Gab2通過PI3K/Akt/ARK5/MMP途徑影響乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移

田紅艷，陳萍萍，李　笑，李洪利，任甜甜，張寶剛，尹崇高，劉雨清(濰坊醫(yī)學(xué)院.病理學(xué)教研室、.生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、.醫(yī)學(xué)研究實驗中心、.護理學(xué)院，山東濰坊　605)

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Gab2通過PI3K/Akt/ARK5/MMP途徑影響乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移

田紅艷1，陳萍萍1，李笑2，李洪利3，任甜甜1，張寶剛1，尹崇高4，劉雨清1
(濰坊醫(yī)學(xué)院1.病理學(xué)教研室、2.生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、3.醫(yī)學(xué)研究實驗中心、4.護理學(xué)院，山東濰坊261053)

中國圖書分類號: R329.25; R341; R73-37; R737. 9

摘要:目的探討Gab2在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的分子機制，為臨床預(yù)防乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。方法采用免疫組織化學(xué)SP法檢測80例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織及癌旁相對正常組織(＞5 cm)中Gab2蛋白表達情況，并分析其表達與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，分析浸潤性導(dǎo)管癌中Gab2、MMP-2及MMP-9蛋白表達的相關(guān)性。采用Western blot檢測乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231中Gab2蛋白的表達情況。采用RNAi技術(shù)將小RNA干擾質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞系MDA-MB-231，應(yīng)用Western blot檢測轉(zhuǎn)染成功后各組細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達情況，應(yīng)用Transwell 體外侵襲實驗檢測各組細胞的侵襲性，用EGF刺激細胞后Western blot檢測Akt及ARK5的磷酸化情況。結(jié)果浸潤性導(dǎo)管癌組織中Gab2蛋白的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織(P＜0. 01)，浸潤性導(dǎo)管癌中Gab2蛋白的表達與ER、組織學(xué)分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0. 05)，且其表達與MMP-2及MMP-9蛋白的表達呈正相關(guān); MDA-MB-231細胞系中Gab2蛋白表達量高于MCF-7細胞系中表達量;轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒24 h后，與轉(zhuǎn)染空載細胞組相比，SiGab2/MDA-MB-231細胞組中Gab2蛋白的表達量明顯降低，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染成功。同時，SiGab2/MDA-MB-231細胞組穿過Transwell小室人工基膜數(shù)量明顯減少(P＜0. 05)，并伴有MMP-2、MMP-9蛋白表達降低(P＜0. 05)。用EGF刺激各組細胞，結(jié)果顯示:在SiGab2/MDAMB-231細胞組Akt及ARK5的磷酸化明顯受到抑制。結(jié)論

Gab2通過PI3K/Akt/ARK5信號通路影響MMP-2、MMP-9的表達從而促進乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。

關(guān)鍵詞:乳腺癌; Gab2; Akt; ARK5; MMP;侵襲;轉(zhuǎn)移

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.025.html

劉雨清(1962－)，女，碩士，教授，研究方向:腫瘤病理學(xué)，通訊作者，E-mail: yuqingliu89@ hotmail.com;

尹崇高(1979－)，男，碩士，副教授，研究方向:腫瘤病理學(xué)，通訊作者，E-mail: lihongli1213@ sina.com

腫瘤細胞從原發(fā)病灶脫落，浸潤周圍組織及發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤難以治愈的關(guān)鍵?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)能夠降解細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，從而促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。尤其是MMP-2、MMP-9已成為乳腺癌分期、預(yù)后的一個重要分子標(biāo)志［1－3］。

Gab2支架蛋白是Gabs家族的成員之一，由Gab2(11q14.1)基因編碼，研究發(fā)現(xiàn)，有10%～15%乳腺癌患者該段染色體存在擴增現(xiàn)象［4－5］。Gab2蛋白被認(rèn)為是腫瘤相關(guān)蛋白，在膠質(zhì)瘤［6］、卵巢癌［7］、白血?。?］中過表達。本課題組已發(fā)現(xiàn)Gab2-Akt-ARK5信號通路參與膠質(zhì)瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移［9］。而目前對于Gab2在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中分子機制的研究尚未見報道。因此，本實驗通過分析浸潤性導(dǎo)管癌組織中Gab2蛋白與MMP-2、MMP-9蛋白的相關(guān)性，沉默Gab2基因后檢測細胞的侵襲性及用EGF刺激后檢測Akt及ARK5的磷酸化情況，從而探討Gab2在乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及可能的分子機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病例資料收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2012 年10月～2013年11月80例病理確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織標(biāo)本及癌旁相對正常乳腺組織(距離腫瘤邊緣＞5 cm)作為研究對象，患者均為女性，手術(shù)前均未行放療和化療。年齡30～74歲(平均50 歲)，臨床資料完整。

1.1.2主要試劑兔抗Gab2單抗購自美國Santa Cruz公司;鼠抗MMP-2單抗、兔抗MMP-9單抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司; RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Hyclone公司; Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所; Transwell小室購自Corning公司; Matrigel購自BD公司。MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細胞系由濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實驗中心提供。

1.2方法

1.2.1免疫組化SP法每例組織切片4張，1張用PBS代替一抗作陰性對照，其余3張滴加Gab2、MMP-2、MMP-9工作液，其余按試劑盒說明書進行。結(jié)果判定［10］:根據(jù)陽性細胞占5個以上高倍鏡視野(400倍)同類細胞的百分比即陽性細胞率和染色強度來判定，陽性細胞率計分:陽性細胞數(shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分。細胞染色強度計分:細胞無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結(jié)果相加: 0～1分為陰性，2～7分為陽性。

1.2.2細胞培養(yǎng)MCF-7及MDA-MB-231細胞常規(guī)培養(yǎng)。分組:①SiGab2/MDA-231組:插入Gab2目的片段5'-GTGAGAACGATGAGAAATA-3'的小RNA干擾質(zhì)粒的MDA-MB-231細胞;②Scr/MDA-231組:插入對照小RNA干擾質(zhì)粒的MDA-MB-231細胞。

1.2.3 Western blot細胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，裂解提取細胞總蛋白，制備12% SDS-PAGE凝膠，各組加入等量蛋白后電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，滴加一抗Gab2、MMP-2、MMP-9孵育過夜，二抗孵育后化學(xué)發(fā)光劑顯影，曝光。

1.2.4 Transwell侵襲實驗按文獻［11］操作后將小室置高倍鏡(400×)下觀察，隨機計數(shù)5個高倍鏡視野下穿過人工基膜的細胞數(shù)，每個實驗重復(fù)3次，取平均數(shù)作為實驗結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用獨立樣本t檢驗。

2　結(jié)果

2.1 Gab2蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和癌旁正常乳腺組織中的表達Gab2蛋白在腫瘤細胞的細胞質(zhì)中呈棕黃色陽性反應(yīng)，在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中陽性表達率為56. 25%(45/80)，在癌旁正常組織中陽性表達率為32. 50%(26/80)(Fig 1A、D)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P =0. 002)。并且Gab2的表達與ER、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分期有關(guān)(P＜0. 05，Tab 1)。

2.2浸潤性導(dǎo)管癌中Gab2與MMP-2、MMP-9蛋白表達的相關(guān)性MMP-2、MMP-9陽性染色部位在細胞質(zhì)，細胞膜中，呈棕黃色，在浸潤性導(dǎo)管癌中Gab2蛋白表達增多的組織中MMP-2、MMP-9蛋白表達也增多，在Gab2蛋白表達減少的組織中，MMP-2、MMP-9蛋白表達也減少，兩者的表達呈正相關(guān)(Fig 1B、C、E、F)(Tab 2)。

Tab 1　Relationship between Gab2 expression and clinical parameters of breast cancer patients

Fig 1　Expression of Gab2，MMP-2 and MMP-9 in breast tissue by immunohistochemical staining(×400)

A: Negative expression of Gab2 in normal breast tissue; B: Positive expression of MMP-2 in normal breast tissue; C: Positive expression of MMP-9 in normal breast tissue; D: Positive expression of Gab2 in invasive ductal carcinoma tissue; E: Positive expression of MMP-2 in invasive ductal carcinoma tissue; F: Positive expression of MMP-9 in invasive ductal carcinoma tissue

Tab 2　Correlativity of Gab2 with MMP-2 and MMP-9 in invasive ductal carcinoma tissue

2.3乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231中Gab2蛋白的表達Gab2蛋白在侵襲性強的MDAMB-231細胞中表達量高于侵襲性弱的MCF-7細胞中的表達量(Fig 2)。

Fig 2　Expression of Gab2 in MDA-MB-231 cells and MCF-7 cells(Values represent gray value)

2.4轉(zhuǎn)染后各組細胞中Gab2、MMP-2及MMP-9蛋白的表達Gab2在SiGab2/MDA-MB-231細胞組中表達明顯低Scr/MDA-MB-231細胞組中表達，表明轉(zhuǎn)染成功;同時在SiGab2/MDA-MB-231細胞組中MMP-2、MMP-9蛋白表達下降;差異有顯著性(Fig 3)。

Fig 3　Expression of Gab2，MMP-2 and MMP-9 in transfected cells by Western blot(Values represent gray value)

2.5 Gab2對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲性的影響轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后應(yīng)用Transwell檢測結(jié)果顯示: SiGab2/MDA-MB-231組穿過人工基膜的細胞數(shù)比Scr/MDA-MB-231組明顯減少(Fig 4)，差異有顯著性(P＜0. 05)。

Fig 4　Invasion ability of each group transfected MDA-MB-231 cells(Giemsa×200)A: Scr/MDA-MB-231 cells; B: SiGab2/MDA-MB-231 cells; C: The number of invasive cells in SiGab2/MDA-MB-231 decreased compared with Scr/MDA-MB-231.*P＜0. 05 vs Scr/MDA-MB-231

2.6 Gab2蛋白表達降低后Akt/ARK5的磷酸化情況為研究Gab2在乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移中的信號通路，本實驗采用10 μg·L－1EGF無血清培養(yǎng)基分別刺激各組細胞5、10 min，結(jié)果顯示，EGF刺激后，Scr/MDA-MB-231細胞組Akt、ARK5的磷酸化增強;而SiGab2/MDA-MB-231細胞組中Akt、ARK5磷酸化明顯受到抑制(Fig 5)。

Fig 5　Difference of phosphorylation of ARK5 and Akt induced by EGF in transfected MDA-MB-231 cells(Values represent gray value)

3　討論

乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的常見腫瘤，其發(fā)病率逐年升高，腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因，研究其發(fā)病機制，對于設(shè)計靶向阻斷藥物極為重要。

多項研究表明，Gab2是腫瘤相關(guān)蛋白，它的異?；罨捅磉_促進腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移。Matsumura等［12］發(fā)現(xiàn)，Gab2在結(jié)腸癌組織中高表達，Gab2表達高的患者生存期明顯低于低表達者。已有研究發(fā)現(xiàn)ARK5與MMP-2、MMP-9協(xié)同表達促進乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移［13］。本實驗結(jié)果顯示，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中Gab2蛋白的表達明顯高于癌旁正常乳腺組織，并且其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER表達及組織學(xué)分期明顯相關(guān)，與鄭雄偉等［10］研究結(jié)果一致。同時檢測到Gab2蛋白表達高的組織中伴有MMP-2、MMP-9蛋白表達增高，Gab2蛋白與MMP-2、MMP-9蛋白表達呈正相關(guān)。結(jié)果提示Gab2蛋白表達與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。

體外研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞中Gab2蛋白表達高低與腫瘤細胞侵襲相關(guān)。Bocanegra等［14］將內(nèi)源性Gab2基因沉默后，乳腺癌細胞系(SUM52，SUM44PE和MDA-MB-468)細胞周期分裂減緩，增殖及侵襲減弱，凋亡加快。Daly等［15］發(fā)現(xiàn)Gab2蛋白在乳腺癌細胞系(MCF-7、MDA-MB-361和MDAMB -453)中表達高于正常乳腺上皮細胞中表達。本實驗Western blot檢測結(jié)果顯示，侵襲性強的MDA-MB-231細胞中Gab2蛋白表達高于侵襲性低的MCF-7細胞中表達。當(dāng)采用小RNA干擾技術(shù)沉默乳腺癌MDA-MB-231細胞中的內(nèi)源性Gab2基因后，Western blot檢測SiGab2/MDA-MB-231細胞組Gab2蛋白表達降低，同時伴有MMP-2、MMP-9蛋白表達也降低; Transwell檢測結(jié)果顯示，SiGab2/MDA-MB-231細胞組穿過人工基質(zhì)膜的細胞數(shù)明顯低于Scr/MDA-MB-231細胞組。以上結(jié)果提示，Gab2蛋白表達通過影響MMP-2、MMP-9蛋白的表達參與乳腺癌細胞的侵襲。

Gab2結(jié)構(gòu)中含多個酪氨酸殘基，可被酪氨酸磷酸化活化，之后招募下游多種蛋白分子，其中活化的Gab2可與PI3K的p85亞基結(jié)合，進而活化Akt等下游信號傳導(dǎo)通路，參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。Daly等［16］用HRGb1刺激乳腺癌MCF-7細胞后，發(fā)現(xiàn)酪氨酸磷酸化的Gab2明顯增加，促進細胞的增殖。本實驗在沉默乳腺癌MDA-MB-231細胞中的Gab2后，用EGF刺激各組細胞5 min，Western blot檢測結(jié)果顯示，SiGab2/MDA-MB-231細胞組中Akt/ARK5的磷酸化明顯受抑制。結(jié)果提示Gab2參與PI3K/Akt/ARK5信號傳導(dǎo)通路。

綜上所述，本實驗證實Gab2在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中高表達，Gab2參與PI3K/Akt/ARK5信號傳導(dǎo)通路，進而影響MMP-2、MMP-9蛋白的表達促進乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，降低Gab2蛋白表達將有望成為控制乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的靶點。

參考文獻:

［1］Stankovic S，Konjevic G，Gopcevic K，et al.Activity of MMP-2 and MMP-9 in sera of breast cancer patients［J］.Pathol Res Pract，2010，206(4):241－7.

［2］McCawley L J，Matrisian L M.Matrix metalloproteinases: multifunctional contributors to tumor progression［J］.Mol Med Today，2000，6(4):149－56.

［3］Foda H D，Zucker S.Matrix metalloproteinases in cancer invasion，metastasis and angiogenesis［J］.Drug Discov Today，2001，6(9):478－82.

［4］Ormandy C J，Musgrove E A，Hui R，et al.Cyclin D1，EMS1 and 11q13 amplification in breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2003，78(3):323－35.

［5］Bekri S，Adelaide J，Merscher S，et al.Detailed map of a region commonly amplified at 11q13－＞q14 in human breast carcinoma ［J］.Cytogenet Cell Genet，1997，79(1－2):125－31.

［6］Shi L，Sun X，Zhang J，et al.Gab2 expression in glioma and its implications for tumor invasion［J］.Acta Oncol，2013，52(8): 1739－50.

［7］Brown L A，Kalloger S E，Miller M A，et al.Amplification of 11q13 in ovarian carcinoma［J］.Genes Chromosomes Cancer，2008，47(6):481－9.

［8］Zatkova A，Schoch C，Speleman F，et al.GAB2 is a novel targetof 11q amplification in AML/MDS［J］.Genes Chromosomes Cancer，2006，45(9):798－807.

［9］孫磊，劉雨清，李小龍，等.Gab2-Akt-ARK5通路在膠質(zhì)瘤侵襲中的研究［J］.中國腫瘤臨床，2014，41(9):551－4.

［9］Sun L，Liu Y Q，Li X L，et al.Gab2-Akt-ARK5 signaling pathway is associated with theinvasion of glioma cells［J］.Chin J Clin Oncol，2014，41(9):551－4.

［10］鄭雄偉，力超，劉健，等.Gab2在乳腺癌中的表達及其意義［J］.腫瘤學(xué)雜志，2010，16(9):715－7.

［10］Zheng X W，Li C，Liu J，et al.Expression of Gab2 in breast cancer and its significance［J］.J Oncol，2010，16(9):715－7.

［11］蘇堅，周鈺娟，廖前進，等.沉默LIMK1促進DADS抑制

SW480細胞遷移與侵襲［J］.中國藥理學(xué)通報，2013，29(6): 760－6.

［11］Su J，Zhou Y J，Liao Q J，et al.Promotion of silence LIMK1 on diallyl disulfide inhibiting the migrationand invasion of human colon cancer SW480 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29(6): 760－6.

［12］Matsumura T，Sugimachi K，Takahashi Y，et al.Clinical significance of GAB2，a Scaffolding/Docking protein acting downstream of EGFR in human colorectal cancer［J］.Ann Surg Oncol，2014，21(Suppl 4): S743－9.

［13］姬靜，張寶剛，張偉棟，等.ARK5與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究［J］.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2012，28(4):382－5.

［13］Ji J，Zhang B G，Zhang W D，et al.ARK5 is associated with the invasive and metastatic of breast carcinoma［J］.Chin J Clin Exp Pathol，2012，28(4):382－5.

［14］Bocanegra M，Bergamaschi A，Kim Y H，et al.Focal amplification and oncogene dependency of GAB2 in breast cancer［J］.Oncogene，2010，29(5):774－9.

［15］Daly R J，Binder M D，Sutherland R L.Overexpression of the Grb2 gene in human breast cancer cell lines［J］.Oncogene，1994，9(9):2723－7.

［16］Daly R J，Gu H，Parmar J，et al.The docking protein Gab2 is overexpressed and estrogen regulated in human breast cancer［J］.Oncogene，2002，21(33):5175－81.

Gab2 effects the invasion and metastasis of breast carcinoma through PI3K/Akt/ARK5/MMP signal pathway

TIAN Hong-yan1，CHEN Ping-ping1，LI Xiao2，LI Hong-li3，REN Tian-tian1，ZHANG Bao-gang1，YIN Chong-gao4，LIU Yu-qing1
(1.Dept of Pathology，2.College of Biological Science and Technology，3.Medicine Research Center，4.College of Nursing，Weifang Medical University，Weifang Shangdong 261053，China)

Abstract:Aim To investigate the molecular mechanism of Gab2 in the invasion and metastasis of breast cancer and provide a theoretical basis for clinical prevention of breast cancer invasion and metastasis.

Methods The Gab2，MMP-2 and MMP-9 expressions in 80 cases of breast cancer were detected by immunohistochemistry.Western blot was used to detect the expression of Gab2 protein in MDA-MB-231 cells and MCF-7 cells.The siRNA plasmid was used to transfect MDA-MB-231 cells.Western blot was used to detect the proteins expression of Gab2，MMP-2 and MMP-9.Transwell in vitro experiment was used to detect the invasion ability of each group transfected MDA-MB-231 cells，Western blot was used to analyze phosphorylation of Akt and ARK5 induced by epithelial growth factor(EGF)in transfected cells(SiGab2/MDA-MB-231 and Scr/MDA-MB-231).Results The expression of Gab2 protein in invasive ductal carcinoma was significantly higher than in normal breast tissue(P＜0. 01).The expression of Gab2 was dramatically correlated with lymph node metastasis，ER expression，tumor histological grade，MMP-2 and MMP-9(P＜0. 05).The expression of Gab2 protein in MDA-MB-231 cells was higher than in MCF-7 cells.The expression of Gab2，MMP-2 and MMP-9 decreased in SiGab2/MDA-MB-231 cells and the invasion ability of SiGab2/MDA-MB-231 cells was significantly decreased(P＜0. 05)，and after 5 minutes’stimulating by EGF，the phosphorylation of Akt and ARK5 was significantly reduced.Conclusion Gab2 can promote the invasion and metastasis of breast cancer by effecting the expression of MMP-2 and MMP-9 through PI3K/Akt/ARK5 signal pathway.

Key words:breast carcinoma; Gab2; Akt; ARK5; MMP; invasion; metastasis

作者簡介:田紅艷(1989－)，女，碩士，研究方向:腫瘤病理學(xué)，E-mail: tianhongyan0413@163.com;

基金項目:國家自然科學(xué)基金青年基金項目(No 81402389);山東省自然科學(xué)基金(No ZR2014HL077);山東省高等學(xué)?？萍加媱?No J12LK03，J13LK03);國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(No 201410438003);濰坊市科技計劃項目(No 201302089);濰坊醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新基金(No KX2014033)

收稿日期:2015－03－12，修回日期:2015－04－02

文獻標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－1014－05

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.025