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    超聲波協(xié)同酶法提取紅芪多糖工藝優(yōu)化

    2015-03-02 02:35:47李冰于長(zhǎng)青郝琴張曉雪魏文慧
    中國(guó)食品工業(yè) 2015年7期
    關(guān)鍵詞:紅芪超聲波多糖

    文 / 李冰, 于長(zhǎng)青*, 郝琴, 張曉雪, 魏文慧

    (甘肅省輕工研究院 分離技術(shù)開(kāi)發(fā)中心 天然產(chǎn)物工程技術(shù)研究中心, 甘肅 蘭州730000)

    超聲波協(xié)同酶法提取紅芪多糖工藝優(yōu)化

    文 / 李冰, 于長(zhǎng)青*, 郝琴, 張曉雪, 魏文慧

    (甘肅省輕工研究院 分離技術(shù)開(kāi)發(fā)中心 天然產(chǎn)物工程技術(shù)研究中心, 甘肅 蘭州730000)

    本研究以甘肅道地藥材紅芪為研究對(duì)象,以超聲波協(xié)同酶解技術(shù)為提取方法,利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析,優(yōu)化紅芪多糖的提取工藝。結(jié)果表明,紅芪多糖的最佳提取條件為:提取溫度為60.00 ℃,超聲功率為120.00 W,溶液pH值為5.0,料液比為1:10,用酶量為0.4%,紅芪多糖提取率為5.98%,為超聲波協(xié)同酶解技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用提供理論指導(dǎo)及依據(jù)。

    超聲波; 纖維素酶; 紅芪多糖; 提取率

    紅芪(Radix Hedysari)又叫巖黃芪、晉芪、獨(dú)根[1],系多序巖黃芪(Hedysarum Poly-botrys Hand.-Mazz.)的干燥根,與黃芪同科異屬,為多年生草本[2]。其根多為粗狀、深長(zhǎng),外皮暗紅褐色的直系根[3];主要分布于甘肅宕昌、武都、岷縣、舟曲、臨潭、漳縣、西和、禮縣、武山等地,生于海拔1800~2500米的高原山脊、臺(tái)地及溝谷邊[4,5]。紅芪性溫、味甘,具有補(bǔ)氣固表、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌等功效[6]。紅芪富含多糖、黃酮、皂苷、氨基酸及微量元素等多種有效成分,其中紅芪多糖(HPS)因具有提高超氧化物歧化酶活性,增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗腫瘤等多種生物效應(yīng),一直成為人們研究的熱點(diǎn)[7-10]。

    目前,紅、黃芪多糖的提取方法多為傳統(tǒng)熱水浸提法[5]、超聲波輔助提取法[11]、微波輔助提取法[12]、酶法提取[5]等方法,研究也主要集中在對(duì)某種單一提取方法單因素或多因素的正交優(yōu)選方面,而對(duì)這些提取方法之間的協(xié)同作用的研究所見(jiàn)不多。本文以甘肅道地藥材紅芪為研究對(duì)象,以超聲波協(xié)同酶解技術(shù)為提取方法,利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析,優(yōu)化紅芪多糖的提取工藝,為超聲波協(xié)同酶解技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用提供理論指導(dǎo)及依據(jù)。

    1、材料與方法

    1.1 材料與試劑

    紅芪(購(gòu)置于甘肅省隴南市宕昌縣);纖維素酶(500000~1400000U/g,甘肅華羚生物科技有限公司);檸檬酸(分析純,);無(wú)水乙醇(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);葡萄糖(分析純,天津市北辰方正試劑廠);苯酚(分析純,天津市德恩化學(xué)試劑有限公司);濃硫酸(分析純,天津市百世化工有限公司)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    ACS-A型電子天平(上海友聲衡器有限公司);CTXNW-10B超聲循環(huán)提取機(jī)(北京弘祥隆生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);RE5220型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海榮亞生化儀器廠);RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海榮亞生化儀器廠);SHZ-CB型循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市予華一起有限責(zé)任公司);DL-5M型低速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);DZG-6050型真空干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);AB104-N型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);W201S型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司);722s型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法

    1.3.1 紅芪多糖的提取

    將清洗、干燥后的紅芪原料(水分含量≤13%)粉碎至45目,稱量后加入一定量的蒸餾水,用檸檬酸調(diào)節(jié)至一定pH值后,按酶量/紅芪粉末質(zhì)量百分比加入一定量的纖維素酶,投入超聲波提取裝置,在一定溫度、一定功率條件下間歇超聲(超聲時(shí)間:間歇時(shí)間為1:1)攪拌(80r/min)提取3次,每次30 min。合并提取液,90℃滅酶活,以4000 r/min離心15min,取上層清液,70℃濃縮。濃縮液加入等體積三氯乙酸-正丁醇(V:V=1:10)振蕩?kù)o置分層,收下層水溶液,再以4000r/min離心15min,取上層清液加入無(wú)水乙醇至30%,靜置6h后以4000 r/min離心15min,取沉淀70℃真空干燥得到紅芪多糖。

    1.3.2 紅芪多糖含量的測(cè)定

    總多糖含量 (%):苯酚-硫酸法[13]

    1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    以紅芪多糖提取率為衡量指標(biāo),對(duì)提取溫度、超聲功率、料液比、溶液pH值、酶用量5個(gè)單因素進(jìn)行考察。

    1.3.4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    在單因素的基礎(chǔ)上,采用的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[14],以提取溫度(X1)、超聲功率(X2)、料液比(X3)、溶液pH值(X4)、酶用量(X5)為自變量,展開(kāi)五因素三水平的響應(yīng)曲面試驗(yàn),建立最小二乘法擬合二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型,利用此模型確定超聲波協(xié)同酶法提取紅芪多糖工藝中的最佳提取條件及最大提取率。

    1.3.5 數(shù)據(jù)分析

    單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用ANOVA進(jìn)行方差分析,利用Duncan法進(jìn)行多重比較;響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用F檢驗(yàn)(tape III)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,數(shù)據(jù)分析分別采用Spss19.0和Design Expert7.0軟件。

    2、結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)

    2.2.1 提取溫度的影響

    在料液比1:10,溶液pH值5.0,用酶量為0.6 %,超聲功率120 W條件下,分別探討30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的提取溫度對(duì)紅芪多糖提取率的影響。提取率與提取溫度的關(guān)系見(jiàn)圖1(a)。

    由圖1(a)可知,隨著提取溫度的升高,紅芪多糖的提取率隨之顯著增加(P<0.05),當(dāng)提取溫度達(dá)到50℃時(shí),提取率達(dá)到峰值,這是因?yàn)闇囟鹊纳卟粌H會(huì)使萃取劑的傳質(zhì)系數(shù)增加, 度下降,從而引起多糖分子溶出的增加[15];而且,酶活也逐漸達(dá)到最適溫度,促進(jìn)了酶對(duì)紅芪細(xì)胞壁的分解,使得多糖的提取率增加[13]。當(dāng)溫度超過(guò)50℃,紅芪多糖的提取率隨之顯著降低(P<0.05),這可能是因?yàn)闇囟鹊纳呤沟妹富钚缘慕档突蛎覆糠质Щ?,從而影響了紅芪的水解效果。

    2.2.2 超聲功率的影響

    在料液比1:10,溶液pH值5.0,用酶量為0.6%,提取溫度50℃條件下,分別探討80W、100W、120W、140W、160W的超聲功率對(duì)紅芪多糖提取率的影響。提取率與超聲功率的關(guān)系見(jiàn)圖1(b)。

    由圖1(b)可知,紅芪多糖提取率隨超聲功率的升高而顯著增大(P<0.05),當(dāng)超聲功率超過(guò)120W,紅芪多糖提取率趨于平緩。這說(shuō)明適當(dāng)?shù)纳叱暪β士梢栽鰪?qiáng)超聲波所產(chǎn)生的空穴力,提高多糖分子的運(yùn)動(dòng)使其溶出,并且可能會(huì)一定程度的增強(qiáng)酶的活力,從而促進(jìn)提取過(guò)程中對(duì)紅芪細(xì)胞壁的破壞作用。

    2.2.3 溶液pH值的影響

    在料液比1:10,用酶量為0.6%,提取溫度50℃,超聲功率120W條件下,分別探討2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的溶液pH值對(duì)紅芪多糖提取率的影響。提取率與溶液pH值的關(guān)系見(jiàn)圖1(c)。

    由圖1(c)可知,紅芪多糖提取率隨著溶液pH值的升高而顯著增大(P<0.05),并在pH值為5.0時(shí)提取率達(dá)到峰值,說(shuō)明適宜的pH值會(huì)提高酶和底物的相互結(jié)合,并發(fā)生催化作用,從而使酶解效果達(dá)到最佳。當(dāng)溶液pH值大于5.0時(shí),紅芪多糖提取率隨著pH的增大而顯著降低(P<0.05),這可能由于已過(guò)最適宜pH值所導(dǎo)致的酶活性降低,從而引起提取率的下降。

    2.2.4 料液比的影響

    在溶液pH值5.0,用酶量為0.6%,提取溫度50℃,超聲功率120W條件下,分別探討1:6、1:8、1:10、1:12、1:14的料液比對(duì)紅芪多糖提取率的影響。提取率與料液比的關(guān)系見(jiàn)圖1(d)。

    由圖1(d)可知,隨著溶液體積的增加,紅芪多糖的提取率隨之顯著增加(P<0.05),但料液比達(dá)到1:10之后多糖提取率趨于平緩。這主要是因?yàn)樵黾犹崛∫旱挠昧磕軌蚴苟嗵欠肿映浞值娜艹觯嗵欠肿踊救艹龊笤僭黾犹崛∫旱挠昧恳矡o(wú)法使多糖的提取率有顯著的提升。

    2.2.5 用酶量的影響

    在料液比1:10,溶液pH值5.0,提取溫度50℃,超聲功率120 W條件下,分別探討0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的用酶量對(duì)紅芪多糖提取率的影響。提取率與用酶量的關(guān)系見(jiàn)圖1(e)。

    由圖1(e)可知,隨著用酶量的增加,紅芪多糖提取率呈增加的趨勢(shì),在用酶量為0.3%時(shí)達(dá)到最大,之后隨著酶添加量的繼續(xù)增加,提取率開(kāi)始逐漸減少。這主要是因?yàn)椋?1)加酶量越大,內(nèi)容物釋放量越大,底物減少,使得一部分酶沒(méi)有足夠的底物結(jié)合,從而使多糖提取率下降。(2)酶濃度的增加,多糖中某些糖苷鍵會(huì)被過(guò)量的酶所分解,多糖提取率會(huì)隨之下降。

    圖1 不同因素對(duì)紅芪多糖提取率的影響Fig.1 The influence of different factors on extraction yield of Radix Hedysari

    2.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)

    2.2.1 模型方程的設(shè)計(jì)及結(jié)果

    在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用Box—Behnken設(shè)計(jì)法,對(duì)超聲波協(xié)同纖維素酶法提取紅芪多糖工藝進(jìn)行3因素優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面因素與水平見(jiàn)表1,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

    表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平

    表2 Box—Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

    表3 回歸分析結(jié)果

    由表3可知,該實(shí)驗(yàn)所選模型(P<0.001)差異極其顯著,且失擬項(xiàng)(P>0.05)差異不顯著;模型擬合度R2=0.9490,校正決定系數(shù)Radj2=0.9081,說(shuō)明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合良好,可解釋90.81%的響應(yīng)值變化。擬合方程一次項(xiàng)X2、X3對(duì)紅芪多糖的提取率影響極其顯著(P<0.01);擬合方程二次項(xiàng)X22、X32、X42對(duì)紅芪多糖的提取率影響極其顯著(P<0.01);擬合方程X2X5對(duì)紅芪多糖的提取率影響極其顯著(P<0.01),X1X3對(duì)其提取率影響顯著(P<0.05)。綜上,五因素對(duì)紅芪多糖提取率影響程度由大到小依次為:超聲功率>溶液pH值>料液比>提取溫度>用酶量,且超聲功率與用酶量、提取溫度與溶液pH值存在協(xié)同影響紅芪多糖提取率的作用。

    2.2.2 工藝提取條件的優(yōu)化

    根據(jù)Box-Bwhnken試驗(yàn)所得結(jié)果,結(jié)合回歸模型,預(yù)測(cè)紅芪多糖提取率的最佳工藝條件為:在提取溫度為60.00℃,超聲功率為120.00W,溶液pH值為4.82,料液比為1:10.33,用酶量為0.4%時(shí),提取率為6.06%。為簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作,將其最佳提取條件修正為:提取溫度為60.00℃,超聲功率為120.00W,溶液pH值為5.0,料液比為1:10,用酶量為0.4%

    2.2.3 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

    按修正后最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)得紅芪多糖提取率為5.98%,RSD=1.01(見(jiàn)表4)。實(shí)際測(cè)得紅芪多糖提取率與預(yù)測(cè)值6.06%之間無(wú)顯著差異(P=0.386)。

    表4 最佳提取條件驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

    3 、結(jié)論

    本研究以甘肅道地藥材紅芪為研究對(duì)象,以超聲波協(xié)同酶解技術(shù)為提取方法,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Design Expert軟件,運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),采用響應(yīng)曲面分析法,建立了紅芪多糖提取率與各因素間的擬合模型,對(duì)工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化,獲得了最佳工藝條件:在提取溫度為60.00℃,超聲功率為120.00W,溶液pH值為5.0,料液比為1:10,用酶量為0.4%下,紅芪多糖提取率為5.98%,為超聲波協(xié)同酶解技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用提供理論指導(dǎo)及依據(jù)。

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