血小板衍生生長因子調(diào)節(jié)休克血管反應(yīng)性的非MLC20磷酸化機制與HSP27和Caldesmon的關(guān)系

朱 娛，彭小勇，藍(lán) 丹，李 濤

嚴(yán)重創(chuàng)傷/休克晚期常出現(xiàn)血管的低反應(yīng)性，表 現(xiàn)為全身血管對縮血管物質(zhì)或舒血管物質(zhì)的反應(yīng)降低或不反應(yīng)，是導(dǎo)致休克后期血壓不能有效提升、組織灌注難以改善、組織缺氧和損傷進(jìn)行性加重的重要原因［1－2］。已有研究發(fā)現(xiàn)血管低反應(yīng)性的發(fā)生與腎上腺能受體失敏、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)鉀、鈣功能失常及細(xì)胞膜超極化有關(guān)［3］。這些機制均通過抑制MLC20磷酸化發(fā)揮作用。近來研究表明:非MLC20磷酸化也參與血管平滑肌細(xì)胞的收縮。Lee等［4］報道了ET-1誘導(dǎo)兔子主動脈的收縮，但MLC20磷酸化水平?jīng)]有增加;Su等［5］發(fā)現(xiàn)組胺能使豬平滑肌細(xì)胞收縮，PI3K的抑制劑wortmannin能減少組胺引起的平滑肌細(xì)胞收縮，但不減少MLC20磷酸化水平。這些結(jié)果均表明非MLC20磷酸化通路參與平滑肌細(xì)胞收縮的調(diào)節(jié)。然而，非MLC20磷酸化通路是否參與休克后血管低反應(yīng)性的發(fā)生，以及怎樣調(diào)節(jié)血管低反應(yīng)性，尚不清楚。

許多研究證實:Caldesmon和27-kDa的熱休克蛋白(HSP27)通過調(diào)節(jié)肌球蛋白和肌動蛋白(不涉及MLC20磷酸化通路)，參與平滑肌細(xì)胞的收縮。Caldesmon是調(diào)節(jié)細(xì)肌絲的蛋白，其C端結(jié)合肌動蛋白，抑制肌球蛋白ATP酶活性，導(dǎo)致平滑肌收縮減弱［6－9］。HSP27是熱休克蛋白家族的一員，廣泛分布于不同組織和細(xì)胞中。在平滑肌和心肌細(xì)胞，HSP27作為肌動蛋白的分子伴侶與細(xì)肌絲一起參與細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)。Caldesmon和HSP27是否通過非MLC20磷酸化參與休克后血管低反應(yīng)性的發(fā)生尚不清楚。

血小板衍生的生長因子(platelet derived-growth factor，PDGF)是血管內(nèi)皮生長因子中的重要成員，在許多組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞［10］。PDGF除了在急性損傷和一些慢性損傷中能夠加速組織修復(fù)和傷口愈合外，還能引起血管平滑肌細(xì)胞收縮［11－13］。通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，PDGF能夠激活平滑肌細(xì)胞中Caldesmon和HSP27的表達(dá)。因此本實驗采用失血性休克和缺氧處理的腸系膜上動脈(SMA)作為模型，來探討PDGF在血管低反應(yīng)中調(diào)節(jié)非MLC20磷酸化的機制，以及與Caldesmon和HSP27的關(guān)系。

材料與方法

1 動物模型及方法

動物模型:SD大鼠(200～250g)，雌雄不拘，由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實驗動物中心提供(所有動物遵照第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物指南規(guī)范操作)，禁食過夜，自由飲水，3%戊巴比妥鈉麻醉，行左股動脈插管，用于監(jiān)測血壓。插管后穩(wěn)定10min，從左股動脈抽血使平均動脈壓降至40mmHg，維持2h，制成失血性休克模型。

血管的準(zhǔn)備:從休克或假手術(shù)組的大鼠取出SMA，去掉周圍的結(jié)締組織后，將其切成2～3mm長的動脈環(huán)，用于張力測定。根據(jù)實驗要求，對血管環(huán)行缺氧或不缺氧處理，缺氧組血管環(huán)放到缺氧罐中，95%N2和 5%CO2以 10L/min充氧 15min，平衡10min，重復(fù)3次直到氧濃度＜0.2%，維持2h，制成缺氧模型。

血管反應(yīng)性測定:將已處理的血管環(huán)懸掛于一對不銹鋼絲上，一端置于固定柱上，另一端與肌張力換能器相連，放入注有K-H液［Krebs-Henseleit solution，組成(mM):NaCl 118、KCl 4.7、NaHCO325、KH2PO4 1.03、MgSO4·7H2O 0.45、CaCl22.5、葡萄糖11.1、pH 7.4］的離體器官灌流浴槽中，持續(xù)充入95%O2和5%CO2混合氣體，給予血管環(huán)初張力0.5g、37℃恒溫孵育120min，每30min換液1次，待張力曲線平穩(wěn)后，依次加入終濃度分別為 10－9、10－8、10－7、10－6、10－5和 10－4mol/L 的去甲腎上腺素(NE)。血管環(huán)對NE的反應(yīng)性用濃度累計法測定，記錄不同NE濃度下各血管環(huán)產(chǎn)生的最大收縮力，以收縮力/血管環(huán)重量(g/mg組織)為量化標(biāo)準(zhǔn)，作量-效曲線和Emax圖評價血管收縮反應(yīng)性。

MLC20磷酸化:取大鼠的腸系膜動脈置于含丙酮、二硫蘇糖醇(DTT)的保存液中－70℃保存固定3d，然后將血管晾干后剪碎，加蛋白提取液混勻后在搖床上振蕩1.5h，15 000rmp離心15min后取上清，即為蛋白。

HSP27和Caldesmon的表達(dá):制備蛋白樣品后置于－70℃保存?zhèn)溆谩Ｗ冃院笥?0%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2h后，三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBST)洗滌3次，用HSP27和HSP27磷酸化(p-HSP27)抗體1∶1000，CaD和 CaD磷酸化(p-CaD)抗體1∶1000孵育4℃過夜，TBST洗滌3次后，與二抗1∶10000室溫孵育1h，TBST洗滌4次后，使用電化學(xué)發(fā)光液(ECL)進(jìn)行反應(yīng)，暗室曝光。使用β-肌動蛋白(β-actin)作為陽性對照。

2 實驗步驟

2.1 非MLC20磷酸化途徑在PDGF調(diào)節(jié)休克后血管反應(yīng)性中的作用 將48只大鼠隨機分成6組，每組8只，分別為:假手術(shù)組、休克組、休克+PDGF(40、60、80、100ng/ml)組。SMA 用于測定對 NE 的反應(yīng)性［14］(AD 設(shè)備，Castle Hill，NSW，澳大利亞)，剩下的腸系膜動脈用于測定MLC20磷酸化水平。在休克+PDGF(40、60、80、100ng/ml)組，SMA 和腸系膜動脈均孵育 PDGF(40、60、80、100ng/ml)15min，再觀察血管的收縮反應(yīng)和MLC20磷酸化水平。用甘油聚丙烯凝膠電泳測定MLC20磷酸化水平，用累積的去甲腎上腺素濃度來反映SMA的反應(yīng)性［15］。

2.2 Caldesmon和HSP27在PDGF調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性中的作用及與MLC20途徑的關(guān)系 為了觀察Caldesmon和HSP27在PDGF是否通過非MLC20磷酸化調(diào)節(jié)血管的收縮反應(yīng)中的作用，用不同濃度的PDGF作用后，觀察 Caldesmon(p-Caldesmon)和HSP27(p-HSP27)的蛋白水平變化，以及用Caldesmon和HSP27的反義寡核苷酸(AODN)抑制后(CaldesmonAODN序列:5-TCTCTTCCTCCTCCTCCTCCT-3';HSP27AODN序列:5-ATCTCCACCACGCCTTCCTT-3')，觀察PDGF在非MLC20磷酸化中調(diào)節(jié)血管的收縮反應(yīng)性和MLC20磷酸化水平。Caldesmon或HSP27AODN(終濃度100u M)與轉(zhuǎn)染試劑以體積比5∶1轉(zhuǎn)染正常大鼠血管環(huán)，24h后行缺氧處理，同時用100ng/ml PDGF孵育血管環(huán)。實驗當(dāng)天，血管環(huán)按上述方法缺氧，觀察SMA對NE的收縮反應(yīng)及Caldesmon和HSP27的表達(dá)情況。

3 統(tǒng)計分析

結(jié) 果

1 非MLC20磷酸化途徑在PDGF調(diào)節(jié)休克后血管反應(yīng)性中的作用

血管反應(yīng)性:與假手術(shù)組比較，休克后SMA的血管反應(yīng)性顯著下降，不同濃度的 PDGF(40、60、80、100ng/ml)可以改善血管反應(yīng)性，呈劑量依賴性;用不同濃度 PDGF(40、60、80、100ng/ml)孵育后，血管反應(yīng)性從休克組的0.708(g/mg組織)分別增加到1.232、1.371、1.671、1.803(g/mg 組織)。與休克組比較，PDGF不同濃度增加血管反應(yīng)性比例分別為74.01%、93.64%、136.01%、154.66%(圖1)。

圖1 不同濃度PDGF對血管反應(yīng)性的影響

MLC20磷酸化:與假手術(shù)組比較，腸系膜動脈的MLC20磷酸化顯著降低，從假手術(shù)組的32.56%降低到休克組10.26%。不同濃度的PDGF增加MLC20磷酸化，但PDGF不同濃度間的MLC20磷酸化水平無顯著性差異，分別為 30.23%(40ng/ml)、31.25%(60ng/ml)、31.02%(80ng/ml)、31.56%(100ng/ml)(圖2)。

圖2 不同濃度PDGF的MLC20磷酸化

2 Caldesmon和HSP27在非MLC20磷酸化途徑中調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性的作用

Caldesmon和HSP27磷酸化:在對照組、休克組和不同濃度的PDGF組中，Caldesmon和HSP27的蛋白表達(dá)無顯著性變化，但休克后Caldesmon的磷酸化增加而 HSP27的磷酸化降低，不同濃度的PDGF(40、60、80和100ng/ml)可以逐漸降低休克引起的Caldesmon磷酸化的增加，而增加休克導(dǎo)致的HSP27磷酸化的下降(圖3)。

血管反應(yīng)性:與對照組比較，缺氧后血管反應(yīng)性降低，PDGF100ng/ml可以增加SMA的血管反應(yīng)性，HSP27AODN可以抑制PDGF引起的血管反應(yīng)性的增加，CaldesmonAODN可進(jìn)一步增加PDGF誘導(dǎo)的血管反應(yīng)性的增加(圖4)。

MLC20磷酸化:與對照組比較，休克組的腸系膜動脈的MLC20磷酸化降低，PDGF100ng/ml可以增加休克后腸系膜動脈的MLC20磷酸化，HSP27和CaldesmonAODN不能抑制PDGF引起的MLC20磷酸化的增加(圖5)。

圖3 不同濃度PDGF對Caldesmon和HSP27磷酸化水平的影響

圖4 HSP27AODN和CaldesmonAODN在PDGF調(diào)節(jié)休克血管反應(yīng)性中的作用

圖5 HSP27AODN和CaldesmonAODN對MLC20磷酸化的影響

討 論

血管低反應(yīng)嚴(yán)重影響著疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療，它是許多危重癥的重要死亡原因之一。目前的研究表明休克后血管低反應(yīng)性的發(fā)生機制與平滑肌細(xì)胞受體失敏、膜超極化以及我們實驗室提出的鈣失敏有關(guān)。嚴(yán)重創(chuàng)傷或休克后，高濃度的血管活性物質(zhì)，大量的一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素、腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素(IL)或內(nèi)源性的阿片肽引起受體降解、內(nèi)化或去磷酸化;在休克或創(chuàng)傷時，三磷酸腺苷(ATP)缺乏導(dǎo)致了ATP敏感的ATP依賴的鉀離子通道(KATP)激活，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度降低，MLC20磷酸化和血管反應(yīng)性下降。我們先前的實驗進(jìn)一步證明了鈣敏感性的降低，Rho蛋白(Rho kinase)和蛋白激酶 C(PKC)通過抑制 MLCP的活性，增加MLC20磷酸化調(diào)節(jié)鈣敏感性［16－18］。這些引起休克后血管低反應(yīng)性的機制主要是通過降低MLC20磷酸化水平從而降低血管的收縮反應(yīng)。

目前的研究表明，非MLC20磷酸化通路參與了休克后血管低反應(yīng)性的發(fā)生。Caldesmon和HSP27也參與休克后血管低反應(yīng)性的調(diào)節(jié)。Caldesmon是一種特殊的肌動蛋白結(jié)合蛋白，在體內(nèi)廣泛存在，分為輕型和重型。重型鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白只在血管和內(nèi)臟平滑肌以及肌上皮細(xì)胞有表達(dá)，其C端包括肌動蛋白結(jié)合域，原肌球蛋白結(jié)合域和鈣調(diào)蛋白結(jié)合域，在N端具有肌球蛋白結(jié)合域［18］。重型鈣調(diào)蛋白不僅可以起到抑制肌球蛋白Mg-ATP酶活性的作用，還可以抑制平滑肌磷酸化肌球蛋白所引發(fā)的肌動蛋白絲的移動，是一種重要的調(diào)節(jié)蛋白。Caldesmon磷酸化后不再抑制ATP酶活性，有利于肌肉收縮。當(dāng)平滑肌受外界刺激時，可通過特異性激活PKCε，啟動促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，通過一系列級聯(lián)反應(yīng)，引起Caldesmon間接磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)平滑肌的收縮。

HSP27是小分子量HSPs(small HSPs，sHSPs)亞家族中的重要一員，具有保護(hù)細(xì)胞免受各種應(yīng)激因素的損傷的功能，促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊;與細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)密切相關(guān)。在多種應(yīng)激條件下，HSP27作為分子伴侶發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的功能。黃捷等［19］研究結(jié)果顯示HSP27直接參與了PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移過程，論證了HSP27是血管平滑肌細(xì)胞遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

本實驗結(jié)果證實，休克后血管反應(yīng)性明顯降低，不同濃度PDGF能劑量依賴地增加休克血管反應(yīng)性，卻不能劑量依賴地增加MLC20磷酸化水平。休克后Caldesmon的磷酸化增加而HSP27的磷酸化降低，不同濃度的 PDGF(40、60、80和100ng/ml)可以逐漸降低休克引起的Caldesmon磷酸化的增加，而逐漸增加休克導(dǎo)致的HSP27磷酸化的下降。說明PDGF調(diào)節(jié)休克血管反應(yīng)性的非MLC20磷酸化機制與HSP27和Caldesmon相關(guān)。

［1］陳墾，劉良明.缺氧誘導(dǎo)因子1ɑ對失血性休克大鼠腸系膜上動脈血管環(huán)舒張反應(yīng)性的調(diào)控作用［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2010，32(4):319 －323.

［2］Liu LM，Yang GM，Zhu Y，et al.Role of non － MLC20 phosphorylation pathway in the regulation of vascular reactivity during shock［J］.J Surg Res，2014，187(2):571 －580.

［3］Liang JL，Yang GM，Li T，et al.Interleukin 1βattenuates vascular α1 adrenergic receptors expression following lipopolysaccharide-induced endotoxemia in rabbits:involvement of JAK2 － STAT3 pathway［J］.J Trauma Acute Care Surg，2014，76(3):762 －770.

［4］Lee HM，Won KJ，Kim J，et al.Endothelin － 1 induces contraction via a syk-mediated p38 mitogen-activated protein kinase pathway in rat aortic smooth muscle［J］.J Pharmacol Sci，2007，103(4):427 －434.

［5］Su XL，Smolock EM，Marcel KN，et al.Phosphatidylinositol 3－kinase modulates vascular smooth muscle contraction by calcium and myosin light chain phosphorylation-independent and-dependent pathways［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，286(2):657 －666.

［6］周琴，易光輝.HSP27對動脈損傷的細(xì)胞保護(hù)機制［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2010，18(11):137－139.

［7］Lee YR，Lee CK，Park HJ，et al.c － Jun N-terminal kinase contributes to norepinephrine-induced contraction through phosphorylation of caldesmon in rat aortic smooth muscle［J］.J Pharmacol Sci，2006，100(2):119 －125.

［8］徐彥龍，高靚，等.針刺調(diào)節(jié)腦梗死大鼠腦血管平滑肌CaP、CaD變化的實驗研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2012，39:(9):1864－1866.

［9］Mayanagi T，Sobue K.Diversification of caldesmon－linked actin cytoskeleton in cell motility［J］.Cell Adh Migr，2011，5(2):150 －159.

［10］Hoch RV，Soriano P.Roles of PDGF in animal development［J］.Development，2003，130(20):4679 － 4784.

［11］Judith R，Nithya M，Rose C，et al.Application of a PDGF－ containing novel gel for cutaneous wound healing［J］.Life Sci，2010，87(1):1 －8.

［12］Mulder G，Tallis AJ，Marshall VT，et al.Treatment of nonhealing diabetic foot ulcers with a platelet-derived growth factor gene－activated matrix(GAM501):results of a phase 1/2 trial［J］.Wound Repair Regen，2009，17(6):772－779.

［13］Zhao Y，Lv W，Piao H，et al.Role of platelet－ derived growth factor－BB(PDGF－BB)in human pulmonary artery smooth muscle cell proliferation［J］.J Recept Signal Transduct Res，2014，［Epub ahead of print］.

［14］Li T，Yang GM，Zhu Y，et al.The mechanism by which RhoA regulatesvascularreactivity afterhemorrhagic shock in rats［J］.Am J Physiol，2010，299(2):H292 －299.

［15］劉嘉，梁新華，焦炎.小鼠胃和闌尾組織中h－CD降解規(guī)律與死亡時間的相關(guān)性究［J］.中國醫(yī)學(xué)導(dǎo)報，2011，8(6):17 －19.

［16］Li T，F(xiàn)ang YQ，Zhu Y，et al.Beneficial effect of activation of PKC on hemorrhagic shock in rats［J］.J Trauma，2010，68(4):865 －873.

［17］閔清，白育庭，劉晶，等.山楂葉總黃酮對大鼠血管環(huán)的作用及其機制探討［J］.中國藥理學(xué)通報，2011，27(4):585－590.

［18］Li T，F(xiàn)ang YQ，Yang GM，et al.Effects of the balance in activity of RhoA and Rac1 on the shock－induced biphasic change of vascular reactivity in rats［J］.Ann Surg，2011，253(1):185 －193.

［19］黃捷，謝良地，許昌聲，等.RNA干擾熱休克蛋白27基因?qū)ψ园l(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的影響［J］.中華高血壓雜志，2010，18(8):761 －764.