兒童狼瘡性腎炎患者中EB病毒潛伏膜蛋白1的表達(dá)

丁 艷，廖 旺，向 偉，楊慧蘭，何小解，黨西強，易著文

兒童狼瘡性腎炎患者中EB病毒潛伏膜蛋白1的表達(dá)

丁 艷1，2，廖 旺1，向 偉2，楊慧蘭3，何小解4，黨西強4，易著文4

摘要目的 通過實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、腎臟免疫組化和ELISA 3種方法研究兒童狼瘡性腎炎（LN）中EB病毒（EBV）潛伏膜蛋白1（LMP-1）的表達(dá)，試圖探討LMP-1在兒童LN中的致病機制。方法 41例LN患兒和12例健康對照組，分別用RT-PCR法、免疫組化法、ELISA法檢測兩組外周血單核細(xì)胞（PBMCs）、腎臟組織及血清中LMP-1的表達(dá)。結(jié)果 ①RT-PCR法、免疫組化法、ELISA法檢測LN患兒和健康對照者的陽性率分別為65.9%vs 8.3%，95.1% vs 16.7%，22.0%vs 8.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；②3種方法檢測LMP-1的表達(dá)，免疫組化法檢測陽性率高于其他兩種方法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 兒童LN中存在EBV潛伏期基因LMP-1表達(dá)異常，其中腎臟組織中表達(dá)陽性率最高，提示LMP-1可能參與了兒童LN的發(fā)病。

關(guān)鍵詞兒童；狼瘡性腎炎；潛伏膜蛋白1；EB病毒

2015-02-02接收

作者單位：1海南省人民醫(yī)院皮膚科，?？?570102

2海南省婦幼保健院皮膚科，?？?570206

3廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院皮膚科，廣州 510010

4中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心小兒腎臟?？?，長沙410011

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是累及全身多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，表現(xiàn)為T、B淋巴細(xì)胞異?；罨痛罅孔陨砜贵w產(chǎn)生［1］。兒童SLE通常臨床表現(xiàn)較嚴(yán)重，起病時急而重，是兒童時期預(yù)后較差的一種疾病。SLE患者幾乎100%腎活檢發(fā)現(xiàn)有腎臟受累，其中45%～85%有腎損害臨床表現(xiàn)，兒童狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）比成人更普遍、更嚴(yán)重［2-3］。近年來EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染與SLE發(fā)生發(fā)展的關(guān)系已成為SLE研究的熱點［4-5］。EBV具有嗜B淋巴細(xì)胞的特性，可終生潛伏于B淋巴細(xì)胞，對機體免疫系統(tǒng)造成持續(xù)和慢性刺激。EBV基因編碼的抗原和SLE患者的自身抗原有較高的同源性，有誘發(fā)自身免疫的可能［5］。該研究通過實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）、腎臟免疫組化和ELISA 3種方法研究兒童LN中EBV潛伏期基因之潛伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP-1）的表達(dá)，試圖探討LMP-1在兒童LN中的致病機制。

1　材料與方法

1.1 病例資料 實驗組來源于海南省婦幼保健院皮膚科與中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心小兒腎臟?？疲x取了2009年1月～2013年11月收治的LN患兒41例，其中女30例，男11例；年齡6～16 （11.1±2.4）歲。SLE的診斷依據(jù)為1982年美國風(fēng)濕病協(xié)會修正的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，診斷為SLE基礎(chǔ)上行腎穿刺活檢確診為LN。12例健康對照組腎臟組織及靜脈血均來自海南省婦幼保健院小兒外科急診創(chuàng)傷的患兒，患兒及患兒家族中無自身免疫性疾病史。其中女8例，男4例，年齡7～17（12.3±3.3）歲。實驗組和對照組的年齡經(jīng)t檢驗顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義，性別構(gòu)成比比較采用χ2檢驗，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究通過海南省婦幼保健院和中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，每個患兒家屬均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法檢測LMP-1基因的表達(dá) 細(xì)胞分離及RNA提?。撼槿N患兒及健康對照組肝素抗凝靜脈血10 ml。用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離外周血單核細(xì)胞（PBMCs），用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）提取RNA。cDNA合成采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentans公司），反應(yīng)體系：1～5 μg RNA，5×Reaction Buffer 5 μl，2.5 U／μl Poly A Polymerase 1 μl，RT Mix 1 μl，總體積25 μl，37℃反應(yīng)1 h，85℃5 min。實時PCR：采用Icycler IQ實時熒光定量PCR儀（美國Bio-rad公司）檢測EBV基因LMP1的表達(dá)。引物序列由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，LMP1上游引物：5’-TTGGTGTACTCCTACTGATGATCACC-3’，下游引物：5’-AGTAGATCCAGATACCTAAGACAAGT-3’；PCR反應(yīng)體

積為20 μl，反應(yīng)體系為2×SYBR Green qPCR Mix 10 μl，（10 μmol／L）上下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，無酶水7 μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，之后每一步95℃變性10 s，引物58℃退火延伸30 s，共進(jìn)行35個循環(huán)。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線相對定量法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.2 免疫組化法檢測腎臟組織中LMP-1的表達(dá)

腎臟組織塊經(jīng)固定、石蠟包埋、脫蠟、水化及高溫高壓抗原修復(fù)等前期處理后，PBS緩沖液洗片3次，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育10～15 min。滴加一抗（此實驗中一抗無需稀釋）100 μl，置于濕盒內(nèi)，4℃過夜。滴加生物素標(biāo)記羊抗鼠二抗工作液，室溫孵育10～15 min。滴加HRP標(biāo)記鏈霉親和素，室溫孵育10～15 min。PBS漂洗后DAB顯色，在顯微鏡下觀察染色程度；蘇木精復(fù)染（30 s～2 min），1%鹽酸酒精分化（1 s）；自來水沖洗10～15 min；烘干后中性樹膠封片，鏡檢。在均一條件下隨機選取切片的5個視野拍照（×200）。

1.2.3 ELISA法檢測血清中LMP-1抗體的水平ELISA試劑盒購于上海藍(lán)基公司，嚴(yán)格按照說明書操作。結(jié)果判定：置酶標(biāo)450 nm波長處測定樣本吸光度（optical density，OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出各樣本濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。計數(shù)陽性率使用百分比表示，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或使用Fisher精確概率法。

2　結(jié)果

2.1 RT-PCR法檢測LMP-1基因的表達(dá) RTPCR法檢測41例LN患兒和12例健康對照者，發(fā)現(xiàn)27例（65.9%）患兒和1例（8.3%）健康對照者PBMCs中LMP-1基因表達(dá)呈陽性，LN患兒的LMP-1基因表達(dá)的陽性率與健康對照者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝10.12，P＜0.05）。見圖1。

2.2 免疫組化法檢測LN患兒腎臟組織中LMP-1的表達(dá) 41例LN患兒和12例健康對照者腎臟組織中LMP-1蛋白表達(dá)結(jié)果如下：39例（95.1%）LN患兒和2例（16.7%）健康對照者表達(dá)呈陽性，LN患兒腎臟的LMP-1表達(dá)的陽性率與健康對照者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 ELISA法檢測血清中LMP-1蛋白水平 41 例LN患兒和12例健康對照者血清中LMP-1抗體的表達(dá)結(jié)果如下：9例（22.0%）LN患兒和1例（8.3%）健康對照者呈陽性表達(dá)，LN患兒血清的LMP-1抗體表達(dá)的陽性率與健康對照者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 3種方法檢測LN患兒LMP-1表達(dá)陽性率的比較 3種方法檢測LN患兒EBV潛伏期基因LMP-1的表達(dá)，其檢出陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝26.971，P＝0.000）：免疫組化法和ELISA法的檢出陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝42.260，P＜0.001），免疫組化法和RT-PCR法的檢出陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝9.400，P＝0.002）。見表1。

表1　不同檢測方法檢測41例LN患兒LMP-1情況比較

3　討論

國內(nèi)外的大量研究［4-5］表明，SLE患者中EBV血清學(xué)陽性率、病毒載量及EBV基因的表達(dá)都顯著高于健康對照者，提示EBV在SLE的發(fā)病中起著重要的作用。EBV在感染B淋巴細(xì)胞后，表達(dá)多種潛

伏蛋白，LMP-1是其中一種，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，是一種跨膜蛋白，通過激活相關(guān)信號傳導(dǎo)通路介導(dǎo)細(xì)胞異常生物學(xué)行為。LMP1提供替代B細(xì)胞的存活和分化的信號［5］。國外的研究［7-8］表明，LMP-1能夠通過多種機制加重SLE的自身反應(yīng)性，包括直接激活B細(xì)胞，增強B細(xì)胞活化的協(xié)同刺激信號，刺激B細(xì)胞活化因子（BAFF）的產(chǎn)生，能夠協(xié)助打破自我耐受等［9］。本研究通過RT-PCR、免疫組化法和ELISA法檢測均發(fā)現(xiàn)兒童LN的LMP-1的表達(dá)顯著增加，提示LMP-1在兒童LN中可能起到重要的致病作用。

James et al［10］發(fā)現(xiàn)99%的SLE患者為EBV血清學(xué)陽性，Yu et al［11］報道SLE患者外周血中有81.6%為EBV DNA陽性，而健康對照者只有48.9%陽性，本研究顯示使用ELISA法檢測LN患兒血清中LMP-1蛋白的表達(dá)，僅有22%的陽性率，RTPCR法檢測LN患兒血液中LMP-1基因表達(dá)，僅有65.9%的陽性率，均低于國外的研究。考慮可能原因是：①國外EBV血清學(xué)研究是針對EBV殼抗原（VCA）的抗體研究，存在敏感性高但特異性較低的問題。②本實驗是針對LMP-1 DNA的特異性檢測，故檢出率較國外EBV DNA檢測陽性率低。

本實驗41例LN患兒腎臟組織免疫組化檢測結(jié)果顯示95.1%的患兒有LMP-1的表達(dá)，較Yu et al［12］報道的陽性率（58.6%）高，可能與本實驗均為LN兒童患者，兒童的EBV感染率較成人更高、更容易累及腎臟有關(guān)。

3種方法檢測LN患兒LMP-1的表達(dá)，腎臟組織免疫組化陽性率最高，較其它兩種方法有顯著性差異，提示EBV感染表達(dá)的LMP-1可能與兒童LN的腎臟病變有重要關(guān)系，腎臟組織免疫組化可能成為診斷EBV相關(guān)性LN的重要手段，而ELISA法及RT-PCR法檢測血液中LMP-1的表達(dá)可能成為預(yù)示LN的診斷方法。

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The expression of LMP-1 gene in juvenile lupus nephritis

Ding Yan1，2，Liao Wang1，Xiang Wei2，et al
（1Dept of Dermatology，Hainan General Hospital，Haikou 570102，2Dept of Dermatology，Maternal and Child Health Care Hospital of Hainan Province，Haikou 570206）

AbstractObjective To discuss the role of latent membrane protein 1（LMP-1）in the pathgenesis of juvenile lupus nephritis（LN）through investigating expression of LMP-1 by RT-PCR，immunohistochemistry and ELISA.

Methods RT-PCR，immunohistochemistry and ELISA were applied to detect expression of LMP-1 in PBMCs，kid-

ney tissue and serum from 20 patients with LN and 12 healthy control subjects respectively.Results ①There was signifcant difference between juvenile LN patients and healthy controls by RT-PCR，immunohistochemistry and ELISA，Positive rate were 65.9%vs 8.3%，95.1%vs 16.7%，22.0%vs 8.3%，respectively（P＜0.05）.②Positive rates of LMP-1 in juvenile LN were significantly different among three methods and the positive rate detected by immunohistochemistry was higher than the other two methods（P＜0.05）.Conclusion The results demonstrate that there are aberrant expression of LMP-1 gene in juvenile LN，thepositive rate of LMP-1 in kidney tissue is highest，suggesting that LMP-1 gene may contribute to the pathgenesis of juvenile LN.

Key wordsjuvenile；lupus nephritis；latent membrane protein 1；Epstein-Barr virus

作者簡介：丁 艷，女，博士研究生；何小解，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者：E-mail：hexj7150＠163.com；向 偉，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xiangwei8＠163.com

基金項目：海南省自然科學(xué)基金（編號：814314、309079）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0676-04

中圖分類號R 373.9；R 758.69