玉屏風(fēng)散對(duì)魚(yú)類(lèi)非特異性免疫和免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

張倩倩劉天強(qiáng)李彤彤徐 靜龍 夢(mèng)王謝昊龔小寧李?lèi)?ài)華

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 通威股份有限公司, 成都 610041)

玉屏風(fēng)散對(duì)魚(yú)類(lèi)非特異性免疫和免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

張倩倩1, 2劉天強(qiáng)3李彤彤1, 2徐 靜3龍 夢(mèng)1, 2王謝昊1, 2龔小寧1李?lèi)?ài)華1

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 通威股份有限公司, 成都 610041)

為探究傳統(tǒng)中藥玉屏風(fēng)散在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的生物學(xué)功效, 在基礎(chǔ)飼料中分別添加2.5%、5%和10%的玉屏風(fēng)散和1%的芪參散配成實(shí)驗(yàn)飼料, 飼喂實(shí)驗(yàn)魚(yú)2周, 然后分別觀察兩種中藥對(duì)羅非魚(yú)(體重約220 g)的生長(zhǎng)、非特異性免疫及免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響以及對(duì)草魚(yú)(體重約20 g)免疫保護(hù)率的影響。結(jié)果顯示: 各中藥組均提高了羅非魚(yú)增重率, 10%玉屏風(fēng)散組效果最顯著; 各實(shí)驗(yàn)組中羅非魚(yú)肝、腎、脾體指數(shù)和各血液學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組無(wú)顯著差異; 各中藥組羅非魚(yú)谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量均不高于空白對(duì)照組; 2.5%、10%玉屏風(fēng)散組和1%芪參散組堿性磷酸酶(AKP)含量均高于對(duì)照組(P＞0.05); 各藥物組羅非魚(yú)溶菌酶活性均高于對(duì)照組, 且2.5%玉屏風(fēng)散組與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05); 玉屏風(fēng)散各劑量組羅非魚(yú)呼吸暴發(fā)活性均高于對(duì)照組(P＞0.05); 羅非魚(yú)肝臟中熱休克蛋白70 (HSP70)在各實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)量均上調(diào), 腎臟中HSP70在2.5%和 5%玉屏風(fēng)散組表達(dá)量上調(diào), 脾臟中 HSP70在各實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)量均下調(diào); 肝臟中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體TGFRⅢ在 2.5%玉屏風(fēng)散組表達(dá)量上調(diào), 腎臟中 TGFRⅢ在 2.5%玉屏風(fēng)散組和 1%芪參散組表達(dá)量上調(diào), 脾臟中 TGFRⅢ在各實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)量均上調(diào); 玉屏風(fēng)散各劑量組能夠提高草魚(yú)對(duì)嗜水氣單胞菌的抵抗能力, 表現(xiàn)為死亡率降低和進(jìn)入血液的細(xì)菌減少, 其中 5%玉屏風(fēng)散組效果最佳。實(shí)驗(yàn)表明, 玉屏風(fēng)散能夠有效促進(jìn)羅非魚(yú)生長(zhǎng), 對(duì)其非特異性免疫指標(biāo)以及免疫相關(guān)基因表達(dá)均有不同程度的促進(jìn)作用, 并能夠有效地提高草魚(yú)的免疫保護(hù)率。

羅非魚(yú); 草魚(yú); 玉屏風(fēng)散; 芪參散; 生理生化指標(biāo); 非特異性免疫; 免疫基因; 免疫保護(hù)率

隨著我國(guó)魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的不斷擴(kuò)大, 高密度、集約化的養(yǎng)殖模式導(dǎo)致病害的頻繁發(fā)生與流行, 近年來(lái)病毒性疾病、細(xì)菌性疾病、寄生蟲(chóng)病造成魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失。傳統(tǒng)的化學(xué)藥物和抗生素在治療魚(yú)病過(guò)程中會(huì)造成環(huán)境污染、病原生物耐藥性增強(qiáng)和組織藥物殘留等問(wèn)題, 嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康和安全。中藥添加劑具有成本低、副作用小、使用安全、應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn), 可以直接添加到飼料中, 不僅可以抑殺病原微生物, 還可以增強(qiáng)魚(yú)體免疫系統(tǒng),提高魚(yú)體的抗應(yīng)激能力和防御機(jī)能, 從而達(dá)到預(yù)防疾病的目的。近年來(lái)中藥添加劑廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖, 符合健康無(wú)公害水產(chǎn)品生產(chǎn)的要求, 在魚(yú)病防治上具有廣闊的應(yīng)用前景。

中藥復(fù)方玉屏風(fēng)散由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)組成[1],有補(bǔ)脾實(shí)衛(wèi)、益氣、固表、止汗的功效[2], 在我國(guó)已有近 700年的歷史。關(guān)于玉屏風(fēng)散在小鼠(Mus musculus)[3]、雛雞(Gus gallus)[4]、人類(lèi)(Homo sapiens)鼻炎[5]上的應(yīng)用已有報(bào)道, 但在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中應(yīng)用的報(bào)道卻不多。為此, 本研究預(yù)以玉屏風(fēng)散為中藥飼料添加劑, 研究投喂含不同劑量中藥的飼料對(duì)羅非魚(yú)非特異性免疫指標(biāo)及免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響, 為玉屏風(fēng)散在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。芪參散主要成分是黃芪、人參、甘草, 具有扶正固本的功效, 用于增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的免疫功能, 提高抗應(yīng)激能力。芪參散是首批轉(zhuǎn)正的國(guó)標(biāo)漁藥。在此實(shí)驗(yàn)中, 用芪參散為陽(yáng)性對(duì)照, 以此來(lái)探究傳統(tǒng)方劑玉屏風(fēng)散的生物學(xué)功效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)魚(yú)及飼養(yǎng)條件 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)來(lái)自湖北省武漢市江夏湯遜湖某養(yǎng)殖場(chǎng), 體質(zhì)健壯, 無(wú)病無(wú)傷,選取規(guī)格相近的魚(yú)體為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 羅非魚(yú)平均體重為(220±20) g, 草魚(yú)平均體重為(18±2) g。養(yǎng)殖水缸體積約為 200 L, 以充分曝氣除氯的自來(lái)水作為循環(huán)水源, 全天24h充氧。實(shí)驗(yàn)魚(yú)暫養(yǎng)2周適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每天投喂2次(09:00和17:00), 日總投喂量為魚(yú)體重的2%, 每天吸污換水1次, 實(shí)驗(yàn)期間水溫維持在28℃左右。

實(shí)驗(yàn)藥物 玉屏風(fēng)散的配方為: 防風(fēng) 1份,黃芪2份(蜜炙), 白術(shù)2份, 粉碎至60目, 由四川通威股份有限公司提供。

實(shí)驗(yàn)飼料 實(shí)驗(yàn)組中向基礎(chǔ)飼料中分別添加2.5%、5%和 10%的玉屏風(fēng)散以及 1%的芪參散, 對(duì)照組為基礎(chǔ)飼料, 用小型顆粒機(jī)制成顆粒狀飼料, 在55℃烘箱中烘干后于4℃密封保存?；A(chǔ)飼料購(gòu)自武漢九州神農(nóng)藥業(yè)有限公司, 配方及各成分含量為粗蛋白質(zhì) 30%、粗纖維 12%、粗灰分 15%、鈣0.40%—2.50%、總磷 0.7%、食鹽 0.30%—1.20%、水分12.5%、總賴(lài)氨酸1.2%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)分4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組,每組12尾, 實(shí)驗(yàn)組分別投喂含2.5%、5%和10%的玉屏風(fēng)散以及 1%的芪參散, 折合成每千克體重日投喂0.5、1.0、2.0 g和0.2 g相應(yīng)的藥物, 分別設(shè)為A1、A2、A3和 A4組; 對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料設(shè)為 A0組。飼養(yǎng)15d后進(jìn)行羅非魚(yú)相關(guān)免疫指標(biāo)的測(cè)定。

樣品的采集 每組隨機(jī)取5尾魚(yú), 80 mg/L的MS 222麻醉后, 尾靜脈采血, 將每尾魚(yú)所采的血液分2份, 其中一份于采血管中4℃保存; 另一份分裝于 2 mL無(wú)菌 Ep管中, 室溫放置 1h后, 4 , ℃3500 r/min離心20min, 取血清。采血管及部分血清送往湖北省武漢大學(xué)中南醫(yī)院測(cè)定血液學(xué)及血清學(xué)生化指標(biāo)。分離頭腎、肝臟、脾臟, 稱(chēng)重, 計(jì)算臟器指數(shù)。另取 5尾魚(yú)取其腎臟、肝臟、脾臟于 Trizol 中, –80℃保存; 取頭腎, 分離頭腎細(xì)胞。

臟器指數(shù)[6]將分離的頭腎、肝臟、脾臟分別稱(chēng)重, 計(jì)算臟器指數(shù)。頭腎體指數(shù)(%)=MHK/MT× 100%; 肝臟體指數(shù)(%)=ML/MT×100%; 脾體指數(shù)(%)=MS/MT×100%, 式中: MT為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚(yú)體重(g); MHK為頭腎重量(g); ML為肝臟重量(g); MS為脾臟重量(g)。

血液學(xué)指標(biāo) 取全血樣品和血清樣品送湖北省武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢測(cè), 全血樣品用美國(guó)雅培Ruby全自動(dòng)血球分析儀進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞壓積、血紅蛋白含量及淋巴細(xì)胞百分比,血清樣品用美國(guó)貝克曼AU5400全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總蛋白、白蛋白、血糖、尿素氮、堿性磷酸酶、總膽固醇、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶活性。

血清溶菌酶活性[7]用磷酸鈉緩沖液(0.05 mol/L pH 6.2)將溶壁微球菌(Sigma)配成0.3 mg/mL的菌液, 分別向96孔板中加入10 μL的測(cè)試血清后, 加入 250 μL菌液, 快速混勻后, 25℃下490 nm波長(zhǎng)測(cè)定0.5min和4.5min后的吸光值,以一分鐘內(nèi)吸光值下降0.001為一個(gè)活性單位U。

呼吸暴發(fā)[8]分離頭腎組織, 用L-15培養(yǎng)液(含2%胎牛血清, 10 μ/mL肝素(sigma)和100 μg/mL青鏈霉素)清洗組織兩次后, 過(guò)0.2 μm濾篩。細(xì)胞懸液平鋪到事先準(zhǔn)備好的 34%/51% Percoll梯度分離液上, 4 , 400℃ ×g, 離心40min。收集34%和51%分離液之間的細(xì)胞, 用L-15培養(yǎng)液4 , 400℃ ×g, 離心10min清洗兩遍, 用L-15培養(yǎng)液(含0.1%胎牛血清, 100 μg/mL青鏈霉素)調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106cells/mL, 28℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

細(xì)胞懸液 28℃培養(yǎng) 2h后, 移除培養(yǎng)液, 用HBSS清洗掉未貼壁細(xì)胞, 每孔加入 100 μL 含Zymson A(1 mg/mL)和NBT(1 mg/mL)的HBSS, 28℃培養(yǎng)1h后移除液體, 用甲醇固定10min后, 分別用100%、70%、70%的甲醇清洗各孔, 室溫風(fēng)干, 每孔加120 μL KOH和140 μL DMSO, 充分混勻后于630 nm處測(cè)吸光值。

免疫相關(guān)基因表達(dá)[9]將儲(chǔ)存在–80℃的組織取出解凍后, 于研缽中用液氮研磨, 用 Trizol (Invitrogen)試劑提取頭腎、肝臟、脾臟組織中的總RNA, 用超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行 RNA純度測(cè)定, 并用無(wú)RNase活性的DNase去除基因組DNA。逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara)將 RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA, 合成反應(yīng)終體積為20 μL, 于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用 Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行 Real-time PCR中的引物(表1)設(shè)計(jì), 引物設(shè)計(jì)所依據(jù)的基因模板序列均來(lái)自于NCBI DNA數(shù)據(jù)庫(kù), 各基因NCBI登錄號(hào)分別為 β-actin (KJ 126772)、Hsp70 (XM 005466767)、TGFRⅢ (XM 005451165)。Real-time PCR反應(yīng)采用熒光染料SYBR Green, 在Bio-Rad熒光定量PCR儀上進(jìn)行, 以β-actin為內(nèi)參基因。在總體積為25 μL的反應(yīng)液體中, 含有2 μL cDNA模板, 1 μL正反向引物(引物濃度為 10 μm/L), 12.5 μL SYBR Mix以及8.5 μLddH2O。反應(yīng)條件如下: 95℃變性30s; 95 ℃ 5s, 60 ℃ 30s, 40個(gè)循環(huán)。最終免疫基因的表達(dá)量用 2–ΔΔCt的方法進(jìn)行分析, 其中ΔΔCt= (Ct,目標(biāo)基因–Ct, β-actin)實(shí)驗(yàn)組–(Ct,目標(biāo)基因–Ct, β-actin)對(duì)照組。

1.3 攻毒實(shí)驗(yàn)

為探究投喂玉屏風(fēng)散對(duì)魚(yú)體細(xì)菌感染的保護(hù)效果, 用草魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 用分別含 2.5%、5%和10%和 0%玉屏風(fēng)散(A1、A2、A3、A0)的餌料投喂兩周, 在結(jié)束投喂的第 2天進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。同時(shí)另設(shè)一組, 一直投喂飼喂空白飼料, 但在攻毒前1天飼喂一次含 10%玉屏風(fēng)散的餌料(記為B組)。將嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila DLNG101)接種于BHI固體培養(yǎng)基, 28℃培養(yǎng)16—18h, 用PBS緩沖液洗下菌苔, 離心去上清后用 PBS重懸浮, 調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度為2×107cfu/mL。每尾魚(yú)腹腔注射0.2 mL菌液, 每組20尾, 水溫為23℃。注射后觀察并記錄各組死亡時(shí)間、數(shù)量。統(tǒng)計(jì)96h內(nèi)各組的“尾×?xí)r”數(shù)(魚(yú)的尾數(shù)乘以存活的小時(shí)數(shù)), 并統(tǒng)計(jì)感染 7d內(nèi)各組累積死亡率, 計(jì)算RPS, 并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析。另外, 對(duì)即將死亡的草魚(yú)(記入死亡數(shù))采集尾靜脈血, 分離細(xì)菌。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)用SPSS 19統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA), 用Duncan’s多重比較分析組間差異, 差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 玉屏風(fēng)散對(duì)羅非魚(yú)臟器指數(shù)的影響

由表2可知, 對(duì)照組羅非魚(yú)增重率為0.39%, 實(shí)驗(yàn)組魚(yú)體增重率明顯高于對(duì)照組。頭腎體指數(shù)除A3組外均低于對(duì)照組, 但差異不顯著(P＞0.05); 肝體指數(shù)A1組、A4組與A2組差異顯著(P＜0.05), 其他各組差異不顯著(P＞0.05); 脾體指數(shù)A4組明顯高于其他各組, 且差異顯著(P＜0.05)。

表1 Real time PCR引物Tab. 1 Primers used in real time PCR

表2 玉屏風(fēng)散對(duì)羅非魚(yú)臟器指數(shù)的影響Tab. 2 The effects of Jade screen powder on the viscera index of Tilapia

2.2 玉屏風(fēng)散對(duì)羅非魚(yú)血液學(xué)指標(biāo)的影響

由表3可知, 羅非魚(yú)全血中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積和淋巴細(xì)胞百分比實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均差異不顯著(P＞0.05)。在羅非魚(yú)血清各指標(biāo)影響中, 各組實(shí)驗(yàn)組中總蛋白和血糖含量差異不顯著(P＞0.05), A1、A4組丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶含量明顯低于A2、A3和A0組, 且差異顯著(P＜0.05), A4、A0組白蛋白含量差異顯著(P＜0.05), 而 A1、A2、A3組差異不顯著(P＞0.05), A1組堿性磷酸酶水平與A2差異顯著(P＜0.05), 與其他各組差異不顯著(P＞0.05), 而A2組與A1、A3、A4差異顯著(P＜0.05), 與A0差異不顯著(P＞0.05), A2、A4組血清總膽固醇含量差異顯著(P＜0.05), 其他各組不顯著(P＞0.05)。

2.3 玉屏風(fēng)散對(duì)羅非魚(yú)血清溶菌酶活性的影響結(jié)果顯示(圖1): 實(shí)驗(yàn)組血清溶菌酶活性均高于對(duì)照組, 其中 A1組溶菌酶活性與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05), 其溶菌酶活力高低次序?yàn)锳1組、A4組、A3組、A2組、A0組。

表3 玉屏風(fēng)散對(duì)羅非魚(yú)血液學(xué)指標(biāo)的影響Tab. 3 The effects of Jade screen powder on hematological indexes of Tilapia

圖1 玉屏風(fēng)散對(duì)羅非魚(yú)血清溶菌酶活性的影響Fig. 1 The effects of Jade screen powder on the activity of lysozyme in Tilapia

2.4 玉屏風(fēng)散對(duì)羅非魚(yú)淋巴細(xì)胞呼吸暴發(fā)的影響

結(jié)果顯示(圖2): A1組、A2組、A3組呼吸暴發(fā)強(qiáng)度均高于A0組, 但差異不顯著(P＞0.05); A4組呼吸暴發(fā)強(qiáng)度低于對(duì)照組, 但差異也不顯著(P＞0.05)。

圖2 玉屏風(fēng)散對(duì)羅非魚(yú)淋巴細(xì)胞呼吸暴發(fā)的影響Fig. 2 The effects of Jade screen powder on the respiratory burst activity in Tilapia

2.5 玉屏風(fēng)散對(duì)羅非魚(yú)免疫基因(Hsp 70和TGFRⅢ)表達(dá)量的影響

結(jié)果顯示(圖3): 肝臟中各組Hsp70表達(dá)均上調(diào), 且A1、A2與A3組差異顯著(P＜0.05), A3組達(dá)到最高, 是對(duì)照組的17.52倍, 腎臟中A1和A2組Hsp70表達(dá)上調(diào), A3和 A4組下調(diào)但差異不顯著(P＞0.05),脾臟中各組Hsp 70表達(dá)量均下調(diào); 肝臟中A1、A2組與A3、A4組差異顯著(P＜0.05), 且A1組TGFRⅢ表達(dá)量上調(diào), 為對(duì)照組的1.42倍, 腎臟中除A3組下調(diào), 其他各組表達(dá)均上調(diào), 但各組間差異不顯著(P＞0.05), 脾臟中各組 TGFRⅢ表達(dá)量均上調(diào), 但差異不顯著(P＞0.05)。

2.6 玉屏風(fēng)散對(duì)草魚(yú)免疫保護(hù)率的影響

圖3 玉屏風(fēng)散對(duì)羅非魚(yú)肝臟、腎臟、脾臟中Hsp70和TGFRⅢ基因表達(dá)的影響Fig. 3 The effects of Jade screen powder on the expression of Hsp 70 and TGFRⅢ relative to β-actin in the liver, the kidney, and the spleen of tilapia

表4 攻毒后魚(yú)體的死亡時(shí)間與死亡數(shù)量Tab. 4 The number and time of death after infection

實(shí)驗(yàn)魚(yú)在注射嗜水氣單胞菌后, 不同時(shí)間的死亡情況見(jiàn)表4。在注射攻毒28h后, A0組有5尾死亡, A1組1尾、A2組0尾、A3組3尾、B組2尾死亡; 90h后, A0組有11尾死亡, A1組4尾、A2組0尾、A3組6尾、B組6尾死亡, 計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)魚(yú)在注射攻毒后所有魚(yú)的累計(jì)存活時(shí)間, 則 A1組為181、A2組為0、A3組為210、A0組為507、B組為 337; 玉屏風(fēng)散各濃度組的保護(hù)率分別為 A1組63%、A2組為100%、A3組為45%、B組為45%。從 2.5%玉屏風(fēng)散組和對(duì)照組即將死亡的草魚(yú)尾靜脈血中分離出細(xì)菌且對(duì)照組菌落數(shù)明顯多于 2.5%玉屏風(fēng)散組, 其他各組血液中未分離出細(xì)菌。這也說(shuō)明了兩種中藥都有促進(jìn)機(jī)體殺滅細(xì)菌的作用。

3 討論

本研究選用經(jīng)典方劑玉屏風(fēng)散和芪參散作為實(shí)驗(yàn)魚(yú)飼料添加劑, 通過(guò)對(duì)組織相關(guān)物質(zhì)含量、酶活性、呼吸暴發(fā)等指標(biāo)及HSP70和TGFRⅢ基因的表達(dá)量分析, 研究中藥添加劑對(duì)羅非魚(yú)生理生化指標(biāo)、非特異性免疫及免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響, 通過(guò)攻毒實(shí)驗(yàn)研究中藥添加劑對(duì)草魚(yú)免疫保護(hù)率的影響, 以期較全面的分析中藥添加劑對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)及免疫方面的作用和效果。

3.1 玉屏風(fēng)散對(duì)羅非魚(yú)生長(zhǎng)指數(shù)的影響

近年來(lái), 中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。研究表明, 中草藥對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能有明顯促進(jìn)作用。如劉愛(ài)君等[10]在奧尼羅非魚(yú)飼料中添加 0.50%甘露寡糖使稚魚(yú)、魚(yú)種的增重率分別提高 13.7%和 18.4%; 劉興國(guó)等[11]在羅非魚(yú)的飼料中分別添加 0.25%、0.50%、1.00%和 2.00%的殼聚糖, 發(fā)現(xiàn)殼聚糖顯著降低了羅非魚(yú)的飼料系數(shù), 添加量以 0.50%最為適宜。本實(shí)驗(yàn)用含不同劑量玉屏風(fēng)散和芪參散的飼料飼喂羅非魚(yú) 2周后, 實(shí)驗(yàn)組魚(yú)體體重增加率明顯高于對(duì)照組, 且魚(yú)體體重增加率隨著玉屏風(fēng)散劑量的增加而增加, 10%玉屏風(fēng)散組促進(jìn)效果最佳, 說(shuō)明玉屏風(fēng)散和芪參散均對(duì)羅非魚(yú)的生長(zhǎng)具有良好的促進(jìn)作用, 而最適的添加劑劑量還需要進(jìn)一步探討; 各組的頭腎、肝臟、脾臟指數(shù)差異不明顯。

3.2 玉屏風(fēng)散對(duì)羅非魚(yú)血液生理生化指標(biāo)的影響

血細(xì)胞在魚(yú)類(lèi)疾病防御過(guò)程中發(fā)揮重要作用,是免疫能力和疾病診斷[12]的指標(biāo)之一。血紅蛋白是魚(yú)類(lèi)非特異性免疫的一項(xiàng)指標(biāo), 可以在一定程度上反映魚(yú)類(lèi)健康狀況, 高含量的血紅蛋白是魚(yú)體健康的表征[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 中藥組血紅蛋白含量雖與對(duì)照組雖無(wú)顯著差異, 但均高于對(duì)照組, 說(shuō)明玉屏風(fēng)散和芪參散均可在一定程度上促進(jìn)羅非魚(yú)的健康。血清中的AST、ALT作為反映魚(yú)類(lèi)肝功能的重要指標(biāo)[14], 同時(shí)也可以反映體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝情況[15, 16]。ALT和AST在轉(zhuǎn)氨酶中作用最強(qiáng), 在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝中起著重要作用。5%、10%玉屏風(fēng)散組和對(duì)照組AST、ALT含量無(wú)顯著差異, 2.5%玉屏風(fēng)散組和芪參散組還甚至低于對(duì)照組。魚(yú)體新陳代謝部分是由物質(zhì)的磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)的, AKP是魚(yú)體生長(zhǎng)代謝、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)所必需的酶。除5%玉屏風(fēng)散組外, 其他各實(shí)驗(yàn)組雖與對(duì)照組差異不顯著, 但 AKP含量均高于對(duì)照組, 說(shuō)明 2.5%、10%玉屏風(fēng)散和芪參散均可提高羅非魚(yú)體內(nèi)AKP活性。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積和淋巴細(xì)胞百分比均差異不顯著, 且均在健康范圍之內(nèi)[17]。

3.3 玉屏風(fēng)散對(duì)羅非魚(yú)血清溶菌酶的影響

作為魚(yú)類(lèi)免疫的第一道防線, 血清溶菌酶阻止細(xì)菌的附著和定植, 是魚(yú)類(lèi)重要的防御因子。溶菌酶是一種裂解酶, 可以水解細(xì)菌細(xì)胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的B-1,4糖苷鍵, 導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂, 主要作用于革蘭氏陽(yáng)性菌[18]。吳英瑞等[19]發(fā)現(xiàn)用含 0.1%苦參的飼料飼喂羅非魚(yú) 20d后,能顯著提高血清溶菌酶活性; László Ardó等[20]發(fā)現(xiàn)黃芪和金銀花可以顯著提高羅非魚(yú)血清溶菌酶活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 實(shí)驗(yàn)組血清溶菌酶活性均高于對(duì)照組, 且 2.5%玉屏風(fēng)散組與對(duì)照組差異顯著,說(shuō)明玉屏風(fēng)散和芪參散均可以促進(jìn)羅非魚(yú)血清溶菌酶活性, 且玉屏風(fēng)散添加量在2.5%時(shí)促進(jìn)作用最明顯。

3.4 玉屏風(fēng)散對(duì)羅非魚(yú)細(xì)胞呼吸暴發(fā)活性的影響

在吞噬細(xì)胞吞噬入侵異源物質(zhì)的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的呼吸暴發(fā), 魚(yú)類(lèi)吞噬細(xì)胞在呼吸暴發(fā)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生氧自由基, 產(chǎn)生的 O2–對(duì)魚(yú)類(lèi)病原微生物毒性不大, 但其所產(chǎn)生的H2O2有很強(qiáng)的毒性[21]。超氧化物陰離子是呼吸暴發(fā)過(guò)程中的第一產(chǎn)物, 因此產(chǎn)生的氧負(fù)離子的量成為精確測(cè)定呼吸暴發(fā)的指標(biāo)。Vera-Jimenez NI等[22]發(fā)現(xiàn)β-谷氨酸可以促進(jìn)草魚(yú)頭腎細(xì)胞的呼吸暴發(fā)活性; Yin等[23]發(fā)現(xiàn), 用含 0.5%靈芝多糖飼喂鯉(Cyprinidae)1周后能顯著提高鯉頭腎巨噬細(xì)胞的呼吸暴發(fā)活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 除芪參散組外, 玉屏風(fēng)散各實(shí)驗(yàn)組呼吸暴發(fā)強(qiáng)度均高于對(duì)照組, 說(shuō)明玉屏風(fēng)散可有效促進(jìn)羅非魚(yú)淋巴細(xì)胞的呼吸暴發(fā)強(qiáng)度, 提高魚(yú)類(lèi)免疫力, 其中以5%添加量效果最佳。

3.5 玉屏風(fēng)散對(duì)羅非魚(yú)免疫相關(guān)基因HSP70和TGF-β表達(dá)量的影響

HSP70是一種保守蛋白, 在正常情況下, HSP70在細(xì)胞內(nèi)呈基礎(chǔ)表達(dá), 表達(dá)水平較低, 而在各種應(yīng)激因素如溫度陡變、病原菌感染或組織損傷時(shí), 其表達(dá)量明顯上升[24]。HSP70在先天性免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用, 有研究指出中藥可以提高團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)[25]和白對(duì)蝦(Penaeus orientalis)[26]的 HSP70的表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各實(shí)驗(yàn)組均能提高肝臟中HSP70的表達(dá)量, 尤其是10%玉屏風(fēng)散組和芪參散組, 提高倍數(shù)分別為17.52 和9.18; 在腎臟中, 2.5%、5%玉屏風(fēng)散組HSP70表達(dá)量上調(diào), 10%玉屏風(fēng)散組和芪參散組表達(dá)量下調(diào);在脾臟中各組基因表達(dá)量均明顯下調(diào)。

TGF-β是一種多功能的細(xì)胞因子, 在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、組織修復(fù)和凋亡中起到重要作用[27]。TβR是一種細(xì)胞膜表面受體, TGF-β要發(fā)揮生物學(xué)作用必須與其受體結(jié)合, TGF-βR的改變是TGF-β發(fā)生功能變化的關(guān)鍵。最新發(fā)現(xiàn)TβR存在TβRⅠ、TβRⅡ、TβRⅢ三種形式, TβRⅢ是一種蛋白聚糖, 起到信號(hào)放大的作用[28], 是TGF-β發(fā)揮生物學(xué)作用所不可或缺的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 肝臟中 TGFRⅢ的表達(dá)量除2.5%玉屏風(fēng)散組小幅度上調(diào)外, 其他各實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量均下調(diào), 腎臟中除 10%玉屏風(fēng)散組小幅下調(diào)外,其他各實(shí)驗(yàn)組均上調(diào), 脾臟中各實(shí)驗(yàn)組 TGFRⅢ表達(dá)量均小幅上調(diào)。

3.6 玉屏風(fēng)散對(duì)草魚(yú)免疫保護(hù)率的影響

攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 用含不同劑量玉屏風(fēng)散和芪參散的飼料飼喂草魚(yú)兩周后, 實(shí)驗(yàn)組魚(yú)體死亡率明顯低于對(duì)照組, 飼喂兩周含玉屏風(fēng)散飼料后的草魚(yú)對(duì)嗜水氣單胞菌的抵抗能力顯著增強(qiáng), 其中 5%玉屏風(fēng)散組效果最佳, 飼喂 10%玉屏風(fēng)散一次組嗜水氣單胞菌感染率低于對(duì)照組, 說(shuō)明短時(shí)服用玉屏風(fēng)散對(duì)魚(yú)體抵抗細(xì)菌感染也有一定的促進(jìn)作用; 從保護(hù)率結(jié)果看, 5%玉屏風(fēng)散組保護(hù)率最高為 100%, 2.5%玉屏分散組次之為 63%, 10%玉屏風(fēng)散組為45%, 說(shuō)明保護(hù)率與玉屏風(fēng)散濃度并非呈正相關(guān),濃度過(guò)高可能對(duì)魚(yú)體的肝臟有一定的損傷; 僅從2.5%玉屏風(fēng)散組和對(duì)照組尾靜脈血液中分離出細(xì)菌且對(duì)照組細(xì)菌數(shù)明顯高于2.5%玉屏風(fēng)散組, 說(shuō)明高劑量的玉屏風(fēng)散可以有效提高草魚(yú)的抵抗力, 防止細(xì)菌對(duì)魚(yú)體的感染。

綜上所述, 玉屏風(fēng)散不同劑量實(shí)驗(yàn)組對(duì)羅非魚(yú)體重增加率、生理生化指標(biāo)、非特異性免疫及免疫相關(guān)基因的表達(dá)均有不同程度的增強(qiáng)和調(diào)節(jié)作用,也能有效地提高草魚(yú)免疫保護(hù)率, 說(shuō)明玉屏風(fēng)散作為飼料添加劑用于促進(jìn)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)、提高其免疫力方面具有一定應(yīng)用價(jià)值。但這些作用與添加劑量密切相關(guān), 而且各指標(biāo)之間不存在一致性, 也就是說(shuō)不存在一個(gè)可以使各種指標(biāo)都呈現(xiàn)最理想變化的劑量。

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THE EFFECTS OF JADE SCREEN POWER ON THE NON-SPECIFIC IMMUNE RESPONSE AND THE EXPRESSION OF THE RELATED GENES IN FISH

ZHANG Qian-Qian1, 2, Liu Tian-Qiang3, Li Tong-Tong1,2, Xu Jing3, Long Meng1, 2,
Wang Xie-Hao1,2, Gong Xiao-Ning1and Li Ai-Hua1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China; 3.Tongwei Limited Company, Chengdu 610041, China)

In this study, we investigated the effects of Jade screen powder on the non-specific immune response and the expression of the related genes in tilapia (Oreochromis niloticus) as well as the effects on the resistance to the infection in grass carps. In order to explore the bio-activity of traditional Chinese herb Jade screen powder on aquaculture, the fish was fed with the four groups of diets supplemented with Chinese herbs (2.5%, 5%, 10% Jade screen powder and 1% Qishen powder) for 2 weeks. For tilapia, all four Chinese herb groups exhibited increase in the rate of the body weight gain, and 10% Jade screen powder had the most significant effect. There was no difference in the index of liver, kidney, spleen and in the haematological parameters between the treated groups and the control. Compared to the control group, the levels of AST and ALT were lower in the treated groups, but the level of AKP in the 2.5% and 10% Jade screen powder groups and 1% Qishen powder group was higher. There was an insignificant increase in the activity of the serum lysozyme in tilapia treated with jade screen powder at all three concentrations. Moreover, the activity of plasma lysozyme increased significantly in the group fed with 2.5% Jade screen powder compared to the control (P＜0.05). The herbal treatment also insignificantly elevated the production of ROS (reactive oxygen species) (P＞0.05). The expression of HSP70 was affected by the herbal treatments in a tissue-specific pattern: it was up-regulated in the liver, and in the kidney 2.5% and 5% Jade screen powder boosted the expression, however the expression was down-regulated in the spleen. The expression of TGFRⅢ was also differently regulated by the herbs in various organs: 2.5% Jade screen powder up-regulated the expression in the liver and the kidney, and 1% Qishen powder also had a stimulating effect in the kidney, and the expression could be enhanced by all treatments in spleen. Jade screen powder improved the resistance to the infection of Aeromonas hydrophila in grass carps, which was represented by the lower mortality rate and less bacteria in the blood, and 5% Jade screen powder was especially effective. These results suggested that Jade screen powder may improve the growth, the non-specific immune response and the expression of related genes in tilapia.

Tilapia; Grass Carp; Jade Screen Power; Qishen powder; Physiology and biochemical index; Non-specific immune response; Gene expression; Disease resistance

S965.1

A

1000-3207(2015)06-1076-09

10.7541/2015.142

2014-11-26;

2015-03-12

國(guó)家開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室(FEBL)課題(2011FBZ26); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (No. 31070112)資助

張倩倩(1989—), 女, 山東青島人; 碩士; 主要研究方向?yàn)橹兴庺~(yú)類(lèi)免疫。E-mail: zhangqiantianyu623@163.com

李?lèi)?ài)華, E-mail: liaihua@inb.ac.cn