乳腺癌組織中蛋白Bcl-2的表達(dá)及意義

黃 信， 張 清， 呂榮釗， 何偉麗， 唐 芬， 洪嘉凡， 王寧霞

（暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科，廣東廣州510630）

乳腺癌組織中蛋白Bcl-2的表達(dá)及意義

黃 信， 張 清， 呂榮釗， 何偉麗， 唐 芬， 洪嘉凡， 王寧霞

（暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科，廣東廣州510630）

目的：探討乳腺癌組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)及其意義.方法：應(yīng)用免疫組化方法檢測124例乳腺癌組織中蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，分析其與各臨床病理指標(biāo)及與乳腺癌分子分型的關(guān)系，探討其在預(yù)測乳腺癌預(yù)后中的價值.結(jié)果：Bcl-2的表達(dá)與ER、PR呈正相關(guān)，與腫瘤直徑、組織學(xué)分級、臨床分期、脈管癌栓等不良預(yù)后因素呈負(fù)相關(guān)；Bcl-2在絕經(jīng)前女性低表達(dá)，在Luminal型乳腺癌中高表達(dá)，當(dāng)Bcl-2高表達(dá)時患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率低.結(jié)論：Bcl-2高表達(dá)的乳腺癌患者具有更好的預(yù)后，對內(nèi)分泌治療敏感，為臨床更準(zhǔn)確的進(jìn)行個體化治療提供依據(jù).

乳腺癌； Bcl-2； 預(yù)后

乳腺癌是目前女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升之勢，已成為目前威脅女性生命健康最重要的惡性腫瘤.本實(shí)驗(yàn)通過檢測乳腺癌組織中Bcl-2的表達(dá)情況，分析其與乳腺癌各臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系，探討B(tài)cl-2在乳腺癌診斷、治療及預(yù)后評估中的價值.

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

收集暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科自2008年2月至2012年2月間經(jīng)手術(shù)切除的乳腺癌石蠟組織標(biāo)本124例，所有標(biāo)本均經(jīng)病理HE染色及常規(guī)相關(guān)免疫組化染色，由本院2位以上高年資病理醫(yī)師確診，均具有完整的術(shù)后病理資料.患者均為女性，年齡15～82歲，平均54歲.隨訪截止日期為2013年2月，隨訪時間為12～60個月，中位隨訪時間為43個月，平均41.7個月.其中共有22例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時間.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組織化學(xué)染色：所有乳腺癌組織石蠟標(biāo)本經(jīng)切片機(jī)連續(xù)行4μm厚切片，免疫組化染色采用EnVision兩步法.石蠟切片常規(guī)經(jīng)脫蠟后，將石蠟切片完全浸沒于0.01 mol／L PH6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中，將其密閉放于微波爐中高溫加熱5 min至沸騰后轉(zhuǎn)為低溫中持續(xù)加熱10 min，自然冷卻自室溫進(jìn)行熱誘導(dǎo)抗原修復(fù).切片經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后分別滴加鼠抗人Bcl-2多克隆抗體（1∶250）及Ki-67工作液，4℃溫育過夜.滴加即用型酶標(biāo)記的Ⅱ抗GTVisionTM，室溫濕盒中溫育30 min.二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯示3 min，顯微鏡下觀察切面顯色情況以便及時阻斷，蘇木素襯染，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明后封片，光學(xué)顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果.陽性對照片為已知的陽性表達(dá)片，陰性對照片為PBS液代替Ⅰ抗進(jìn)行，每組每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對照片.

1.3 結(jié)果的判定

Bcl-2的判定標(biāo)準(zhǔn)［1-2］：當(dāng)細(xì)胞漿及核膜中有棕色顆粒的細(xì)胞則為陽性細(xì)胞.每張切片隨機(jī)選擇5個高倍鏡視野，按陽性細(xì)胞數(shù)占視野中乳腺癌細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行分類，幾乎無陽性細(xì)胞為（-），評分為0分；0～25%的細(xì)胞陽性則為弱陽性（＋），評分為1分；25%～75%細(xì)胞呈陽性表達(dá)則為中度陽性（＋＋），評分為2分；當(dāng)陽性細(xì)胞數(shù)比例大于75%時則為強(qiáng)陽性表達(dá)（＋＋＋），評分為3分；0分為Bcl-2陰性，1-3分為Bcl-2陽性.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行比較.用χ2檢驗(yàn)分別比較Bcl-2與乳腺癌各臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性.應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線分析研究Bcl-2與患者無病生存率（DFS）的線性趨勢，應(yīng)用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型研究Bcl-2在評判乳腺癌預(yù)后中的價值.以上所有數(shù)據(jù)以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中蛋白Bcl-2表達(dá)情況

在124例乳腺癌組織中，Bcl-2陽性率為68.5%（85／124），其中Bcl-2（＋）20例，Bcl-2（＋＋）20例，Bcl-2（＋＋＋）45例.

2.2 Bcl-2與各臨床預(yù)后因素的關(guān)系

在乳腺癌組織Bcl-2的表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），在絕經(jīng)前女性Bcl-2呈低表達(dá)（P＜0.05）.與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無明顯相關(guān)（P＞0.05），詳見表1、2.

表1 乳腺癌組織中蛋白Bcl-2與月經(jīng)狀況、腫塊大小的關(guān)系Table 1 The relationship between Bcl-2 protein expression and tumor size、menopausal status

表2 乳腺癌組織中蛋白Bcl-2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期的關(guān)系Table 2 The relationship between Bcl-2 protein expression and lymphatic metastasis、TNM staging

2.3 蛋白Bcl-2與各病理預(yù)后因素的關(guān)系

在乳腺癌組織Bcl-2的表達(dá)與ER、PR的表達(dá)呈正相關(guān)（P≤0.05），與脈管癌栓及組織學(xué)分級呈負(fù)相關(guān)（P≤0.05），與Her-2表達(dá)情況未見顯著差異（P＞0.05），詳見表3，4.

2.4 蛋白Bcl-2與乳腺癌分子分型的關(guān)系

根據(jù)乳腺癌組織中ER、PR、Her-2及Ki-67表達(dá)情況將乳腺癌分為Luminal A型（36例）、Luminal B型（60例）、Her-2過表達(dá)型（11例）及三陰性乳腺癌（27例）.通過樣本構(gòu)成比的比較分析知，Bcl-2在luminal型乳腺癌呈高表達(dá)（P≤0.05）.

表3 乳腺癌組織中蛋白Bcl-2與ER、PR、Her-2的關(guān)系Table 3 The relationship between Bcl-2 protein expression and ER、PR、Her-2

表4 乳腺癌組織中蛋白Bcl-2與脈管癌栓、組織學(xué)分級TNM分期的關(guān)系Table 4 The relationship between Bcl-2 protein expression and lym phovascular and histological grade

2.5 蛋白Bcl-2與患者術(shù)后5年無病生存期的關(guān)系

將所有乳腺癌按Bcl-2表達(dá)情況分為陽性組和陰性組兩大類，其中陽性組85例（68.5%），陰性組39例（31.5%）.應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析顯示Bcl-2陽性表達(dá)者術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移率低，患者有更好的預(yù)后（P≤0.05），見圖1.

圖1 蛋白Bcl-2表達(dá)情況與患者5年無病生存期的關(guān)系Fig.1 The relationship between Bcl-2 protein expression and 5-year disease-free survival

3 討論

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞受到程序化因素控制而發(fā)生的死亡過程，當(dāng)細(xì)胞凋亡受到抑制時，可使一些DNA受損的細(xì)胞生存的時間延長，機(jī)體不能及時清除有害的變異細(xì)胞，為腫瘤細(xì)胞的形成創(chuàng)造了條件［3］.Bcl-2基因是目前公認(rèn)的抗凋亡基因，屬于原癌基因，定位于18q21，當(dāng)其與14q32免疫球蛋白的IgH位點(diǎn)發(fā)生換位后，Bcl-2蛋白表達(dá)增加［4-5］.從理論上說，Bcl-2可抑制細(xì)胞的凋亡，因此其表達(dá)越強(qiáng)，腫瘤的惡性程度越高，腫瘤生物學(xué)行為越差.但是，越來越多的臨床研究證實(shí)Bcl-2與乳腺癌一些好的預(yù)后相關(guān)［6］.本課題通過檢測乳腺癌組織中抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，分析其在乳腺癌診斷，治療及預(yù)后中的價值.

Melella等［7］通過研究發(fā)現(xiàn)雌激素可刺激MCF-7癌細(xì)胞株Bcl-2的表達(dá)，證實(shí)Bcl-2的表達(dá)是由雌激素調(diào)節(jié)的，該蛋白表達(dá)多局限于ER陽性乳腺癌細(xì)胞中.在乳腺癌組織存在ER／PR的表達(dá)往往提示著腫瘤細(xì)胞的分化程度高，惡性程度低，對內(nèi)分泌治療敏感等［8］.在本研究中，Bcl-2的表達(dá)與ER、PR呈強(qiáng)烈正相關(guān)，在Luminal型乳腺癌中高表達(dá)，與國外研究結(jié)果一致.因此，對Bcl-2高表達(dá)患者提示對內(nèi)分泌治療敏感，預(yù)后較好.

Dawswon等［8］通過研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2在高分化乳腺癌組織中相對呈高表達(dá)，而組織學(xué)分級越高，組織分化越差，預(yù)后也越差.在本研究中，Bcl-2的表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期、脈管癌栓、組織學(xué)分級等預(yù)后較差的因素呈負(fù)相關(guān)，且在絕經(jīng)前女性往往呈低表達(dá)［1、9］.該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與目前國內(nèi)外研究結(jié)果大致相同，證實(shí)Bcl-2高表達(dá)的乳腺癌患者往往對內(nèi)分泌治療敏感，且腫瘤的惡性程度低，可能具有更好的預(yù)后.本實(shí)驗(yàn)通過對所有患者隨訪發(fā)現(xiàn)，Bcl-2低表達(dá)者較高表達(dá)者術(shù)后更易出現(xiàn)復(fù)發(fā)（P≤0.05），支持Bcl-2高預(yù)后更好的預(yù)后.Bcl-2高表達(dá)預(yù)后更好，其原因可能包括以下四個方面［9-11］：①Bcl-2基因不僅抑制了細(xì)胞的凋亡，同時也延長細(xì)胞周期，由此延緩了腫瘤細(xì)胞的增殖，防止在過于頻繁的細(xì)胞分裂增殖過程中細(xì)胞基因組發(fā)生多種改變，因此預(yù)后較好；②Bcl-2蛋白是由雌激素調(diào)節(jié)，因此Bcl-2蛋白常局限在ER陽性乳腺癌細(xì)胞中，而ER陽性乳腺腫瘤對內(nèi)分泌治療效果較好，預(yù)后較好；③Bcl-2低表達(dá)預(yù)后差，可能與某些基因在腫瘤進(jìn)展到一定程度替代了bcl-2的功能有關(guān)；④Bcl-2在低組織學(xué)分級乳腺癌組織中高表達(dá)，且與其他一些負(fù)性因子呈負(fù)相關(guān)，如P53，表皮生長因子受體，Ki-67，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等，因此Bcl-2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞惡性程度低.

綜上所述，Bcl-2通過抑制細(xì)胞凋亡，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān).在乳腺癌中，Bcl-2在Luminal型乳腺癌中高表達(dá)，與ER／PR呈正相關(guān)，其高表達(dá)預(yù)示著患者具有更好的預(yù)后；因此，臨床可通過聯(lián)合檢測Bcl-2在乳腺癌組織中的表達(dá)進(jìn)一步明確腫瘤的生物學(xué)特性及對術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估，指導(dǎo)臨床治療方案的選擇.

［1］DAWSON S J，MAKRETSOV N，BLOWS F M，et al.Bcl-2 in breast cancer：a favourable prognostic marker across molecular subtypes and independent of adjuvant therapy received［J］.British Joumal of Cancer，2010，103（9）：668-675.

［2］陳建生，孫治君，于 冰.凋亡相關(guān)基因bcl-2、bad在乳腺癌中的表達(dá)及意義［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，34（6）：702-704.

［3］郭國慶，沈偉哉.細(xì)胞凋亡調(diào)控的分子機(jī)制（綜述）［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，22（2）：20-23.

［4］OH S，XIAOFEIE，NID，et al.Downregulation of autophagy by Bcl-2 promotes MCF7 breast cancer cell growth independent of itsinhibition of apoptosis［J］.Cell Death Differ，2011，18（3）：452-464.

［5］FABIEN LLAMBI，DOUGLASR.Apoptosis and Oncogenesis：Give and Take in the Bcl-2 Family［J］.2011，2（1）：12-20.

［6］王黎明，徐世文，龔曉萌.CerbB-2、Bcl-2、Ki-67在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義研究［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2006，14（10）：1217-1219.

［7］MILELLA M，TRISCIUOGLIO D，BRUMO T，et al.Trastuzumab down regulates Bcl-2 expression and potentiates apoptosis induction by Bcl-2／Bax-XL bispecific antisense oligonucleotides in HER-2 gene-amplified breast cells［J］.Clin Cancer Res，2004：10（22）：7747.

［8］ZHANG Y J，WANG JD，LIX R，et al.The significance of HER-2，Nm23，ER and PR expression in elder breast cancer［J］.Chinese Journal of Medicine，2008，43（5）：37-39.

［9］YU B，SUN X，SHEN H Y，et al.Expression of the apoptosis-relates genes BCL-2 and BAD in human breast carcinoma and their associated relationship with chemosensitivity［J］.Clinical Cancer Research，2010，29（11）：107-114.

［10］PAVIENKO IA，POVILATITE PE，GORELIK M Z，et al.Bcl-2 as a prognostic factor in differentmolecular genetic subtypes of breast cancer［J］.Arkih Patol，2012，74（5）：36-40.

［11］GRACE M.CALLAGY，PAUL D.Pharoah，Sarah E.Pinder，et al.Bcl-2 Is a Prognostic Marker in Breast Cancer Independently of the Nottingham Prognostic Index［J］.Clinical Cancer Reach，2012，14（9）：465-470.

［責(zé)任編輯：陳詠梅］

Expressions and significance of Bcl-2 protein in breast cancer tissue

HUANG Xin， ZHANG Qing， LV Rongzao， HEIWeili， HONG Jiafan， TANG Feng，WANG Ningxia
（Department of Breast Surgery，the First Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Aim：To investigate the expressions and significance of Bcl-2 in breast carcinoma.M ethods：The expression level of Bcl-2 protein and in breast cancer tissues from 124 patients was detected with themethod of immunohistochemistry and the relationship between Bcl-2 and other clinicopathologic factorswere analyzed，also the prognosis value of Bcl-2 was analyzed.Results：The expression of Bcl-2 in breast cancer was positive associated with ER and PR expression，but negative associated with tumor size、clinical stage、lymphovascular and histological grade；In Premenopausal women，Bcl-2 also shows low expression，but shows high expression in Luminal subtypes breast cancer；In all breast cancer，Bcl-2 positive expression have longer disease-free survival compare with Bcl-2 negative expression.Conclusion：When Bcl-2 shows positive expressed of breast cancer patients have a better prognosis.So detection of Bcl-2 can be used to predict the prognosis of patients and guide individualized treatment.

breast cancer； Bcl-2； prognosis

R736

A

1000-9965（2015）05-0421-04

10.11778／j.jdxb.2015.05.012

2015-03-29

國家亞太乳腺行動II基金項(xiàng)目（DOCET_R_04470）

黃 信（1986-）男，醫(yī)師，研究方向：乳腺癌的綜合治療

王寧霞，女，主任醫(yī)師，副教授，Tel：020-38688589.E-mail：1072083306＠qq.com