miR-125b甲基化在同型半胱氨酸促進血管平滑肌細胞增殖中的作用

劉現(xiàn)梅，曹成建，田　玨，趙　麗，孔繁琪，周龍霞，陳久凱，王艷華，楊曉玲，賈月霞，姜怡鄧(寧夏醫(yī)科大學(xué).基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、.檢驗學(xué)院，寧夏銀川　750004)

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miR-125b甲基化在同型半胱氨酸促進血管平滑肌細胞增殖中的作用

劉現(xiàn)梅1，曹成建2，田玨1，趙麗2，孔繁琪1，周龍霞1，陳久凱2，王艷華2，楊曉玲1，賈月霞1，姜怡鄧1
(寧夏醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.檢驗學(xué)院，寧夏銀川750004)

中國圖書分類號: R322.74; R329.24; R341.7; R543.5; R977. 4

摘要:目的探討同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)促進血管平滑肌細胞增殖中miR-125b甲基化的作用。方法原代培養(yǎng)人臍靜脈平滑肌細胞(VSMCs)，并分為空白對照組(0 μmol·L－1Hcy)，不同濃度Hcy干預(yù)組(50、100、200及500 μmol·L－1Hcy)，以熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測miR-125b的表達變化;利用miR-125b前體和抑制劑轉(zhuǎn)染VSMCs 后MTT法檢測細胞增殖活性;生物信息學(xué)分析miR-125b啟動子區(qū)CpG島分布情況，巢式降落式甲基特異性PCR(nt-MSP)法檢測miR-125b甲基化狀態(tài)的變化;并利用DNA甲基化酶抑制劑5-氮雜胞苷(AZC)干預(yù)細胞后再次檢測miR-125b的表達。結(jié)果與對照組相比，100，200及500 μmol· L－1Hcy可使miR-125b的表達水平降低，差異有顯著性(P ＜0. 01); miR-125b前體可以抑制VSMCs增殖，而miR-125b抑制劑可以促進VSMCs增殖(P＜0. 01);以miR-125b基因上游3 700 bp作為研究對象，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-125b啟動子區(qū)含有一個長度為792bp(1881-2672區(qū)域)的CpG島，且在Hcy干預(yù)下miR-125b的甲基化水平增強(P＜0. 01);而用AZC干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)miR-125b表達上調(diào)，差異有顯著性(P＜0. 05)。結(jié)論Hcy可能通過下調(diào)miR-125b表達從而促進VSMCs增殖，可能通過上調(diào)miR-125b基因甲基化水平從而下調(diào)miR-125b表達。

關(guān)鍵詞:同型半胱氨酸; miR-125b; DNA甲基化;血管平滑肌細胞;動脈粥樣硬化;增殖網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015－6－5 11:22

網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.027.html

姜怡鄧(1974－)，男，博士，教授，研究方向:心血管病理生理學(xué)，通訊作者，Tel: 0951-6980998，E-mail: jwcjyd @ 163.com

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的獨立危險因子［1］，Hcy可通過促進血管平滑肌細胞(vascular smooth musclecells，VSMCs)增殖而影響AS的發(fā)生發(fā)展［2－3］，但Hcy促進VSMCs增殖的機制尚不完全清楚。microRNA(miRNA)參與了多種細胞的增殖、凋亡、分化等過程，其中，miR-125b是動脈平滑肌細胞主要表達的miRNA之一［4］，而且在某些VSMCs增殖為特征的病變組織中miR-125b的表達與正常組織中差異存在顯著性［5］。但Hcy是否通過影響miR-125b的表達而促進VSMCs增殖未見報道。研究表明，Hcy可通過影響基因啟動子區(qū)甲基化程度而影響基因表達，因此本研究擬探討Hcy是否通過改變miR-125b基因啟動子區(qū)甲基化水平從而影響miR-125b的表達，進而促進VSMCs增殖。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶(Hyclone公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(Fermentas公司); TRIzol試劑(Invitrogen公司); DNA抽提試劑盒(北京百泰克); DNA甲基化修飾試劑盒(美國ZYMO RESEARCH);鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(北京中杉金橋)。引物由上海生工生物工程公司合成。PCR儀(美國Eppendorf公司);電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1原代血管平滑肌細胞培養(yǎng)新鮮臍帶取自寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科健康足月剖腹產(chǎn)胎兒，取臍靜脈進行血管平滑肌細胞的原代培養(yǎng)。首先，將剖宮產(chǎn)術(shù)后胎兒的臍靜脈取下后，放入加有雙抗(100 kU·L－1青霉素、1×105g·L－1鏈霉素)的DHank's液中。剝離血管外膜及結(jié)締組織，將血管中膜部分留下，再沿著血管方向?qū)⑵浼糸_，用棉簽輕輕擦拭上表面，將內(nèi)膜拭去后將之放入另一培養(yǎng)皿中，滴少量DMEM(含F(xiàn)12)培養(yǎng)液，將血管條切成1 mm2的小組織塊，然后轉(zhuǎn)進培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。待原代細胞生長至0. 7～0. 9時，用胰酶消化傳代，選取生長良好的第3～7代細胞用于實驗。培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)為0. 1胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基，置于37℃，飽和濕度體積分?jǐn)?shù)為0. 05 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。并將細胞分為空白對照組(0 μmol·L－1Hcy)，不同濃度Hcy干預(yù)組(50、100、200及500 μmol· L－1Hcy)。

1.2.2熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-125b的表達按照試劑盒說明書提取總miRNA，之后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板進行熒光定量PCR檢測miR-125b的表達; miR-125b引物序列:上游5'-GGGTCCCTGAGACCCTAACTTGT-3'，下游5'-GCTGTCAACATACGCT ACGTA-3'，擴增產(chǎn)物78 bp;反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35次循環(huán)。以U6為內(nèi)參照，根據(jù)PCR儀自動生成的Ct值，根據(jù)公式計算目的基因的相對量:相對表達量=2－△△Ct。

1.2.3巢式降落式甲基化特異性PCR(ntMS-PCR)檢測miR-125b DNA甲基化程度根據(jù)DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，用亞硫酸鹽修飾法對DNA進行修飾，設(shè)計外引物、甲基化引物(M)及非甲基化引物(U)，miR-125b外引物上游: 5' GGATGGTGTTATAGGAGGTTGTG-3'，下游: 5'-CTCTTTCCCCCAAAACAAATATAC-3'，產(chǎn)物長度為445 bp; M上游: 5'-GATGGTGTTATAGGAGGTTGTGC-3'，下游: 5'-AAAAAACCAAAAAATAAAATTCGAA-3'; U上游: 5'-GATGGTGTTATAGGAGGTTGTGTG-3'，下游: 5'-AAAAAACCAAAAAATAAAATTCAAA-3'。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5 min，然后采用降落式PCR程序，30個循環(huán)，再于恒定的退火溫度下進行20個循環(huán)，最后72℃再延伸10 min，甲基化產(chǎn)物與非甲基化產(chǎn)物均為117 bp，反應(yīng)后取終產(chǎn)物，在2%瓊脂糖凝膠電泳，分析光密度，按如下公式進行結(jié)果的計算:甲基化/% = OD甲基化/(OD甲基化+ OD非甲基化)×100%。

1.2.4 MTT法檢測平滑肌細胞增殖活性0. 25%胰蛋白酶消化VSMCs，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基稀釋成單細胞懸液，以每孔103～104的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔終體積200 μL。繼續(xù)培養(yǎng)待細胞進入對數(shù)生長期后，將血清含量降至5%繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以同步化細胞。然后以Lip2000轉(zhuǎn)染miR-125b各組分，后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μL MTT試劑(PBS稀釋為質(zhì)量濃度5 g·L－1)，避光培養(yǎng)4 h，每孔換為150 μL DMSO，在搖床上搖動15 min后，490 nm檢測波長下用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(optical density)，計算抑制率。抑制率/% =(1－實驗組測定值/空白對照組測定值)×100%。以時間為橫軸，細胞生長抑制率為縱軸，繪制細胞生長曲線。利用酶標(biāo)儀測定各孔光吸收值，記錄并分析結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1 Hcy對miR-125b表達的影響qRT-PCR法檢測各組VSMCs中miR-125b的表達，結(jié)果顯示，Hcy干預(yù)各組miR-125b表達下調(diào)，但并不呈劑量依賴關(guān)系，在100 μmol·L－1Hcy處作用最明顯，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0. 01)，50 μmol Hcy組差異雖無統(tǒng)計學(xué)意義，但有下降趨勢，見Fig 1。

Fig 1　Different concentrations of Hcy inhibited expression of miR-125b*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group

2.2 miR-125b對細胞增殖的影響利用miR-125b前體和抑制劑分別轉(zhuǎn)染VSMCs，兩者的終濃度為100 nmol·L－1。然后利用MTT法檢測細胞增殖活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pEZX-miR125b可以抑制VSMCs增殖，而轉(zhuǎn)染miR-125b inhibitor卻促進VSMCs增殖，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見Fig 2。

Fig 2　MiR-125b infected proliferative activity of vascular smooth muscle＊＊P＜0.01 vs control group

2.3 miR-125b生物信息學(xué)分析利用生物信息學(xué)軟件CpG island searcher分析miR-125b啟動子區(qū)CpG島，選取miR-125b基因上游3 700 bp作為研究對象，發(fā)現(xiàn)miR-125b啟動子區(qū)含有一個長度為792bp(1881－2672區(qū)域)的CpG島，提示miR-125b基因很可能受到甲基化的調(diào)控，見Fig 3。

Fig 3　Bioformatics analysis of miR-125b

2.4 Hcy對miR-125b啟動子區(qū)甲基化程度的影響用Hcy干預(yù)的各組細胞，利用ntMS-PCR法檢測miR-125b甲基化程度變化，如Fig 4所示，不同濃度Hcy干預(yù)后，miR-125b啟動子區(qū)發(fā)生高甲基化變化，但并不呈劑量依賴關(guān)系，在100 μmol·L－1組作用最明顯，與對照組相比，差異有顯著性(P＜0. 01)，見Fig 4。

Fig 4　Hcy induced change of miR-125b DNA methylation levelM: Methylated production; U: Unmethylated production.＊＊P＜0. 01 vs control.

2.5 AZC干預(yù)后miR-125b表達水平變化根據(jù)上述實驗結(jié)果，選取100 μmol·L－1Hcy干預(yù)VSMCs，在加入DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷(AZC)10 nmol·L－1后，再次檢測miR-125b表達，結(jié)果顯示AZC組與100 μmol·L－1Hcy干預(yù)組相比miR-125b表達水平升高(P＜0. 05)，提示miR-125b的表達受到甲基化的調(diào)控，見Fig 5。

Fig 5　Change of miR-125b expression after AZC intervention*P＜0. 05 vs 100 μmol·L－1Hcy group

3　討論

本研究結(jié)果顯示，Hcy可降低VSMCs的miR-125b表達; miR-125b前體可抑制VSMCs增殖，抑制miR-125則促進VSMCs增殖; Hcy干預(yù)VSMCs后miR-125b啟動子區(qū)發(fā)生高甲基化變化，而加入DNA甲基化酶抑制劑AZC后，miR-125b表達升高。

microRNA(miRNA)是一類長度只有21nt左右的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，是近年來基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的研究熱點。研究表明，miRNA雖然大約只占人類預(yù)測基因的3%以上，但卻調(diào)控大約30%的蛋白編碼基因，參與多種細胞的增殖、凋亡、分化等過程［6］。不同組織和細胞具有特異性的miRNAs，如miR-223在造血系統(tǒng)特異性表達，miR-1、miR-30c 和miR-26等在心肌細胞中特異表達［7］;而動脈血管平滑肌細胞主要表達的miRNA為miR-125b、miR-145等［4］。miR-125b不僅在不同的正常組織中表達不同，在正常組織與病理組織中的表達也存在明顯差異，如Ruirui等［5］利用基因芯片的技術(shù)，檢測了球囊損傷誘導(dǎo)的血管新生內(nèi)膜形成模型中頸動脈microRNA的表達，發(fā)現(xiàn)miR-125b的含量下調(diào)。VSMCs增殖是血管新生內(nèi)膜形成的關(guān)鍵分子事件［8］，提示miR-125b可能在血管功能中發(fā)揮重要作用，并可能調(diào)控VSMCs的增殖。本實驗檢測Hcy干預(yù)下的VSMCs中miR-125b的表達，發(fā)現(xiàn)其水平降低;而轉(zhuǎn)染miR-125b的前體(通過細胞內(nèi)生物學(xué)過程表達miR-125b)或抑制劑后檢測VSMCs細胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)其前體可以使細胞增殖活性下降，而其抑制劑可以使細胞增殖活性升高。綜合以上結(jié)果，提示Hcy可通過下調(diào)miR-125b的表達而促進VSMCs的增殖。

為了進一步明確Hcy下調(diào)miR-125b的表達的機制，我們檢測了miR-125b的甲基化水平。DNA甲基化是表觀遺傳范疇的重要內(nèi)容之一，所謂DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的催化下，將甲基轉(zhuǎn)移到CpG二核苷酸5'胞嘧啶的第5位碳原子上的過程［9］。DNA甲基化研究最早在腫瘤中開展，而近年關(guān)于DNA甲基化在AS中的作用越來越受到關(guān)注。在AS形成中，國內(nèi)外先后報道了LDL受體等［10］的DNA甲基化改變。本課題組前期研究在人臍靜脈細胞培養(yǎng)的過程中加入不同濃度的Hcy培養(yǎng)過程中也觀察到全基因組、ApoE等基因的甲基化改變［11－12］。一般情況下，DNA的甲基化會使基因表達沉默，而去甲基化則激活基因的表達［13］。近年研究表明，DNA甲基化也可以影響miRNA的表達，如Kong等［14］研究表明，DNA甲基化可以導(dǎo)致miR-375表達水平改變，其高甲基化會引起miR-375下調(diào)。Hashimoto等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌的組織和細胞中miRNA-181c基因出現(xiàn)高甲基化變化，其表達降低，且甲基化是發(fā)生在miRNA-181c基因的CpG島上，而用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷(AZC)處理胃癌細胞可以使microRNA-181c的表達上調(diào)，并抑制胃癌細胞的生長增殖。本實驗通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-125b啟動子區(qū)存在CpG島，表明miR-125b具有受甲基化調(diào)控的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);檢測Hcy干預(yù)下的VSMCs中miR-125b甲基化水平，發(fā)現(xiàn)其甲基化程度上調(diào);而我們用AZC干預(yù)后再次檢測miR-125b的表達，發(fā)現(xiàn)其表達上調(diào)，提示Hcy可能通過使miR-125b DNA高甲基化從而抑制其表達。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，Hcy可能通過上調(diào)miR-125b基因甲基化水平，進而下調(diào)miR-125b表達，從而促進VSMCs增殖。這一發(fā)現(xiàn)為進一步揭示Hcy致AS發(fā)生發(fā)展的機制提供了新思路，為AS的防治提供了新的治療靶點。

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Role of homocysteine to promote the vascular smooth muscle cell proliferation by MiR-125b methylation

LIU Xian-mei1，CAO Cheng-jian2，TIAN Jue1，ZHAO Li2，KONG Fan-qi1，ZHOU Long-xia1，CHEN Jiu-kai2，WANG Yan-hua2，YANG Xiao-ling1，JIA Yue-xia1，JIANG Yi-deng1
(1.Preclinical Medicine College; 2.Inspection College，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China)

Abstract:Aim To investigate the role of miR-125b and its DNA methylation in homocysteine(Hcy)-induced vascular smooth muscle cells(VSMCs)proliferation.Methods VSMCs were stimulated with 0，50，100，200，500 μmol·L－1Hcy respectively.Then qRT-PCR was used to detect the mRNA levels of miR-125b，and nested-touchdown methylation-specific PCR(ntMS-PCR)was used to detect the methylation levels of miR-125b.VSMCs were transfected with miR-125b precursor or the inhibitor of miR-125b，then 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)assay was used to reflect the proliferation of VSMCs.The distribution of CpG islands of miR-125b promoter region was analyzed by bioinformatics methods.VSMCs were stimulated with 100 μmol·L－1Hcy and transfected with or without DNA methylation inhibitors 5-nitrogen impurity cytidine(AZC)，then the expression of miR-125b was detected by qRT-PCR.Results The mRNA levels of miR-125b were decreased in 100，200，500 μmol·L－1Hcy group compared with 0 μmol·L－1Hcy group.The precursor of miR-125b could inhibit the proliferation activity and the inhibitor of miR-125b could increase the proliferation activity of VSMCs cells.Bioinformatics analysis indicated that MiR-125b promoter region had a CpG island whose length was 792 bp(1881-2672).The miR-125b promoter region methylation levels increased after Hcy intervention(P＜0. 01).The expression level of miR-125b increased after AZC intervention(P＜0. 05).

Conclusions①Hcy promotes vascular smooth muscle cell proliferation maybe by down-regulating the expression of miR-125b.②Hcy down-regulates the expression of miR-125 maybe by up-regulating the methylation levels of miR-125b promoter region.

Key words:homocysteine; miR-125b; DNA methylation; vascular smooth muscle cell; atherosclerosis; proliferation

作者簡介:劉現(xiàn)梅(1986－)，女，碩士生，研究方向:動脈粥樣硬化病理生理學(xué)，E-mail: meiziliu1413@163.com;

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81360027，81360052，81360053)

收稿日期:2015－01－05，修回日期:2015－03－02

文獻標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－1023－05

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.027