扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲丙氨酸轉氨酶基因的分子克隆與序列分析

劉書興 洪雅真 林曉鳳 李繼秋

(華南師范大學生命科學學院, 廣東省高等學校生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室, 原生動物實驗室, 廣州 510631)

研究簡報

扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲丙氨酸轉氨酶基因的分子克隆與序列分析

劉書興 洪雅真 林曉鳳 李繼秋

(華南師范大學生命科學學院, 廣東省高等學校生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室, 原生動物實驗室, 廣州 510631)

原生動物是低等的真核生物, 具有個體微小, 結構簡單, 繁殖迅速等生物學特征, 是一類復雜的、生理學功能高度集中的單細胞動物[1]。原生動物在地球上分布極廣,是微食物網(wǎng)的重要組成部分, 在自然界物質循環(huán)和能量流動中具有樞紐作用, 因此具有重要的生態(tài)學功能和地位[2]。再者, 許多種類對棲息地環(huán)境變化十分敏感, 常作為環(huán)境指示生物用于水環(huán)境監(jiān)測中[3, 4]。因此開展原生動物的生態(tài)學及其相關學科研究具有重要意義。

代謝酶活性及其基因表達水平作為重要的生物標記物已被廣泛應用于環(huán)境監(jiān)測和風險評估中[5, 6]。丙氨酸轉氨酶(Alanine aminotransferase, EC 2.6.1.2)是一種以磷酸吡哆醛為輔酶的代謝酶, 其廣泛存在于有機體內, 通過催化丙氨酸和酮戊二酸與谷氨酸和丙酮酸之間的可逆反應把生物體內的糖代謝與氨基酸代謝相聯(lián)[7, 8], 因此丙氨酸轉氨酶在糖異生、氨基酸代謝等細胞進程中具有重要作用。丙氨酸轉氨酶活性常作為指示生物組織和細胞損傷程度的重要指標[9], 使其在生態(tài)毒理學中作為生物標志物具有巨大的應用前景。但是有關原生動物丙氨酸轉氨酶活性及其基因表達作為生物標記物的研究尚未見報道。

開展相關酶的分子克隆與序列分析則是研究其應用的前提和基礎。指示生物物種間生物標記物的物種間差異一直是生物監(jiān)測領域的研究熱點[10, 11]?；诖? 本研究擬對扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲ALT基因全長cDNA進行克隆、序列分析、系統(tǒng)進化等方面的研究, 旨在為扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲作為海洋水體的指示生物及其 ALT在生態(tài)毒理學研究提供前期的信息和資料。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用扇形游仆蟲(Euplotes vannus)和紅色偽角毛蟲(Pseudokeronopsis rubra)均采自大亞灣沿岸, 于華南師范大學原生動物學研究室種庫 16℃、用滅菌海水在培養(yǎng)皿(D=9 cm)中并加以大米粒富集細菌單克隆培養(yǎng)保種。

總RNA極速抽提試劑盒(RNAfast200)購自上海飛捷生物技術有限公司; RQ1 RNase-FreeDNase購自Promega公司; 瓊脂糖DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司, DH5α大腸桿菌(Escherichia coli)感受態(tài)購自廣州東勝生物科技有限公司, pMD18-T vector、Ex Taq DNA聚合酶、M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit、SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 RNA的提取與cDNA合成

采用孔徑為20 μm的篩絹初步富集處于對數(shù)生長期的扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲, 溶菌酶處理24h后, 滅菌海水沖洗, 離心(3000 r/m, 3min)富集得到的蟲體(細胞數(shù)＞2×105)用于提取總RNA。按照試劑盒說明書(RNAfast200)依次進行裂解、去除雜質和洗脫獲得總RNA。經(jīng)DNase消化, M-MLV RTase反轉錄合成的cDNA為供試材料。5′和3′RACE-Ready cDNA分別使用SMARTerTMRACE試劑盒中的5′-CDS Primer A和3′-CDS Primer A反轉錄合成。

1.3 纖毛蟲ALT全長cDNA的克隆

根據(jù) NCBI中已報道的原生生物的丙氨酸轉氨酶氨基酸序列, 進行同源性比對, 依據(jù)保守區(qū)域的氨基酸序列利用 Primer Premier 5.0設計簡并引物 Akf和 Akr(表1)(由上海生工生物技術服務有限公司合成)。分別以扇形游仆蟲cDNA和紅色偽角毛蟲cDNA為模板, 使用設計的兼并引物擴增扇形游仆蟲 ALT (EvALT)和紅色偽角毛蟲ALT (PrALT)的部分片段。依照瓊脂糖DNA純化回收試劑盒說明, 對目的產(chǎn)物進行切膠回收。參考pMD18-T Vector連接試劑盒中的說明書將目的基因連接到pMD18-T載體上, 并轉入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑取單菌落進行菌落 PCR檢測, 同時進行 LB液體培養(yǎng)基搖菌。選取經(jīng)PCR檢測, 且產(chǎn)物條帶大小正確的單菌落對應的菌液,送深圳華大基因科技有限公司測序鑒定。

經(jīng)NCBI BLAST分析檢測測序結果為所需的目的基因。在獲得EvALT和PrALT DNA片段基礎上, 設計特異性引物Ev-5′、Ev-3′和Pr-5′、Pr-3′(表1), 結合SMARTerTMRACE cDNA Amplification 試劑盒中的通用引物NUP(表1)進行5′和3′RACE-PCR, 分別擴增EvALT的5′、3′端序列和PrALT的5′、3′端序列。擴增體系及循環(huán)參數(shù)根據(jù)試劑盒說明書進行設置。PCR產(chǎn)物的回收、連接、轉化及測序同前。測序結果在 NCBI上進行比對分析, 確定為目的片段, 將5′端和3′端序列與目的基因片段序列進行拼接,獲得EvALT cDNA全長和PrALT cDNA全長。

1.4 ALT氨基酸序列分析

在 GenBank數(shù)據(jù)庫中進行基因序列相似性和同源性查找, 利用BioEdit軟件進行同源性比對。全長序列的開放閱讀框(Open Read Frame, ORF)序列使用DNAstar軟件進行分析。用DNAstar的EditSeq程序將獲得的ALT cDNA全長序列進行翻譯, 獲得氨基酸序列后, 在NCBI protein blast上進行檢測[12]。對該蛋白質的等電點和相對分子量利用在線程序Compute pI/Mw tool進行評估, 蛋白質的親/疏水性分析利用DNAstar的Protein工具[13], I-TASSER蛋白模型預測軟件預測蛋白質的空間結構, 應用SignalP4.1和TMHMM2.0在線分析軟件預測該蛋白的信號肽[14], 判斷其是否屬于分泌蛋白以及形成跨膜結構域等。

1.5 ML進化樹的構建

從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得19條ALT蛋白序列, 其中3條來自纖毛蟲原生動物。利用BioEdit軟件進行序列比對, 并用Phyml軟件構建ALT的最大似然樹。

2 結果

2.1 ALT基因全長cDNA序列的克隆和分析

扇形游仆蟲ALT序列特征 克隆得到扇形游仆蟲ALT的中間片段序列為255 bp, 5′端序列為433 bp, 3′端序列為713 bp且含有Poly A結構及終止密碼子TAA。拼接后最終獲得長度為1231 bp的EvALT cDNA全長序列, 最大開放閱讀框為1095 bp, 編碼364個氨基酸, 預測分子量約為 40.95 kD, 等電點為 4.74, GenBank登錄號為KP100062。該氨基酸組成中帶正電荷氨基酸(K、R)33個, 占9.07%, 帶負電荷氨基酸(D、E)51個, 占14.01%, 整個蛋白帶負電荷, 疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)116 個, 占31.87%, 極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)102個, 占 28.02%。親/疏水性分析結果顯示: EvALT蛋白在23—68、98—115、205—230、301—329和 355—364區(qū)域為疏水性區(qū)域, 在1—19、82—99、138—160、230—260 和324—354區(qū)域為親水區(qū)域。信號肽預測結果顯示該基因編碼的多肽鏈無信號肽, 不屬于分泌蛋白, 未形成跨膜結構域。纖毛蟲屬于單細胞生物, 因此該蛋白為胞內酶。

紅色偽角毛蟲ALT序列特征 克隆得到紅色偽角毛蟲ALT的中間片段序列為259 bp, 5′端序列為463 bp, 3′端序列為760 bp且含有Poly A結構及終止密碼子TGA。拼接后最終獲得長度為1164 bp的PrALT cDNA全長序列,最大開放閱讀框為1077 bp, 編碼358個氨基酸, 預測分子量約為40.22 kD, 等電點為5.23, GeneBank登錄號為KP100063。該氨基酸組成中帶正電荷氨基酸(K、R)36個, 占10.06%, 帶負電荷氨基酸(D、E)45個, 占12.57%, 整個蛋白帶負電荷, 疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)105 個, 占29.33%, 極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)101個, 占28.21%。親/疏水性結果顯示: PrALT蛋白在15—23、36—50、128—138和 350—360區(qū)域為疏水性區(qū)域, 在1—15、75—110、145—180、230—275和322—353區(qū)域為親水區(qū)域。信號肽預測結果顯示該基因編碼的多肽鏈無信號肽, 不屬于分泌蛋白, 未形成跨膜結構域。

表1 本文研究所用引物及用途Tab. 1 Sequences of primers used in this study

2.2 ALT氨基酸序列比對分析和基因功能區(qū)域

將獲得的 EvALT編碼的氨基酸序列通過 BLAST P搜索 NCBI的蛋白質數(shù)據(jù)庫, 發(fā)現(xiàn)該序列與三棱尖毛蟲(Oxytricha trifallax)的ALT氨基酸序列同源性為49%; 與草履蟲(Paramecium tetraurelia)的 ALT氨基酸序列同源性為50%; 與尾刺耐格里原蟲(Naegleria gruberi)的 ALT氨基酸序列同源性為49%。將獲得的PrALT編碼的氨基酸序列通過BLAST P搜索NCBI的蛋白質數(shù)據(jù)庫, 發(fā)現(xiàn)該序列與三棱尖毛蟲的 ALT氨基酸序列同源性為 64%;與小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)的 ALT氨基酸序列同源性為50%。

保守區(qū)域分析顯示, EvALT和PrALT氨基酸序列都包括一個完整的I型轉氨酶亞基和 10個保守的輔酶磷酸吡哆醛(PLP)結合位點。因此, 可以判斷擴增得到的兩條cDNA全長序列為丙氨酸轉氨酶蛋白家族基因。

2.3 丙氨酸轉氨酶蛋白的空間結構

I-TASSER蛋白模型預測扇形游仆蟲丙氨酸轉氨酶和紅色偽角毛蟲丙氨酸轉氨酶蛋白二級結構, 結果如圖1、2所示, 由無規(guī)則卷曲、α-型螺旋和β型結構組成。

I-TASSER蛋白模型預測軟件結果表明扇形游仆蟲ALT和紅色偽角毛蟲ALT與人類ALT2 (PDB:3ihjA)結構相似性最高, 分別達 43%和 42%。因此選取人類的ALT2為模板, 預測扇形游仆蟲 ALT和紅色偽角毛蟲ALT的空間結構, 結果如圖3、4所示。I-TASSER預測結果表明, 扇形游仆蟲ALT的預測結合位點和紅色偽角毛蟲ALT的預測結合位點與大麥(Hordeum vulgare)ALT (PDB:3tcmA)的預測結合位點的整體相似性分別達97.8% 和97.7%。

2.4 ALT氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析

ALT氨基酸序列構建最大似然樹(圖 5)。結果顯示,擴增得到的EvALT和PrALT氨基酸序列與三棱尖毛蟲、嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)、以及草履蟲ALT氨基酸序列聚為一簇, 親緣關系最近。氨基酸序列聚類分析表明, EvALT和PrALT氨基酸序列與其他纖毛蟲種類的 ALT氨基酸序列同源性均較高, 進一步證實該蛋白應屬于丙氨酸轉氨酶家族成員。

3 討論

圖1 扇形游仆蟲ALT蛋白二級結構圖(黑色實線表示無規(guī)卷曲; 波浪線表示α-型螺旋; 箭頭實線表示β-型結構)Fig. 1 Predicted secondary structure of E. vannus ALT (Randon coil is indicated with black solid lines; α-helix is indicated with wavy lines; β-sheet is indicated with arrow lines)

圖2 紅色偽角毛蟲ALT蛋白二級結構圖(黑色實線表示無規(guī)卷曲; 波浪線表示α-型螺旋; 箭頭實線表示β-型結構)Fig. 2 Predicted secondary structure of P. rubra ALT (Randon coil is indicated with black solid lines; α-helix is indicated with wavy lines; β-sheet is indicated with arrow lines)

圖3 I-TASSER蛋白模型預測的扇形游仆蟲ALT空間結構Fig. 3 The spatial structure of E. vannus ALT predicted by I-TASSER protein model

圖4 I-TASSER蛋白模型預測的紅色偽角毛蟲ALT空間結構Fig. 4 The spatial structure of P. rubra ALT predicted by I-TASSER protein model

扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲均為海洋水體中習見種,主要生活在水體底部, 具有部分重疊的生態(tài)位。扇形游仆蟲通常為長方形, 但在營養(yǎng)充分時蟲體常變形為闊橢圓形, 可在大范圍鹽度變化的環(huán)境內存活并極易繁殖為水體內的優(yōu)勢種[15]; 紅色偽角毛蟲體型細長, 運動較慢,主要以各類小型原生生物為食[16]。因其自身的特點, 扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲在生態(tài)毒理學中常作為檢測水體重金屬、殺蟲劑等污染的指示生物[17]。

代謝活力和代謝途徑改變是生物體生長發(fā)育過程中提高抗逆性的一條重要途徑[18], 具有重要的生理意義。轉氨酶是一類以磷酸吡哆醛為輔酶的代謝酶, 而丙氨酸轉氨酶是丙氨酸代謝途徑的一個關鍵酶和限速酶[19], 其表達強度和酶活性將會影響生物個體的生長狀況。本研究所克隆得到的扇形游仆蟲丙氨酸轉氨酶和紅色偽角毛蟲丙氨酸轉氨酶均具有轉氨酶家族Ⅰ所具有的典型結構特點[20],轉氨酶家族Ⅰ的一個保守亞基折疊形成一個倒 U型的空間結構, 該結構特點使輔酶 PLP與丙氨酸轉氨酶蛋白結合較為松弛[21], 導致酶活性變化易于受外源異質性物質影響。為此, 丙氨酸轉氨酶家族Ⅰ所具有的典型結構特點為丙氨酸轉氨酶作為生物標記物提供了結構上的可能。Wee等[22]研究發(fā)現(xiàn)鯰魚丙氨酸轉氨酶活性能對養(yǎng)殖水體氨態(tài)鹽梯度變化做出敏感響應, 表明了該酶具有作為環(huán)境監(jiān)測生物標記物的巨大潛力。

圖5 根據(jù)不同物種的ALT氨基酸序列構建的最大似然樹Fig. 5 Phylogenetic tree inferred from different species of ALT amino acid sequences using maximum likelihood method

對 ALT構建最大似然樹及聚類分析, 可為不同物種間ALT親緣關系進行比較分析。三棱尖毛蟲、嗜熱四膜蟲和草履蟲都屬于纖毛蟲原生動物, 系統(tǒng)發(fā)育樹顯示扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲與以上三種纖毛蟲的ALT聚集為一簇, 親緣關系最近; 而與魚類和哺乳類動物的 ALT親緣關系較遠, 這與動物的經(jīng)典分類一致。推測也可能是ALT在進化過程中處于環(huán)境選擇性等壓力支配下發(fā)生了演化, 以適應不同物種在不同的環(huán)境中更有利于發(fā)揮其生物學功能[23]。

本工作可為深入探究原生動物ALT酶活性、基因表達和蛋白表達等作為生物標記物的研究提供重要的生物學信息。如將扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲作為指示生物,通過測定扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲丙氨酸轉氨酶活性、基因表達和蛋白表達的變化, 監(jiān)測海洋養(yǎng)殖水體中漁藥、銨態(tài)氮和重金屬等污染狀況。但是有關生物標記物的反應模式與劑量間的關系受諸多因素的影響, 例如, 物種特異性、暴露時間、污染物性質等, 因此, 評價酶活性、基因表達和蛋白表達等作為生物標記物的有效性, 還需要針對以上影響因素做進一步的研究。

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CLONING AND CHARACTERIZATION OF ALT GENE IN TWO SPECIES OF CILIATES (EUPLOTES VANNUS AND PSEUDOKERONOPSIS RUBRA)

LIU Shu-Xing, HONG Ya-Zhen, LIN Xiao-Feng and LI Ji-Qiu
(Laboratory of Protozoology, Key Laboratory of Ecology and Environment Science in Guangdong Higher Education, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

扇形游仆蟲; 紅色偽角毛蟲; 丙氨酸轉氨酶; RACE; 序列分析

Euplotes vannus; Pseudokeronopsis rubra; Alanine aminotransferase; RACE; Sequence characterization

Q344+.1

A

1000-3207(2015)06-1261-05

10.7541/2015.165

2014-09-23;

2015-03-23

國家自然科學基金項目(31222050, 41476128)資助

劉書興(1989—), 男, 江西上饒人; 碩士; 研究方向為生態(tài)毒理學。E-mail: liushuxing66@163.com

李繼秋, E-mail: lijiqiu@126.com