入調(diào)控基因pldR后，突變株可以合成pladienolide。同時(shí)，經(jīng)密碼子優(yōu)化后的合成基因也可以在基因組簡化的菌株中有效表達(dá)，菌株可以生產(chǎn)植物萜類合成中間前體物質(zhì)（amorpha-4，11-diene） 。多種不同的次級(jí)代謝生物合成基因簇都可以在鏈霉菌底盤宿主中表達(dá)，且有的次級(jí)代謝物的表達(dá)量遠(yuǎn)高于原產(chǎn)菌，這些充分說明鏈霉菌底盤的系統(tǒng)兼容性強(qiáng)、基因組穩(wěn)定性好，這也給未來的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

3.3 生物磚對(duì)底盤的影響

鏈霉菌底盤如同堅(jiān)實(shí)的地基，如何構(gòu)建一個(gè)別具一格的建筑，需要將“生物磚”按照設(shè)計(jì)者的意愿搭建到這個(gè)底盤中。底盤細(xì)胞染色體非必需區(qū)域缺失后并不一定會(huì)出現(xiàn)如同阿維鏈霉菌底盤一樣的優(yōu)良性能，這就需要將特殊功能的“生物轉(zhuǎn)”按照設(shè)計(jì)者的需要裝載到底盤中對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，使其獲得更強(qiáng)的系統(tǒng)兼容性、更快的生長速率，且能夠?qū)λ幬锖铣赏緩竭M(jìn)行高效轉(zhuǎn)化。Streptomyces sp. FR-008中轉(zhuǎn)入一系列優(yōu)勢前體基因，包括全局正調(diào)節(jié)基因（adpA）、透明顫菌氧血紅蛋白基因（vgb）、硫腺苷甲硫氨酸合成酶基因（metK），與對(duì)照野生型FR-008相比，前體基因的導(dǎo)入都使殺念菌素的產(chǎn)量得到了提高 。這為后續(xù)在底盤FR-008中實(shí)現(xiàn)其他微生物藥物量產(chǎn)、優(yōu)產(chǎn)提供了條件。Ikeda在SUKA中用編碼核糖體蛋白S10的基因rpsJ（sav4925）的啟動(dòng)子成功表達(dá)了多個(gè)調(diào)節(jié)基因和異源的生物合成基因簇 。單分子紅色熒光蛋白（mRFP1）報(bào)告系統(tǒng)可以檢測到鏈霉菌中蛋白的定位。多樣的報(bào)告系統(tǒng)作為一種有效的工具用于鏈霉菌中基因表達(dá)的研究，可以用于檢測沉默的次級(jí)代謝基因簇是否被激活 ，以此可以發(fā)掘出更具價(jià)值的新型生物藥物。2012年，美國生物結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室（BAL） 的研究小組開發(fā)出突破性的技術(shù)，他們將藻酸鹽的代謝生物途徑以及胞外解聚的工程化體系整合到基因組中，得到一個(gè)可以同時(shí)降解、吸收并代謝藻酸鹽的生物底盤。這個(gè)生物底盤可以從海藻中提取所有主要的糖類并將這些糖類轉(zhuǎn)變成可再生燃料和化學(xué)品，從而使海藻成為具有成本效益、可再生的生物質(zhì)能源。

4 總 結(jié)

合成生物學(xué)的最新進(jìn)展為更好地操縱生命提供了必要的工具。從基礎(chǔ)的工程元件、生物底盤到多細(xì)胞菌群的深入研究，不僅儲(chǔ)備了更多更優(yōu)良的工具去創(chuàng)造人工生物系統(tǒng)，而且加深了對(duì)生命體的認(rèn)識(shí)。隨著知識(shí)和信息的不斷積累，思想和實(shí)驗(yàn)手段才能進(jìn)一步革新。

合成生物學(xué)讓人們認(rèn)識(shí)到了重塑生命的重要性。如何構(gòu)建一個(gè)各方面性能優(yōu)良的微生物底盤就顯得非常重要。基因組簡約化的底盤并非是基因組越小越好，最重要的是如何在基因組精簡的同時(shí)具有比原始菌株更加優(yōu)良的性能。在傳統(tǒng)的“往外丟”的基礎(chǔ)上，更需要“往里加”，即在簡約化的底盤中加入各種生物元件以此提升自身性能，確保優(yōu)質(zhì)底盤的系統(tǒng)兼容性強(qiáng)、生長速度快、轉(zhuǎn)化效率高、抗逆抗污染能力強(qiáng)等特性。天然藥物的優(yōu)勢前體調(diào)控因子和一些修飾基因引入生物底盤中能夠提高天然藥物產(chǎn)量或增強(qiáng)基因組的穩(wěn)定性。以這樣的優(yōu)質(zhì)底盤為基礎(chǔ)，異源組裝的代謝途徑才能得到最大程度的表達(dá)，也更有利于研究底盤與異源元件之間的適配性。

［本研究得到科技部“973計(jì)劃”課題（2012CB721004）資助。］

■ 反饋服務(wù)編碼 W3615

10.3969/j.issn.1674-0319.2015.06.004