利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測外源基因拷貝數(shù)體系的建立

李 斌奧斯曼張冬杰巴桑珠扎趙 麗劉 娣*

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850000；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測外源基因拷貝數(shù)體系的建立

李 斌1，2奧斯曼1張冬杰2巴桑珠扎1趙 麗1劉 娣2*

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850000；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

黑素皮質(zhì)素受體4（Melanocortin receptor 4，MC4R）基因是影響豬生長肥育性能的主效基因之一，是參與調(diào)控體重、采食和能量平衡的關(guān)鍵信號物質(zhì)。動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前主要應(yīng)用于生產(chǎn)珍貴蛋白、基因治療、器官移植、動物品種改良和建立疾病模型等方面。目前人們已經(jīng)獲得了如羊、牛、小鼠、豬等多種轉(zhuǎn)基因克隆動物。確定外源基因的拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)是對后續(xù)外源基因功能探討和表型研究的前提條件。本研究將MC4R基因轉(zhuǎn)入豬PK15細(xì)胞中，挑單克隆，通過3對特異性引物對轉(zhuǎn)染細(xì)胞做PCR擴(kuò)增檢測出陽性細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測外源基因拷貝數(shù)，初步建立了檢測外源基因拷貝數(shù)的實(shí)驗(yàn)體系。

MC4R基因 PK15細(xì)胞 陽性細(xì)胞 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 外源基因拷貝數(shù)

黑素皮質(zhì)素受體4基因（Melanocortin receptor 4，MC4R）是一個單拷貝基因，主要功能是減少體脂，降低體重。僅含有一個外顯子，其編碼序列長度為996bp，編碼332個氨基酸，具有中樞性黑素皮質(zhì)激素的退熱效應(yīng)，在動物的體重、能量穩(wěn)態(tài)和采食量的調(diào)控中具有重要作用。

外源基因拷貝數(shù)一般指外源基因DNA首尾相連的整合到某一生物基因組DNA中的個數(shù)。檢測外源基因的拷貝數(shù)，確定轉(zhuǎn)基因動物的基因型，是成功建立轉(zhuǎn)基因動物模型的基礎(chǔ)，更是后續(xù)基因功能探討和表型研究的前提條件，為動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)珍貴蛋白，基因治療，器官移植，動物品種改良和建立疾病模型等方面提供技術(shù)支持。目前檢測外源基因拷貝數(shù)的方法主要是Southern Blot法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）。有研究表明，Southern Blot法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR對轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)檢測的結(jié)果很接近，只有小部分結(jié)果不一致，主要體現(xiàn)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測結(jié)果要略高于Southern Blot法，理論上講，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測出的拷貝數(shù)可能更接近實(shí)際數(shù)值。

目前，豬上外源基因拷貝數(shù)的實(shí)驗(yàn)體系尚不完善，實(shí)驗(yàn)方法復(fù)雜且實(shí)驗(yàn)可靠性不高，本實(shí)驗(yàn)利用轉(zhuǎn)豬MC4R基因的PK15細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)材料，建立了一套完整的外源基因拷貝數(shù)檢測體系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的pMD18-T載體購自大連寶生物公司，真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的畜牧研究所分子實(shí)驗(yàn)室保存。PK-15細(xì)胞系購自北京構(gòu)思特生物公司，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購自原平皓生物。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)豬MC4R基因細(xì)胞系的建立

根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬MC4R基因序列（GenBank登錄號：NM214173.1）設(shè)計(jì)上下游引物，以豬基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得MC4R基因編碼區(qū)序列。將獲得的MC4R基因序列連入pcDNA3.1（+）載體上。將重組質(zhì)粒（pcDNA3.1（+）-MC4R）瞬時(shí)轉(zhuǎn)入豬PK15細(xì)胞中。做初步藥物篩選并培養(yǎng)單克隆細(xì)胞，提取總基因組，利用3對特異性引物Y1、Y2和Y3（引物序列見表1）對細(xì)胞基因組DNA做PCR擴(kuò)增，進(jìn)行測序比對，篩選出測序結(jié)果一致的陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.2 Real-time PCR方法對外源基因拷貝數(shù)的檢測

設(shè)計(jì)引物Real6 擴(kuò)增pcDNA3.1（+）-MC4R基因片段，Et-p擴(kuò)增管家基因轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TERC）并作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化基因組DNA（引物序列見表1）。采用20 μL 的PCR反應(yīng)體系（SYBR Premix Ex TaqTM，TaKaRa），反應(yīng)液在MicroAmpTMOptical 96-Well Reaction Plate中混勻并用MicroAmpTMOptical Adhesive Film封口。按照儀器ABI7500使用說明書設(shè)置反應(yīng)條件發(fā)，所有的樣品都在同一個96孔板做三次重復(fù)，反應(yīng)結(jié)果通過Sequence Detection System software軟件收集并分析。取平均C（t），數(shù)值用mean±sd表示。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將含有外源基因的質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-MC4R與豬PK-15細(xì)胞DNA混合，設(shè)置含有1個，2個，4個，8個及16個外源基因拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品對照，方法如下：

①假設(shè)豬PK-15細(xì)胞基因組DNA用量為a ng。②含有外源基因的質(zhì)粒的大小為b bp。

③豬PK-15細(xì)胞基因組DNA大小為3×109bp。

④外源基因片段完全隨機(jī)的頭尾相連的插入在一條染色體上，則a ng 的轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組DNA中含有一個外源基因拷貝數(shù)的質(zhì)量為：a×b×0.5/3×109ng。

設(shè)計(jì)引物Real6擴(kuò)增pcDNA3.1（+）-MC4R基因片段，Et-p擴(kuò)增管家基因轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TERC）并作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化基因組DNA（引物序列見表1）。將檢測外源基因片段引物擴(kuò)增C（t）pcDNA3.1（+）-MC4R減去相應(yīng)的內(nèi)參（TERC）基因的擴(kuò)增C（t）TERC得到△C（t），再對樣品拷貝數(shù)的對數(shù)值（以2為底）作圖得到絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 pcDNA3.1（+）-MC4R、TERC基因ReaI-time PCR擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

為了確定real-time PCR擴(kuò)增中C（t）值與拷貝數(shù)的關(guān)系，將pcDNA3.1（+）-MC4R與豬PK15細(xì)胞基因組DNA混合，分別設(shè)置了含有1，2，4，8，16個拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品對照，用real6擴(kuò)增外源基因（88bp），用Et-p擴(kuò)增管家基因TFRC作為內(nèi)參（81bp），每個反應(yīng)做三次重復(fù)（擴(kuò)增曲線為圖1）。取平均C（t）值，用引物real6擴(kuò)增C（t）pcDNA3.1（+）-MC4R值減去相應(yīng)的Et-p擴(kuò)增C（t）TERC值得到△C（t）。將樣品的拷貝數(shù)的對數(shù)（log2N）對△C（t）作圖得到絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。本實(shí)驗(yàn)的分析精確度高，重復(fù)性也很好，同一個標(biāo)準(zhǔn)品的三次重復(fù)C（t）值變化很小。將樣品的拷貝數(shù)的對數(shù)（log2N）對△C（t）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，決定系數(shù)較高（R2= 0.9963）。計(jì)算公式為：△Ct = 1.0032× log2N（拷貝數(shù)）+4.5613（R2= 0.9963，p ＜ 0.001）。對兩個引物擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線分析（圖3），結(jié)果表明兩個溶解曲線分別在77℃和80℃附近有且只有一個單峰，并且兩個引物的陰性對照和空白對照都沒有出現(xiàn)擴(kuò)增峰，說明兩個引物的特異性較好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品pcDNA3.1（+）—MC4R 基因的擴(kuò)增曲線

圖 絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 pcDNA3.1（+）—MC4R 基因和 TFRC 基因的溶解曲線

2.2 外源基因拷貝數(shù)的檢測

Real-time PCR對陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞拷貝數(shù)的檢測結(jié)果如表2所示，標(biāo)準(zhǔn)差在1.7563到0.5721之間，結(jié)果準(zhǔn)確可信。

3 討論

3.1 陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定

轉(zhuǎn)基因動物的研究還處于發(fā)展階段，獲得轉(zhuǎn)基因動物的難度較大，即使外源基因整合到宿主基因組中，檢測也比較困難。目前鑒定陽性個體的方法主要有PCR法和Southern Blot法兩種。Southern Blot雖然靈敏準(zhǔn)確，但是操作很煩瑣，而且費(fèi)用比較高。PCR法則簡單方便，而且靈敏度高，但是很容易出現(xiàn)成假陽性。所以，在本實(shí)驗(yàn)選擇了PCR法的同時(shí)為了避免假陽性的出現(xiàn)，設(shè)計(jì)了3對特異性引物，對外源基因的啟動區(qū)，編碼區(qū)和終止區(qū)均做擴(kuò)增反應(yīng)。將得到的3組PCR擴(kuò)增結(jié)果選擇交集，這樣既避免了假陽性的出現(xiàn)，同時(shí)又確保了轉(zhuǎn)入的外源基因能夠完整表達(dá)，為今后的同類研究提供了可靠的方法。

3.2 外源基因拷貝數(shù)的檢測

在轉(zhuǎn)基因動物中，對外源基因拷貝數(shù)的檢測一直是一個難題。檢測外源基因的拷貝數(shù)，確定轉(zhuǎn)基因動物的基因型，是成功建立轉(zhuǎn)基因動物模型的基礎(chǔ)，更是后續(xù)基因功能探討和表型研究的前提條件。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了利用Real-time PCR檢測外源基因拷貝數(shù)的方法，并對14個陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞做出檢測。我們采用Sybr Green為熒光染料，它能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合，使雙鏈DNA發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，靈敏度極高，很適合檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，ROX熒光染料能很好地屏蔽基底的熒光強(qiáng)度，提供一個穩(wěn)定的檢測基線，進(jìn)一步保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于SYBR Green能夠與所有DNA雙鏈相結(jié)合，不能特異的檢測某一特定模板，所以，提高引物的特異性是實(shí)驗(yàn)成功的決定因素。另外絕對定量PCR方法，內(nèi)參的選擇很關(guān)鍵，本實(shí)驗(yàn)選取TERC作為內(nèi)參，對基因組濃度進(jìn)行標(biāo)化。外源基因片段檢測引物和內(nèi)參檢測引物的擴(kuò)增片段大小相近（分別是81bp和86bp），Tm值也基本相等，擴(kuò)增效率基本一致，很好地起到了內(nèi)參作用。本實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)豬MC4R基因轉(zhuǎn)入豬PK15細(xì)胞中，培養(yǎng)挑單克隆，通過3對特異性引物對轉(zhuǎn)染細(xì)胞做PCR擴(kuò)增檢測出陽性細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測出外源基因拷貝數(shù)，建立了對外源基因拷貝數(shù)，整合位點(diǎn)檢測的實(shí)驗(yàn)體系，與其他同類研究有明顯的優(yōu)越性。

本實(shí)驗(yàn)研究的、方法也有一定不足，如果將內(nèi)參引物和檢測引物用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記，或采用帶有不同熒光基團(tuán)的 Taqman探針標(biāo)記內(nèi)參基因和外源基因的擴(kuò)增片斷，在同一個 反應(yīng)體系中擴(kuò)增，那么定量的結(jié)果更為準(zhǔn)確?？傊?，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用絕對定量PCR法準(zhǔn)確高效的檢測了外源基因拷貝數(shù)，成功建立了絕對定量PCR法檢測外源基因拷貝數(shù)的實(shí)驗(yàn)體系。

4 結(jié)論

表2 陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞拷貝數(shù)檢測結(jié)果

（1）成功構(gòu)建了豬的pcDNA3.1（+）-MC4R表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入豬PK15細(xì)胞中，獲得單克隆細(xì)胞34個。經(jīng)PCR鑒定，16個為陽性細(xì)胞，陽性率為47%。

（2）通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測出16個陽性細(xì)胞中MC4R基因的平均拷貝數(shù)為1.42，構(gòu)建了利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測外源基因拷貝數(shù)的實(shí)驗(yàn)體系。

[1] 王春玲，曹少先，朱冬冬.6個綿羊群體MC4R基因CRS-PCR多態(tài)性及其與湖羊、東湖雜交羊生長性狀的關(guān)聯(lián)分析[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，（1）：121-126.

[2] 孔令富，吳志蕾.MC4R基因、MyoG基因、IGF-I基因與家禽生長性狀關(guān)系的研究進(jìn)展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2011，（4）：25-27.

[3] Sinba P S，Schioth H B，Tatro J B，et al.Activation of central melanocortin-4 receptor suppresses lipopolysaccharide-induced fever in rats[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2003，284（6）：6031-6595.

[4] 左北瑤，錢宏光.MC4R基因研究進(jìn)展[J].中國草食動物，2011，（31）：45-49.

[5] 王懷禹.黑素皮質(zhì)素受體4（MC4R）基因多態(tài)性與動物生長性能的相關(guān)性研究[J].養(yǎng)殖與飼料，2015，（5）：1-4.

[6] Sinba P S，Schioth H B，Tatro J B，et al.Activation of central melanocortin-4 receptor suppresses lipopolysaccharide-induced fever in rats[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2003，284（6）：6031-6595.

[7] 王曉建，楊旭，宋曉東.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠拷貝數(shù)[J].中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)，2007，15（3）：170-174.

[8] 彭劍麗.一次性計(jì)血量產(chǎn)婦紙?jiān)诋a(chǎn)科中的應(yīng)用[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，22（1）：33-34.