神經(jīng)肽Urocortin2對嗎啡成癮大鼠VTA神經(jīng)元放電及DA能神經(jīng)傳遞的影響

姚紅月，宋斐然，劉春娜，李鳳華，劉新宇(.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州　000，.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州　000，.中國醫(yī)科大學(xué)，遼寧沈陽　000)

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神經(jīng)肽Urocortin2對嗎啡成癮大鼠VTA神經(jīng)元放電及DA能神經(jīng)傳遞的影響

姚紅月1，2，宋斐然3，劉春娜1，李鳳華2，劉新宇2
(1.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州121000，2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000，3.中國醫(yī)科大學(xué)，遼寧沈陽110001)

中國圖書分類號: R-332; R322.81; R338.1; R749. 61; R971. 2; R977. 6

摘要:目的明確神經(jīng)肽urocortin2(UCN2)在嗎啡成癮中抑制丘腦腹側(cè)背蓋區(qū)(ventral tegmental area，VTA)神經(jīng)活動的機(jī)制。方法建立嗎啡成癮大鼠模型，采用七管微電泳方法，電泳UCN2對嗎啡成癮大鼠VTA神經(jīng)元自發(fā)放電的改變，及UCN2對多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元簇發(fā)放電模式的影響，明確UCN2在VTA神經(jīng)元中與DA存在匯聚作用。另外，給予促皮質(zhì)激素釋放因子(coticortropin-releasing factor，CRF)受體阻斷劑及蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)抑制劑，明確UCN抑制嗎啡成癮中發(fā)揮關(guān)鍵作用。結(jié)果UCN2使82%(31/38)嗎啡成癮大鼠VTA神經(jīng)元放電頻率減慢，平均放電頻率由微電泳前的(20. 89±2. 86)Hz減少到(13. 66±3. 93)Hz，給藥前后放電頻率降低具有顯著性(P＜0. 01)，UCN2抑制作用可被PKA抑制劑H89及CRF-2R阻斷劑AST-2B取消。另外，微電泳UCN2可抑制嗎啡成

癮大鼠VTA中DA神經(jīng)元的爆發(fā)放電，AST-2B可增強(qiáng)DA的興奮效應(yīng)。結(jié)論UCN2與CRF-2R結(jié)合后，通過PKA信號途徑，抑制VTA內(nèi)DA神經(jīng)元異常放電，在嗎啡類藥物成癮中發(fā)揮抑制作用，為其用于臨床治療阿片類藥物成癮提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞:嗎啡成癮;優(yōu)洛可啶;丘腦腹側(cè)背蓋區(qū);多巴胺;神經(jīng)元;微電泳;蛋白激酶A網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.018.html

劉新宇(1977－)，男，博士，副教授，研究方向:神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)，通訊作者，Tel: 0416-4673465，E-mail: springnanaliu @163.com

嗎啡等阿片類藥物反復(fù)應(yīng)用可造成耐受、依賴和成癮，中斷給藥出現(xiàn)戒斷綜合征、強(qiáng)迫覓藥行為及戒斷后焦慮等精神神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。在阿片類藥物的成癮過程中，中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area，VTA)起到重要的作用［1］。VTA靠近黑質(zhì)與紅核，含有大量DA能神經(jīng)元。針對嗎啡強(qiáng)化和依賴效應(yīng)主要通過VTA的DA系統(tǒng)介導(dǎo)，VTA神經(jīng)元的異常興奮是嗎啡成癮的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但目前機(jī)制尚不清楚［2］。神經(jīng)內(nèi)分泌活性肽UCN是近年來發(fā)現(xiàn)的促皮質(zhì)激素釋放因子(coticortropin-releasing factor，CRF)肽類家族的一個新成員［3］。UCN具有與CRF相似的生物活性，通過下丘腦－腺垂體－腎上腺軸，促進(jìn)腺垂體分泌腎上腺皮質(zhì)激素，調(diào)節(jié)應(yīng)激、應(yīng)急反應(yīng)、抗焦慮、鎮(zhèn)靜等作用。UCN作為一種新型的小分子神經(jīng)活性肽，通過自分泌和(或)旁分泌途徑，其作用是廣泛的，相應(yīng)作用機(jī)制也是多方面的［4］。有少量報道表明，UCN參與酒精成癮及戒斷后焦慮和覓藥等行為的應(yīng)激性反應(yīng)［5］。但UCN對嗎啡成癮VTA神經(jīng)元電活動及DA系統(tǒng)的影響未見報道，且機(jī)制也不明確。因此，本實驗采用七管玻璃微電極細(xì)胞外記錄方法，微電泳UCN2及CRF2受體抑制劑AST對VTA神經(jīng)元放電情況的影響，同時也觀察了UCN2對VTA中DA能神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的影響，以探討VTA內(nèi)存在的復(fù)雜的神經(jīng)纖維聯(lián)系及各種神經(jīng)遞質(zhì)之間的相互作用，從而為VTA神經(jīng)元放電異常及發(fā)作性疾病的診治提供電生理學(xué)方面的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物♂Sprague-Dawley(SD)大鼠，50只，體質(zhì)量180～220 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物合格證號: SCXK(遼)2003－0007。隨機(jī)分為嗎啡成癮模型組40只和對照組10只。模型組采用劑量序貫遞增法腹腔注射鹽酸嗎啡(Tab 1)建立大鼠嗎啡成癮模型，對照組在相同條件下給予生理鹽水，12 d后采用納洛酮(5 mg·kg－1)誘導(dǎo)嗎啡成癮戒斷模型［6］。

Tab 1　Morphine dosage of administration

1.2七管玻璃微電極的拉制細(xì)胞外記錄及微電泳采用51－217型微管拉制儀(美國STOELTING公司)所拉制的7管玻璃微電極。中心管尖端直徑在4～8 μm，電阻為5～12 MΩ，管內(nèi)灌注含1%滂胺天藍(lán)的NaCl溶液(3. 0 mol·L－1)作為神經(jīng)元放電活動的引導(dǎo)電極;外周管電阻為20－100MΩ，外周管內(nèi)灌注下列藥物，包括: UCN2(10－6mol·L－1); astressin2B-AST-2B(CRF-2受體阻斷劑，10－6mol· L－1); DA及其非選擇性阻斷劑α-flupenthixol(FLU，10－5mol·L－1)，蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)及抑制劑(H-89，10－5mol·L－1)。

1.3實驗方法上述實驗動物用20%烏拉坦(1 g ·kg－1)麻醉后，于腦立體定位儀上行常規(guī)開顱。根據(jù)Paxions Watson大鼠腦圖譜，確定VTA核團(tuán)位置，坐標(biāo)為前囟后5. 20～6. 80 mm，中線旁開0. 20～0. 80 mm，腦表下7. 0～8. 0 mm。應(yīng)用微電極推進(jìn)器將七管微電極緩慢插入VTA，神經(jīng)元單位放電經(jīng)DAM80微電極放大器采集及濾波后顯示于示波器上，再經(jīng)Spike2生物信號采集系統(tǒng)(英國CED公司)輸入計算機(jī)并處理，生成序列密度直方圖。觀察嗎啡成癮大鼠VTA神經(jīng)元放電情況，之后觀察UCN2及AST-2B對VTA神經(jīng)元放電影響。另外，微電泳DA及其阻斷劑期間，給予UCN2對VTA神經(jīng)元多巴胺能神經(jīng)傳遞的影響;微電泳PKA及抑制劑H-89，進(jìn)一步觀察UCN2對嗎啡成癮大鼠VTA神經(jīng)元影響是否通過PKA發(fā)揮作用。為排除可能發(fā)生的電流影響，只要注入生理鹽水引起的任何放電改變，則該資料不列入統(tǒng)計之內(nèi)。

1.4數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計記錄微電泳藥物前、后VTA神經(jīng)元放電頻率改變，微電泳藥物后放電頻率變化/% =(微電泳藥物期間放電頻率－微電泳前20s放電頻率)/微電泳前20s放電頻率×100%，電泳藥物后放電變化超過±30%為有效臨界值。

采用SPSS 13. 0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)以用±s表示。組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

2　結(jié)果

實驗中，共計觀察了52個嗎啡成癮大鼠VTA神經(jīng)元的自發(fā)放電活動，其自發(fā)放電頻率快而且不規(guī)則，VTA神經(jīng)元放電頻率在10～25Hz之間，多為單個爆發(fā)式放電。

2.1微電泳UCN2及AST對VTA神經(jīng)元自發(fā)放電的影響本結(jié)果中，共觀察了38個嗎啡成癮大鼠的VTA神經(jīng)元。微電泳UCN2(10－6mol·L－1，20nA，20s)使82%(31/38)神經(jīng)元自發(fā)放電頻率減慢，對7個神經(jīng)元無作用。38個受試VTA神經(jīng)元的平均放電頻率由微電泳前的(20. 89±2. 86)Hz減少到(13. 66±3. 93)Hz，給藥前后放電頻率降低具有顯著性(P＜0. 01)。實驗中發(fā)現(xiàn)，UCN2的抑制作用較明顯，幾乎沒有潛伏期，但存在后作用。此外，在22個VTA神經(jīng)元中單獨微電泳AST(10－6mol· L－1，20nA，20s)，可使73%(16/22)VTA神經(jīng)元自發(fā)放電頻率升高。受試VTA神經(jīng)元放電頻率由微電泳前的(21. 64±2. 82)Hz升高到(24. 25±2. 30)Hz(P＜0. 01)，在微電泳UCN2造成抑制效應(yīng)的20個神經(jīng)元中，微電泳UCN2(20nA，40s)期間給予AST(20nA，20s)可拮抗UCN2的抑制效應(yīng)，使80%(16/20)對UCN2產(chǎn)生抑制效應(yīng)的神經(jīng)元放電頻率明顯加快，放電頻率由微電泳AST前的(13. 35± 1. 89)Hz增加到(17. 80±2. 53)Hz，微電泳前后平均放電頻率改變具有顯著性(P＜0. 01)。AST的起效迅速，無潛伏期，可引起爆發(fā)式放電，并可見雙向動作電位增加(Fig 1A，1B)。

Fig 1　Effects of UCN2 on VTA neuronA: Effects of UCN2(10－6mol·L－1，20nA，20s)and AST-2B on VTA neuron.＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0. 01 vs UCN2 group，B: Effects of UCN2 on VTA neuron spontaneous firing rates.AST-2B was administrered during the period of UCN2.

2.2微電泳UCN2及AST對DA能神經(jīng)傳遞的影響微電泳DA可使嗎啡成癮大鼠VTA神經(jīng)元興奮性進(jìn)一步升高，而給予DA非選擇性阻斷劑可拮抗其興奮效應(yīng)。選取對DA產(chǎn)生興奮效應(yīng)的24個VTA神經(jīng)元進(jìn)行研究。在微電泳DA(20nA，40s)期間，在第20s微電泳UCN2(20nA，20s)，使受試神經(jīng)元中的79%(19/24)的放電頻率明顯降低。受試VTA中DA神經(jīng)元的放電頻率由微電泳UCN2前(25. 57±1. 64)Hz減少到(13. 42±1. 60)Hz，給藥前后放電頻率差異有顯著性(P＜0. 01)。微電泳DA的阻斷劑FLU可使DA神經(jīng)元放電頻率明顯降低，在微電泳期間給予UCN2(20nA，20s)，對受抑制的VTA神經(jīng)元中放電頻率無明顯影響，平均放電頻率由微電泳UCN2前的(13. 88±1. 80)Hz變化到(13. 46±1. 78)Hz，給UCN2前后差異無顯著性(P ＞0. 05)(Fig 2A，2B)。

2. 3 UCN2及AST對DA元中PKA的影響對DA產(chǎn)生興奮效應(yīng)的19個VTA神經(jīng)元進(jìn)行研究。在微電泳DA(20nA，80s)期間，在第20s微電泳H89(20 nA，40s)，使受試神經(jīng)元中的79%(15/19)的放電頻率由微電泳H89前(25. 50±1. 58)Hz減少到(16. 17±1. 47)Hz，給藥前后放電頻率差異有顯著性(P＜0. 05)。在微電泳H89的第20 s，再微電泳UCN2(20nA，20 s)，受試的VTA神經(jīng)元中的52%(10/19)放電頻率略降低，由(15. 80±2. 41)Hz改變?yōu)?15. 45±1. 28)Hz但給藥前后差異無顯著性(P＞0. 05)(Fig 3A，3B)。

3　討論

實驗中發(fā)現(xiàn)，嗎啡成癮大鼠VTA神經(jīng)元放電頻率明顯增加，呈爆發(fā)式放電，而神經(jīng)肽UCN2能使其神經(jīng)元放電頻率明顯減慢，提示UCN2對嗎啡成癮大鼠VTA神經(jīng)元的放電起抑制作用。研究表明［7］，阿片類藥物能直接或間接刺激VTA，產(chǎn)生神經(jīng)元異常高頻放電，VTA是愉悅系統(tǒng)或獎賞系統(tǒng)的重要部分，當(dāng)產(chǎn)生獎賞行為時，能夠刺激VTA神經(jīng)元興奮性放電，產(chǎn)生藥物依賴成癮，本實驗結(jié)果進(jìn)一步提示，UCN2可以通過抑制VTA神經(jīng)元異常高頻放電，對阿片類藥物成癮起到抑制及治療作用。

Fig 2　Effects of UCN2 on DA neuron

Fig 3　Effects of UCN2 on PKA pathwayA: Effects of UCN2(10－6mol·L－1，20nA，20s)and H89 on VTA's DA neuron.＊＊P＜0. 01 vs normal group;##P＜0.01 vs h89 group; B: Effects of UCN2 on VTA's dopaminergic neuron spontaneous firing rates via PKA pathway.

實驗中單獨微電泳選擇性CRF2R阻斷劑AST-2B可增加受試VTA神經(jīng)元的放電頻率。微電泳UCN2期間，其抑制作用可被AST-2B所拮抗，結(jié)果提示UCN2對嗎啡成癮大鼠VTA神經(jīng)元的抑制效應(yīng)可能是通過與CRF2R結(jié)合后而產(chǎn)生。UCN有3種形式: UCN1、UCN2、UCN3。CRF受體主要有CRF-1R、CRF-2R兩種，新近發(fā)現(xiàn)的非哺乳動物CRFR3受體，均為7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，CRFR1受體能高親和力地與CRF、UCN1肽結(jié)合。而UCN2、UCN3只對CRFR2受體有特異結(jié)合特征。UCN與CRF-R2結(jié)合后，具有抗氧化、抗衰老、抗焦慮、憂郁等多種生理作用及藥理功能［8－9］。有研究表明，Urocortin在腦損傷過程中具有神經(jīng)保護(hù)作用，特別是在藥物成癮、神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，但目前機(jī)制尚不十分明確［10］。因此，本實驗結(jié)果進(jìn)一步提示，UCN2在對嗎啡類藥物成癮中主要是通過與CRF-R2結(jié)合發(fā)揮抑制作用。

實驗結(jié)果表明，DA能投射纖維對VTA神經(jīng)元有興奮作用，UCN2可以拮抗DA的興奮效應(yīng)，且給予AST對DA興奮效應(yīng)具有一定協(xié)同作用，提示UCN2與VTA神經(jīng)元中CRF2受體結(jié)合后，拮抗DA在嗎啡成癮中的興奮毒性。有報道表明［11］，VTA中的DA神經(jīng)元異常興奮，誘發(fā)VTA神經(jīng)元過度爆發(fā)式放電，產(chǎn)生藥物依賴性。UCN2是CRF肽類家族的成員，有研究表明，UCN2可增加實驗鼠的迷宮探索能力，增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶能力，具有抗焦慮作用及很強(qiáng)的鎮(zhèn)靜效應(yīng)。UCN2與酒精成癮有密切關(guān)系，微量核團(tuán)注射UCN2能減少小鼠自我供給酒精的量，在酒精戒斷過程中發(fā)揮作用。嗎啡是通過阿片受體作用于VTA上的DA能神經(jīng)元，從而引起DA釋放增加，減弱或消除GABA能神經(jīng)元對DA神經(jīng)元的抑制作用，進(jìn)一步促進(jìn)DA釋放。因此，本實驗結(jié)果進(jìn)一步提示，UCN2能夠抑制VAT中DA神經(jīng)元活動的物質(zhì)將有望成為減輕嗎啡成癮的有效藥物。

UCN2與CRF-2R結(jié)合后是如何引起效應(yīng)的呢?其保護(hù)VTA神經(jīng)元作用的機(jī)制，很可能與阻斷了神經(jīng)遞質(zhì)DA的興奮毒性作用有關(guān)。有限的研究資料也表明: UCN與酒精成癮有密切關(guān)系，微量核團(tuán)注射UCN能減少小鼠自我供給酒精的量［10］;可卡因戒斷引起的長時程增強(qiáng)可被CRFR1和CRFR2受體拮抗劑阻斷［11］;在酒精戒斷過程中，大鼠杏仁核細(xì)胞外CRF明顯升高。上述結(jié)果均提示: UCN可能通過CRF-R2受體參與酒精成癮及戒斷后焦慮和覓藥等行為的應(yīng)激性反應(yīng)［12］。另外，VTA的DA能神經(jīng)元成簇放電導(dǎo)致其突觸末梢DA釋放量瞬時大量增加，已被公認(rèn)是編碼獎賞效應(yīng)的功能信號，但誘發(fā)DA能神經(jīng)元產(chǎn)生簇放電的神經(jīng)機(jī)制尚不完全清楚［7］。在本實驗中證實，微電泳PKA阻斷劑H89后，再給予UCN2，可使VTA中DA神經(jīng)元的放電頻率略降低，但給藥前后差異無顯著性，該結(jié)果提示，UCN2與CRF-2R結(jié)合后，進(jìn)而通過激活蛋白激酶A引起效應(yīng)。

本實驗結(jié)果表明，UCN2可以通過作用于CRF-2R能夠抑制VTA神經(jīng)元放電活動，降低神經(jīng)元的過度興奮性，并且降低DA能興奮毒性，提示在嗎啡成癮病理情況下，UCN2可以起到神經(jīng)元保護(hù)作用，研究結(jié)果為藥物成癮機(jī)制提供新的實驗依據(jù)，對臨床防治提供新的思路。

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Effects of neuroactive peptide urocortin 2 on VTA neuron's spontaneous discharge and DA-ergic neurotransmission in morphine addiction

YAO Hong-yue1，2，SONG Fei-ran3，LIU Chun-na1，LI Feng-hua2，LIU Xin-yu2
(1.Dept of Pharmacology，Liaoning Medical University; 2.The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou Liaoning 121000，China; 3.The China Medical University，Shenyang 110001，China)

Abstract:Aim To investigate the inhibitory effects of urocortin2(UCN2)on ventral tegmental area(VTA)nervous activity of morphine addiction rats and the mechanism.Methods Morphine addiction rats and the microiontophoresis method were used to observe the effects of UCN2 on VTA neuron' s spontaneous discharge changing rule，as well as the inhibitory effects of UCN2 on DA neuron' s cluster spontaneous discharge，to identify UCN2 and DA on the same VTA neuron.Morever，the inhibitor of corticotropin-regulating factor' s receptor(CRF-2R)and the blocker of protein kinase A(PKA)，AST-2B and H89，were used to investigate the effects of UCN2 on VTA neuron' s of morphine addiction rats.Results UCN2 could inhibit the firing rate 82%(31/38)of the tested VTA neuron(P＜0. 01)，the discharge frequency changed from(20. 89±2. 86)Hz to(13. 66±3. 93)Hz(P＜0. 01).Further，the inhibitor of PKA，AST-2B and H89 could ablolish the inhibitory effects of UCN2.Morever，the excitatory firing of VTA neurons was attenuated by addition of UCN2，while AST application could inhibit the UCN2's inhibitory effects.Conclusion UCN2 could regulate the effects of VTA via PKA pathway and may thereby contribute to the improvement of drug addiction.

Key words:morphine addiction; urocortin; ventral tegmental area; dopamine; neuron; microelectrophoresis; protein kinase A

作者簡介:姚紅月(1979－)，女，碩士生，研究方向:神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail:43948255@ qq.com;

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81201037)

收稿日期:2015－02－28，修回日期:2015－03－17

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－0979－05

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.018