硫化氫對肥胖小鼠肝脂質蓄積的影響

鄭乃汭，張優(yōu)敬，吳東棟，劉　彬，吉愛玲，李彥章，皇甫超申(.河南大學護理學院，河南開封　475000;.河南大學醫(yī)學院環(huán)境醫(yī)學研究所，河南開封　475004)

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硫化氫對肥胖小鼠肝脂質蓄積的影響

鄭乃汭1，2，張優(yōu)敬2，吳東棟2，劉彬1，吉愛玲2，李彥章2，皇甫超申2
(1.河南大學護理學院，河南開封475000;2.河南大學醫(yī)學院環(huán)境醫(yī)學研究所，河南開封475004)

中國圖書分類號: R-332; R322.47; R344; R575. 5; R589. 2; R916. 4; R977. 3

摘要:目的探討硫化氫對肥胖小鼠肝臟脂質蓄積的影響。方法C57BL/6J小鼠，隨機分為對照組、模型組、硫化氫干預組。對照組喂普通飼料，模型組和硫化氫干預組喂高脂飼料。從第13周開始，硫化氫干預組注射硫氫化鈉，劑量為50 μmol·kg－1·d－1，模型組注射等量生理鹽水，16周末處死動物。肝臟組織勻漿，取上清，做生化檢測，測量各組小鼠肝組織中甘油三酯、膽固醇含量;肝臟石蠟切片做H＆E染色觀察肝組織一般形態(tài);冷凍切片，油紅染色觀察肝組織脂質蓄積情況;肝臟新鮮冰凍組織提取RNA，PCR檢測小鼠肝臟中CPT-1、FAS的基因表達情況，并用ELISA法檢測CPT-1、FAS的活性。結果模型組、硫化氫干預組小鼠體重明顯高于對照組。與模型組相比，硫化氫干預組小鼠體重減輕;肝組織內甘油三酯、膽固醇含量明顯下降;肝組織病理變化程度減輕，脂質蓄積減少;肝臟CPT-1表達及活性增高，FAS表達及活性降低。結論硫化氫可以降低肥胖小鼠肝組織脂肪含量，減輕肝脂肪變性程度，其機制可能與肝組織CPT-1表達增加、FAS表達下降有關。

關鍵詞:硫化氫;肥胖;脂肪肝;脂肪酸合成酶;肉毒堿棕櫚?；D移酶-1;小鼠

網絡出版時間:2015－6－5 11:22網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.012.html

皇甫超申(1964－)，男，碩士，教授，研究方向:環(huán)境醫(yī)學，Tel:0378-3880585，E-mail: chaoshen6403@ henu.edu.cn.

隨著人們生活水平的提高，生活方式的改變，肥胖患病率呈逐年上升趨勢。肥胖的發(fā)生原因主要是不合理的膳食結構，特別是高脂飲食造成的。約50%的肥胖癥患者合并有非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)，由此引發(fā)非酒精性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化甚至肝癌。有研究表明，肥胖程度與非酒精性脂肪肝、非酒精性肝炎的病變程度明顯相關［1］。高脂飲食造成高脂血癥，進而脂質在肝細胞內異常蓄積，導致肝細胞脂肪變性是肝細胞遭受高血脂的第一次打擊。發(fā)生脂肪變性的肝細胞功能下降，對氧化應激、炎癥因子損傷的敏感性增強，當高脂血癥時，體內氧自由基和過氧化脂質水平增加，抗氧化能力下降，極易造成高血脂對肝細胞的二次打擊，從而導致非酒精性肝炎的發(fā)生和病變的進展。

有研究證實，高脂血癥患者血漿內硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)含量下降［2］。高脂飼養(yǎng)的小鼠血漿或肝組織內硫化氫含量也降低［3］。硫化氫是一種氣體信號分子，發(fā)揮穩(wěn)定血壓、舒張血管、調節(jié)胃腸道功能、調節(jié)神經興奮和腎臟保護作用。過去，硫化氫一直被認為是一種無色、具有臭雞蛋氣味的有毒氣體，過量吸入會對身體很多器官造成嚴重的損害，直到20世紀90年代，Abe、Kimura發(fā)現硫化氫作為一種神經活性物質而存在，因此硫化氫被認為是繼NO、CO之后的第3種氣體信號分子［4］。在哺乳動物體內，硫化氫以半胱氨酸為底物，在5’磷酸－吡哆醛依賴性酶的胱硫醚-β-合酶(cystathionine-β-synthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)，以及非5’-磷酸－吡哆醛依賴性酶3-巰基丙酮酸硫基轉移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)的催化下產生［5］。肝臟是體內生成H2S的主要部位，H2S可以調節(jié)正常大鼠及肝硬化大鼠的肝內微循環(huán)，改善肝硬化［6］。內源性硫化氫和硫化氫供體在生理?及病理生理條件下都有潛在的維持正常脂代謝的作用［7］。外源性給予硫化氫，是否有阻止或減輕肝細胞脂質蓄積，減輕或逆轉肝細胞損傷的作用，目前尚未見文獻報道。因此，本課題運用高脂飲食誘導小鼠肥胖，制作非酒精性脂肪肝模型，體外補充硫化氫，觀察其是否會減輕肥胖小鼠肝脂質蓄積。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器

1.1.1主要試劑飼料購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司，飼料能量來源見Tab 1;硫氫化鈉(NaHS)購自美國Sigma-aldrich公司;無水乙醇、異丙醇等均購自天津市德恩化學試劑有限公司;油紅O購自生工生物工程(上海)股份有限公司; RNA提取試劑盒、RNA純化試劑盒、逆轉錄試劑盒均購自康為世紀生物科技有限公司;甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)和脂肪酸分解酶肉毒堿棕櫚?；D移酶-1(carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1)的引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成(Tab 2); ELISA試劑盒購自鄭州天馳生物試劑公司。

Tab 1　Energy comparison of different diets

Tab 2　Sequences of primers used in study

1.1.2主要儀器Eppendorf高速臺式冷凍離心機; Multiskan MK3型酶標儀(賽默飛世爾儀器有限公司);梯度PCR儀(Thermo公司，美國); BX51熒光顯微鏡(日本Olympus公司);超低溫保存箱(Haier); WD-9413B凝膠成像分析儀、DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組和處理C57 BL/6J 6周齡健康♂小鼠30只，購自南京大學模式動物研究所，動物合格證號: 201401337，檢疫合格，體質量: 18～22 g。室溫控制在(20－25)℃，相對濕度60%－70%，定期更換墊料并進行消毒處理。隨機選取8只小鼠飼喂普通飼料作為對照組，22只小鼠飼喂高脂飼料制作肥胖模型，至第12周末，根據文獻，將體重超過對照組20%的小鼠作為肥胖小鼠［8］，共有21只。將21只肥胖小鼠隨機分模型組(10只)、硫化氫干預組(11只)。硫化氫干預組從第13周開始，每天早上9點腹腔注射硫氫化鈉(50 μmol·kg－1·d－1，相當于2. 8 mg·kg－1·d－1)，模型組注射等體積的生理鹽水。對照組繼續(xù)喂普通飼料，模型組和硫化氫干預組繼續(xù)喂高脂飼料，飲用水選用自來水，自由進食。每周一下午測量并記錄小鼠體重。所有動物在第16周末處死，取肝組織進行生化和病理形態(tài)學等檢測。

1.2.2肝組織生化指標的檢測取新鮮冰凍肝臟組織，勻漿、離心，取上清，按試劑盒說明書，用酶標儀測甘油三酯、膽固醇含量。

1.2.3肝臟病理組織學檢測取每只小鼠相同部位的一小塊肝組織，用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，蘇木素－伊紅(HE)染色，光鏡下觀察形態(tài)。另取每只小鼠相同部位的一小塊肝組織，做冰凍切片，切片厚度為6 μm，油紅O染色，光鏡下觀察肝組織脂肪蓄積情況。

1.2.4 RT-PCR分析TRIzol試劑提取肝臟組織總RNA，Nanodrop檢測RNA含量，Dnase處理，并用RNA試劑盒進行純化。應用逆轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成，按說明書操作，總體積為20 μL。CPT-1的PCR擴增條件為: 95℃預變性2 min，循環(huán)40次(94℃變性35 s，59. 8℃退火35 s，72℃延伸35 s)，72℃終延伸10 min。FAS的PCR擴增條件為: 95℃預變性2 min，循環(huán)40次(94℃變性35 s，54℃退火35 s，72℃延伸40 s)，72℃終延伸10 min。18S rRNA的PCR擴增條件為: 95℃預變性1 min，循環(huán)30次(94℃變性35 s，51. 9℃退火35 s，72℃延伸40 s)，72℃終延伸10 min。

1.2.5酶活性檢測按ELISA試劑盒說明書，酶標儀檢測小鼠肝組織CPT-1、FAS活性。

2　結果

2.1一般情況觀察所有動物在實驗過程中，每天計量小鼠進食和飲水量，觀察小鼠活動情況。結果發(fā)現，各組小鼠進食量和飲水量以及活動情況無明顯差別。對照組小鼠毛色正常，精神佳，與對照組相比，模型組和硫化氫干預組小鼠體型肥胖，毛色發(fā)亮。

2.2小鼠體重變化Fig 1A所示，從第5周開始，高脂組體重明顯比普通飼料組增高(P＜0. 05)，到第12周末，體重平均比普通飼料組高(10. 0±1. 1)g。Fig 1B所示，從第13周末開始，與對照組相比，模型組和硫化氫干預組小鼠體重明顯增高(P＜0. 01)，硫化氫干預組與模型組相比，體重明顯下降(P＜0. 01)。

2.3硫化氫干預對小鼠肝組織甘油三酯、膽固醇含量的影響Fig 2A所示，與對照組相比，模型組小鼠甘油三酯含量增高(P＜0. 01)。與模型組相比，硫化氫干預組甘油三酯含量明顯下降(P＜0. 01)。Fig 2B所示，與對照組相比，模型組肝組織膽固醇含量明顯升高(P＜0. 05)。與模型組相比，硫化氫干預組肝組織膽固醇含量明顯下降(P＜0. 05)。

Fig 1　Effects of NaHS on body weight gain in mice(±s)

Male C57BL/6J mice(5 weeks old)were fed a normal-fat diet(NFD)or a high-fat diet(HFD)for 16 weeks.After 12 weeks of dietary manipulation to induce obesity，NaHS group received the high-fat diet with NaHS(2.8 mg·kg－1·d－1.ip).*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model.

Fig 2　Effects of NaHS on levels of liver triglyceride(TG)and total cholesterol(TC)in mice(±s)*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs model.

2.4硫化氫干預對小鼠肝臟結構的影響Fig 3顯示肝組織HE染色，對照組肝小葉結構正常，中央靜脈和肝血竇清晰;模型組小鼠肝小葉模糊，肝索排列紊亂，肝竇狹窄，肝細胞內可見大量脂肪空泡;與模型組相比，硫化氫干預組肝小葉結構基本正常，肝竇清晰，肝細胞內脂肪空泡明顯減少。

Fig 3　Effects of NaHS on tissue morphology of liver in obese mice(HE staining　×400)

Fig 4　Effects of NaHS on lipid accumulation of liver in obese mice(ORO staining　×100)

2.5硫化氫干預對小鼠肝細胞脂質蓄積的影響

Fig 4所示為肝組織油紅O染色切片，在光鏡下肝組織內脂質呈紅色。對照組肝組織的細胞形態(tài)和結構正常，個別肝細胞內有脂質沉積;模型組肝細胞內有大量脂質蓄積，肝小葉結構破壞;與模型組相比，硫化氫干預組脂質蓄積明顯減少，肝小葉結構破壞程度減輕。

2.6硫化氫干預對小鼠肝臟CPT-1、FAS基因表達的影響Fig 5A所示為肝組織CPT-1和FAS基因表達電泳圖。Fig 5B所示為電泳圖灰度分析結果。與對照組相比，模型組CPT-1基因表達水平明顯下降(P＜0. 05)。與模型組相比，硫化氫干預組小鼠肝組織CPT-1基因表達明顯增高(P＜0. 01)。與對照組相比，模型組小鼠肝臟FAS基因表達水平有所增高(P＜0. 05)。與模型組相比，硫化氫干預組小鼠肝組織FAS基因表達水平明顯降低(P＜0. 01)。

Fig 5　Effects of NaHS on mRNA expression levels of CPT-1 and FAS of liver in obese mice(±s)A: The mRNA expression levels of CPT-1 and FAS of liver were examined by RT-PCR; B:*P＜0.05 vs control;##P＜0.01 vs model.

2.7硫化氫干預對小鼠肝臟CPT-1、FAS活性的影響Fig 6A所示為肝組織CPT-1活性檢測結果，與對照組相比，模型組CPT-1活性明顯降低(P＜0. 01);與模型組相比，硫化氫干預組CPT-1活性明顯升高(P＜0. 01)。Fig 6B所示為肝組織FAS活性檢測結果，與對照組相比，模型組FAS活性有所增高(P＜0. 01);與模型組相比，硫化氫干預組FAS活性明顯降低(P＜0. 01)。

Fig 6　Effects of NaHS on activity of CPT-1 and FAS of liver in obese mice(±s)A: The activity of CPT-1 was detected by ELISA; B: The activity of FAS was detected by ELISA.＊＊P＜0. 01 vs control;##P＜0. 01 vs model.

3　討論

營養(yǎng)過?？蓪е麦w重增加，其主要表現是體內過量脂質蓄積，身體肥胖。現在認為，肥胖是一種慢性代謝性疾病，可引發(fā)肝脂肪變性、非酒精性肝炎、肝硬化、糖尿病和心血管病。阻斷脂肪在體內蓄積是預防和治療肥胖的一種有效措施。許多研究發(fā)現，肥胖患者血漿中硫化氫含量下降與高膽固醇血癥正相關［9］，動物實驗也證實肥胖可導致肝組織內硫化氫內源性合成減少，高脂飲食可抑制肝組織合成硫化氫。這些實驗結果提示，硫化氫很可能參與肥胖時脂質的代謝。

硫化氫是近年來繼發(fā)現一氧化氮和一氧化碳信號分子外，又一種被重新認識的氣體信號分子。作為一種脂溶性的氣體信號分子，硫化氫不借助任何細胞膜載體和通道，能自由進出細胞，從而對細胞發(fā)揮生理性調節(jié)作用。目前已發(fā)現，生理水平的硫化氫發(fā)揮穩(wěn)定血壓、擴張血管、調節(jié)神經興奮等作用。在病理情況下，硫化氫還具有抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用［10］。正常情況下，體內硫化氫水平保持動態(tài)平衡，它主要由含硫氨基酸為底物，在CSE和CBS等關鍵酶的催化下形成，形成的硫化氫又負反饋調節(jié)這些硫化氫合成的關鍵酶［11］。肝臟是內源性硫化氫產生的主要場所。肝組織來源的硫化氫有舒張血管、緩解門靜脈高壓、抗炎、抗氧化和肝細胞保護作用［12］。

本實驗用高脂飼料飼喂小鼠12周，小鼠體重明顯比飼喂普通飼料的對照組增加，說明小鼠肥胖模型誘導成功。從13周開始，腹腔注射硫氫化鈉，外源性補充硫化氫，與模型組相比，小鼠飲食飲水量無差別，而體重逐漸下降，到16周末實驗結束時，體重明顯下降。初步實驗結果提示，外源性補充硫化氫有減輕肥胖，降低小鼠體重的作用，且這種作用與動物食欲改變無關。課題組分析認為，硫化氫降低高脂飲食小鼠體重的機制很可能是參與體內脂質代謝，減少脂質在體內蓄積造成的。為此，本實驗檢測了小鼠肝組織甘油三酯和膽固醇的含量，結果發(fā)現，外源性補充硫化氫可使已經肥胖的小鼠肝組織甘油三酯和膽固醇含量下降。組織切片HE染色結果顯示，肥胖小鼠肝小葉結構模糊，肝索擴大，肝血竇狹窄，肝細胞內大量空泡，部分區(qū)域炎癥細胞浸潤，提示肥胖小鼠發(fā)生了非酒精性肝炎。外源性補充硫化氫4周，小鼠肝組織結構基本恢復正常，肝細胞內空泡明顯減少，炎癥細胞少見。結果提示，外源性補充硫化氫可以逆轉高脂飲食造成的肝臟脂肪蓄積。肝組織切片油紅O染色進一步證實，高脂飲食造成的肝細胞空泡主要是大量脂質蓄積引起的，外源性補充硫化氫4周后，肝細胞內脂質蓄積明顯減少，實驗結果進一步證實了外源性補充硫化氫可以明顯減少脂質在肝內的蓄積。

硫化氫對肝脂質代謝影響的機制目前還不清楚。一般在基礎飼料中添加0. 5%～1. 0%膽固醇即可形成小鼠高膽固醇血癥，同時肝臟甘油三酯(TG)含量也成倍增加，形成肝脂肪變性［13］。CPT-1是線粒體內脂肪酸β-氧化反應的限速酶，是反映脂肪分解的指標;反映脂肪酸合成的指標FAS是脂肪酸合成最后環(huán)節(jié)的限速酶。肝組織脂肪合成增多，分解減少是造成肝臟脂肪蓄積的直接原因。有文獻證實高脂飲食可以導致小鼠肝細胞脂肪氧化酶CPT-1活性和mRNA表達減少，從而引起肝脂肪蓄積［14］。也有文獻證實，高脂飲食導致小鼠脂肪酸合成酶FAS活性和mRNA表達量下降與肝脂肪蓄積相關［15］。脂肪酸合成和分解受細胞內氧化還原狀態(tài)影響。硫化氫是公認的還原劑，可影響細胞內NAD+/NADH平衡，控制脂代謝［16］。高脂飲食可以導致肝細胞脂質過氧化應激，硫化氫水平升高，維持肝組織谷胱甘肽水平不變，從而保持氧化還原水平處于平衡狀態(tài)［17］。本實驗結果也顯示，高脂飲食導致小鼠肝組織CPT-1 mRNA表達水平及酶活性明顯下降，FAS mRNA表達水平及活性明顯增加;外源性補充硫化氫，很可能通過調節(jié)高脂組小鼠肝細胞內氧化還原狀態(tài)，抑制脂肪酸合成，促進脂肪酸分解，從而減輕肝脂肪蓄積。

硫化氫像一氧化氮和一氧化碳一樣，其生物學作用也存在雙向劑量效應關系，即高劑量有害，低劑量發(fā)揮細胞保護作用［18］。硫化氫的毒性作用主要表現為，動物從呼吸道吸入大劑量硫化氫，造成呼吸道上皮損傷;每天腹腔注射超過200 μmol·kg－1體重，會造成肺損傷［19－20］。正常哺乳動物組織和血漿硫化氫濃度達到1－160 μmol·L－1，硫化氫在小鼠體內約1/3以氣體硫化氫形式存在，2/3以硫氫化鈉形式存在［21］。硫氫化鈉是常用的硫化氫供體，遇水后快速分解為鈉離子和硫氫根離子，后者再與體內氫離子結合形成相等分子濃度的硫化氫。從本實驗室預實驗和文獻來看，每天腹腔注射50 μmol· kg－1體重的硫氫化鈉屬于小鼠生理范圍的劑量，沒有發(fā)現對小鼠有毒副作用。

給大鼠腹腔注射硫氫化鈉1 h后，大鼠血漿中硫化氫濃度達到高峰值80 μmol·L－1，約6 h后下降到20 μmol·L－1［22］。本實驗每天通過腹腔注射1次硫氫化鈉，可以推測，動物體內硫化氫濃度波動是很大的，在這種情況下補充的硫化氫依然對肥胖引起的肝組織脂肪蓄積有治療作用。用緩釋型的硫化氫供體，保持動物體內硫化氫濃度處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，對肥胖誘發(fā)的肝脂肪蓄積是否有更好的治療作用需要進一步研究。

(致謝:感謝河南大學分子醫(yī)學實驗室提供實驗條件和技術支持!)

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Effect of hydrogen sulfide on hepatic lipid accumulation in obese mice

ZHENG Nai-rui1，2，ZHANG You-jing2，WU Dong-dong2，LIU Bin1，JI Ai-ling2，LI Yan-zhang2，HUANGFU Chao-shen2
(1.Nursing College of Henan University，Kaifeng Henan 475000，China;2.Institute of Environmental Medicine，Medical College of Henan University，Kaifeng Henan 475004，China)

Abstract: Aim To investigate the effect of hydrogen sulfide on hepatic lipid accumulation in obese mice.

Methods C57BL/6J mice were randomly divided into control group，model group，and NaHS group.The mice of the control group were fed with normal diet.The mice of the model group and the NaHS group were

fed with high-fat diet.From the thirteenth week，the mice of NaHS group were injected intraperitoneally with NaHS(H

2

S donor)in a dose of 50 μmol·kg

－1

per day for 4 weeks and the mice of the model group were injected with the same volume of saline.All mice were sacrificed at the end of the 16th week.The tissues of liver were homogenized and centrifugated.The supernatants were used for the determination of triglyceride and cholesterol in liver.The morphology of liver was tested by H＆E staining.Liver lipid accumulation was determined by oil red staining.Total RNA was extracted from frozen tissue of liver.PCR was used to detect CPT-1，FAS gene expression and ELISA method was used to detect CPT-1，FAS activity in mice liver.

Results The body weight of the mice from NaHS group and model group was bigger than that of the mice from control group.Compared with the model group，the body weight of the mice from NaHS group was less; the content of triglyceride and cholesterol in liver was lower; the degree of liver tissue pathological changes and lipid accumulation were alleviated; CPT-1 expression and activity were increased; FAS expression and activity were decreased.Conclusions These data indicate that hydrogen sulfide can reduce the lipid content of liver tissue in obese mice and alleviate fatty liver.The mechanism may be associated with the increased expression of CPT-1 and the decreased expression of FAS in liver.

Key words:hydrogen sulfide; obesity; fatty liver; fatty acid synthase; carnitine palmitoyltransferase-1; mice

作者簡介:鄭乃汭(1988－)，女，碩士生，研究方向:環(huán)境醫(yī)學，E-mail: nairui0125@163.com;

基金項目:河南省科技發(fā)展計劃項目(No 132300410012)

收稿日期:2015－02－15，修回日期:2015－04－02

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－0945－07

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.012