高效液相色譜法和紫外分光光度法測定呋喃西林含量的比較研究

吳 誠，曹 淼，張麗平，馬 萍

（中國人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100088）

高效液相色譜法和紫外分光光度法測定呋喃西林含量的比較研究

吳 誠，曹 淼，張麗平，馬 萍

（中國人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100088）

目的建立測定呋喃西林含量的高效液相色譜（HPLC）法，并與紫外-可見分光光度（UV）法進行比較。方法HPLC法以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以0．125%三乙胺緩沖液 -乙腈（85∶15）為流動相，流速為 1 mL／min，檢測波長為 365 nm；UV法檢測波長為375 nm。結(jié)果HPLC法測得3份樣品含量分別為標(biāo)示含量的90．21%，90．73%，89．75%；UV法測得3份樣品含量分別為標(biāo)示含量的95．72%，94．09%，94．73%。結(jié)論UV法比HPLC法測定樣品的含量稍高，但HPLC法更適合作為呋喃西林溶液含量測定的方法。

高效液相色譜法；紫外分光光度法；呋喃西林；含量測定

呋喃西林溶液為局部抗菌藥物，對多種革蘭陽性和陰性菌有抗菌作用，對厭氧菌也有抑制作用，不易產(chǎn)生耐藥性，多用于沖洗腔道、膀胱和濕敷患處，以及滴耳、滴鼻、洗眼等。目前，該院制劑臨床應(yīng)用廣泛，但由于物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性均較差，效期較短，故只能作為醫(yī)院制劑使用。在《中國人民解放軍醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》[1]中，呋喃西林含量測定方法采用紫外-可見分光光度法，操作簡便，精密度較好，但因呋喃西林化學(xué)穩(wěn)定性較差，在制備和貯存過程中較易降解，而該方法不能排除其降解產(chǎn)物的干擾，故準(zhǔn)確度較差。本研究中參照美國藥典USP35，采用高效液相色譜法測定呋喃西林的含量，并與紫外-可見分光光度法進行了比較。

1 儀器與試藥

高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司)，包括DGU-20A3型脫氣機器，LC-20AT型溶液輸送泵，SIL-20A型自動進樣器，CTO-20A型柱溫箱，SPD-20A型紫外檢測器及 LC Solution色譜工作站；Agilent TC-C18色譜柱（安捷倫公司）；呋喃西林對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為 101167-2010001，含量為99．4%）；三乙胺溶液（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號為20120406）、二甲基甲酰胺（北京化工廠，批號為20110114）、磷酸（北京化工廠，批號為20130710）、乙醇等試劑均為分析純，乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18柱（150 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：0．125%三乙胺緩沖液-乙腈（85∶15）；檢測波長：365 nm；流速：1 mL／min；進樣量：10 μL；柱溫：30℃。

2．2 溶液制備

取呋喃西林外用溶液A（中國人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院，批號為130320409）0．5 mL，置10 mL容量瓶中，加入0．02 mL二甲基甲酰胺和2．5 mL乙醇，用蒸餾水稀釋定容，即得供試品溶液。未處理的呋喃西林外用溶液A按供試品溶液制備方法制備對照品溶液。

2．3 陰性干擾試驗

量取0．2 mL二甲基甲酰胺和25 mL乙醇，置100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容，得空白基質(zhì)溶液。精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果表明，基質(zhì)對呋喃西林測定無干擾。

圖1 干擾試驗高效液相色譜圖

2．4 破壞試驗

高溫破壞：取呋喃西林外用溶液A 3 mL，置5 mL安瓿中，鋁蓋封口，121℃熱壓滅菌鍋中放置30 min，溶液冷卻至室溫后按供試品溶液制備方法制備供試液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見圖2 A。

酸破壞：取呋喃西林外用溶液 A 3 mL，置5 mL安瓿中，加入1 mol／L鹽酸調(diào) pH至 1．0，放置1 h，加入 1 mol／L氫氧化鈉調(diào)pH至7．0，按供試品溶液制備方法制備供試液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見圖2 B。

堿破壞：取呋喃西林外用溶液 A 3 mL，置5 mL安瓿中，加入0．1 mol／L氫氧化鈉調(diào) pH至 9．0，放置10 min，加入 0．1 mol／L鹽酸調(diào)pH至7．0，按供試品溶液制備方法制備供試液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見圖2 C。

氧化破壞：取呋喃西林外用溶液A 3 mL，置5 mL安瓿中，加入3%過氧化氫濃溶液1 mL，放置2 h，按供試品溶液制備方法制備供試液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見圖2 D。

光照破壞：取呋喃西林外用溶液 A 3 mL，置5 mL安瓿中，置4 000 lx強光下照射2 h，按供試品溶液制備方法制備供試液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見圖2 E。

圖2 破壞試驗高效液相色譜圖

2．5 線性關(guān)系考察

精密稱取呋喃西林對照品 49．96 mg（純度為 99．4%），置50 mL容量瓶中，加入10 mL二甲基甲酰胺溶解，用乙醇稀釋混勻定容，得呋喃西林貯備液，取10 mL，加入100 mL容量瓶中，用乙醇稀釋混勻定容。分別取稀釋后的溶液6，8，10，12，14 mL，置100 mL容量瓶中，容量瓶中含15 mL乙醇，用蒸餾水稀釋混勻，得質(zhì)量濃度分別為 5．96，7．95，9．93，11．92，13．90 μg／mL的溶液。量取各溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算峰面積，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C）為橫縱標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程 Y=46 439 X+370．57，R2=0．999 9（n=5）。結(jié)果表明，溶液質(zhì)量濃度在 5．96～13．90 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2．6 精密度試驗

取 10 mL呋喃西林貯備液，置100 mL容量瓶中，用乙醇稀釋，混勻，定容。分別取稀釋后的溶液8，10，12 mL，置100 mL容量瓶中，容量瓶中含15 mL乙醇，用蒸餾水稀釋混勻，得質(zhì)量濃度分別為7．95，9．93，11．92 μg／mL的溶液。每個濃度均制備 5個樣本，均測定3 d，計算日內(nèi)、日間精密度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計算準(zhǔn)確度。結(jié)果呋喃西林溶液日內(nèi)精密度的 RSD＜0．5%（n=5），日間精密度的 RSD＜1%（n=9），表明儀器精密度良好。

2．7 回收率試驗

呋喃西林外用溶液處方中只有呋喃西林和水，無其他輔料，但對照品溶液制備時加入二甲基甲酰胺和乙醇，因此考察了二甲基甲酰胺和乙醇是否對呋喃西林的檢測有干擾。分別取呋喃西林外用溶液A 4，5，6 mL，置100 mL容量瓶中，加入0．2 mL二甲基甲酰胺和25 mL乙醇，用水稀釋定容，平行制備3份。另取呋喃西林外用溶液A 4，5，6 mL，置100 mL容量瓶中，直接用水稀釋定容，平行制備 3份。量取上述溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算峰面積，按外標(biāo)法計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 3批樣品回收率測定結(jié)果(n=9)

2．8 對照品溶液室溫放置穩(wěn)定性試驗

取10 mL呋喃西林貯備液，置100 mL容量瓶中，用乙醇稀釋混勻定容。分別取稀釋后的溶液 8，10，12 mL，置100 mL容量瓶中，容量瓶中含15 mL乙醇，用蒸餾水稀釋混勻，得質(zhì)量濃度分別為7．95，9．93，11．92 μg／mL的溶液。將上述溶液放入進樣托盤0，2，4，6，8，10，24 h后測定，考察溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，呋喃西林對照品溶液常溫下較穩(wěn)定，室溫放置24 h，其 RSD＜0．5%（n=9）。

2．9 耐用性試驗

將供試品溶液按擬訂條件進樣分析，進樣量為10 μL，記錄色譜圖呋喃西林主峰的保留時間、峰面積、塔板數(shù)、拖尾因子、分離度等有關(guān)信息。結(jié)果在柱溫、流速、有機相-水相比例發(fā)生較小變動時，塔板數(shù)、拖尾因子、分離度均符合檢測要求，其中，在柱溫為30℃、流速為1．0 mL／min、有機相比例為15%條件下的色譜圖即為系統(tǒng)適用性結(jié)果，各條件下色譜參數(shù)的比較即為耐用性結(jié)果。說明該方法耐用性較好。

2．10 含量測定方法的對比試驗

高效液相色譜法：精密量取呋喃西林外用溶液5 mL，置100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。共檢測3個批號的呋喃西林外用溶液（北京軍區(qū)總醫(yī)院，批號分別為2013081321，2013091812；中國人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院，批號為130602409），每個批號制備3個樣品。取線性關(guān)系考察項下配制的9．93 μg／mL呋喃西林溶液作為對照品溶液，分別量取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，按外標(biāo)法計算呋喃西林溶液含量。結(jié)果見表2。

表2 2種方法呋喃西林溶液含量測定結(jié)果（%）

紫外-可見分光光度法：精密量取呋喃西林外用溶液3 mL，置100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。共檢測3個批號的呋喃西林外用溶液，同高效液相色譜法測定含量項下方法，每個批號制備3個樣品。在375 nm波長處測定吸光度，按C6H6N4O4的吸光系數(shù)（ ）為790計算呋喃西林溶液的含量，結(jié)果見表2。可見，紫外-可見分光光度法測定的含量明顯高于高效液相色譜法。

3 討論

根據(jù)美國藥典USP35呋喃西林溶液的含量測定方法，本研究中建立了測定呋喃西林溶液含量的高效液相色譜法。其中，呋喃西林含量測定使用了三元流動相，即水∶乙腈∶10%（V／V）三乙胺緩沖液=790∶200∶10，而國內(nèi)很多高效液相色譜儀均為二元泵，因此文中根據(jù)三乙胺的用量對該方法進行了換算，并根據(jù)呋喃西林和有關(guān)物質(zhì)的分離度對有機相和水相比例進行了調(diào)整，調(diào)整后的流動相條件為0．125%三乙胺緩沖液∶乙腈=85∶15。

本研究中通過平行比較，用高效液相色譜法和紫外-可見分光光度法測定3個批號的呋喃西林溶液。結(jié)果表明，高效液相色譜法測定的含量結(jié)果較紫外-可見分光光度法低。由于高效液相色譜法是USP35采用的法定方法，且USP35注解中也說明呋喃西林對光和熱均不穩(wěn)定，而紫外-可見分光光度法不能實現(xiàn)呋喃西林和降解產(chǎn)物的有效分離，故認為紫外-可見分光光度法測定的結(jié)果偏高。本試驗中檢測的3個批號的呋喃西林溶液，經(jīng)紫外 -可見分光光度法檢測含量，雖均為合格產(chǎn)品，但用高效液相色譜法檢測含量均已接近合格產(chǎn)品含量范圍的下限（表示含量的90%），在生產(chǎn)中應(yīng)引起關(guān)注。因此也有必要對目前的《中國人民解放軍醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》及其他相關(guān)的呋喃西林溶液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行修訂，采用高效液相色譜法替代紫外-可見分光光度法作為呋喃西林溶液的含量測定方法。

[1]杜占明．中國人民解放軍醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范[M]．北京：人民軍醫(yī)出版社，2002：110．

Comparison Research of HPLC and UV Methods for Determining Nitrofurazone Content

Wu Cheng，Cao Miao，Zhang Liping，Ma Ping
（Department of Pharmacy，The Second Artillery General Hospital of Chinese People′s Liberation Army，Beijing，China 100088）

Objective To establish a high performance liquid chromatography(HPLC)method for determining the nitrofurazone content and to compare it with the ultraviolet(UV)method．Methods With octadecylsilane chemically bonded silica as the filler，0．125% triethylamine buffer solution-acetonitrile solution（85∶15）was used as the mobile phase．The flow rate was 1 mL／min and the wavelength of detection was 375nm by the UV method．Results The nitrofurazone contents of three nitrofurazone solution samples determined by the HPLC method were 90．21%，90．73% and 89．75% of the labeled amount，while those determined by the UV method were 95．72%，94．09% and 94．73% of the labeled amount respectively．Conclusion The determined content of nitrofurazone solution samples by the UV method is slightly higher than that determined by the HPLC method，but the HPLC method is more suitable as the content determination method for the nitrofurazone solution．

HPLC；UV；nitrofurazone；content determination

吳誠，男，主管藥師，研究方向為醫(yī)院新制劑研發(fā)，（電子信箱）wucheng19799＠126．com；馬萍，女，副主任藥師，研究方向為醫(yī)院新制劑研發(fā)及藥物臨床，本文通訊作者，（電子信箱）maping691009＠126．com。

2014－06－14)

2013年軍隊醫(yī)療機構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項課題計劃重點項目，項目編號：13ZJZ22。

R927．2；R979．7

A

1006－4931(2015)04－0034－03