外周血β－HCG mRNA表達(dá)與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤血行轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究

范思斯 潘 玫 秦海燕 鄭 芳

外周血β－HCG mRNA表達(dá)與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤血行轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究

范思斯 潘 玫 秦海燕 鄭 芳

目的研究妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血β－HCG mRNA表達(dá)情況，評(píng)價(jià)其表達(dá)與不同臨床指標(biāo)的關(guān)系。方法收集28例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、15例葡萄胎、10例正常妊娠婦女和10例非妊娠婦女外周血。運(yùn)用外周血密度梯度離心法提取單個(gè)核細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞后采用RT－PCR方法檢測四者β－HCG mRNA表達(dá)水平，并與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤臨床指標(biāo)做相關(guān)分析。結(jié)果10例非妊娠婦女外周血β－HCG mRNA表達(dá)均陰性，10例正常妊娠婦女外周血中3例見β－HCG mRNA擴(kuò)增條帶，15例葡萄胎患者外周血中8例見β－HCG mRNA擴(kuò)增條帶，28例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血中24例見β－HCG mRNA擴(kuò)增條帶，正常妊娠婦女β－HCG mRNA表達(dá)水平低于葡萄胎、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者(P＜0．05)。妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血β－HCG mRNA表達(dá)與治療前血β－HCG水平、肺轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(P＜0．05)。28例隨訪病例中只有1例進(jìn)展，無復(fù)發(fā)病例。結(jié)論外周血中單個(gè)核細(xì)胞不表達(dá)β－HCG mRNA。正常妊娠、葡萄胎及妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤均有滋養(yǎng)細(xì)胞脫落入血。外周血滋養(yǎng)細(xì)胞β－HCG mRNA可能成為評(píng)估妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤早期血行轉(zhuǎn)移的有效指標(biāo)。

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤;β－HCG;密度梯度離心法;逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:806～811)

本研究擬采用密度梯度離心和RT－PCR技術(shù)檢測妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血中β－HCG mRNA表達(dá)，評(píng)價(jià)其表達(dá)與不同臨床指標(biāo)的關(guān)系，尋找早期診斷妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤血行轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，以期合理治療及預(yù)測預(yù)后。

1 材料與方法

1．1 一般資料

收集江西省婦幼保健院2013年4月－10月入院的28例初治侵蝕性葡萄胎或妊娠性絨毛膜癌，經(jīng)血β－HCG檢測、B超、胸片或病理學(xué)確診;除外既往有乳腺癌、肺癌等上皮性癌病史者及非妊娠性絨毛膜癌者?；颊吣挲g16～45歲，平均年齡27歲。前次妊娠葡萄胎16例，非葡萄胎12例。前次妊娠至確診間隔時(shí)間為1～16個(gè)月。臨床表現(xiàn)為陰道不規(guī)則出血20例，大出血2例，月經(jīng)紊亂1例，下腹痛5例，咳嗽3例，惡心、嘔吐4例，無癥狀僅表現(xiàn)為血β－HCG異常者3例。肺CT示大小不等(0．21～3．54 cm)結(jié)節(jié)影22例。治療前血β－HCG(mIU/ml)＜1033例，≥103～10410例，＞104～10514例，＞1051例。解剖學(xué)分期:Ⅰ期5例，Ⅱ期1例，Ⅲ期22例，Ⅳ期0例，改良FIGO預(yù)后評(píng)分低危21例，高危7例。28例侵蝕性葡萄胎或妊娠性絨毛膜癌患者中24例接受2～10個(gè)療程化療，平均療程5個(gè);1例仍在化療中，1例因肺結(jié)核轉(zhuǎn)院治療，2例中途拒絕治療?；煼桨?(1)單藥氟尿苷;(2)雙藥FA:氟尿苷+更生霉素;(3)三藥FAV:長春新堿+氟尿苷+更生霉素;(4)EMA－CO:甲氨蝶呤+依托泊苷+更生霉素/長春新堿+異環(huán)磷酰胺。24例患者綜合治療后21例(87．5%)獲完全緩解，3例(12．5%)部分緩解(殘留肺部病灶);6例耐藥。另取15例葡萄胎患者、10例正常妊娠婦女及10例非妊娠婦女作為對(duì)照組。

1．2 試劑與引物設(shè)計(jì)

人外周血淋巴細(xì)胞分離液(FICOLL配制)，購自天津市灝洋生物制品科技有限公司。RNAiso plus、PrimeScriptTMRT－PCR Kit(RR014A)、50 bp DNA marker，購自大連寶生物公司。β－HCG和GAPDH mRNA引物，購自南京金斯瑞生物科技有限公司。β－HCG和內(nèi)參基因GAPDH mRNA引物設(shè)計(jì)參考有關(guān)文獻(xiàn)［1］，并經(jīng)BLAST驗(yàn)證。β－HCG上游引物:TACTGCCCCACCATGACC，下游引物:CACGGCGTAGGAGACCAC;產(chǎn)物大小為144 bp。GAPDH上游引物:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，下游引物:AGGGGCCATCCACAGTCTTC;產(chǎn)物大小為258 bp。

1．3 標(biāo)本采集與總RNA提取

采集化療前侵蝕性葡萄胎或妊娠性絨毛膜癌患者、清宮前葡萄胎患者、正常孕2～3月妊娠婦女及非妊娠婦女EDTA抗凝血4 ml。淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞。RNAiso plus抽提細(xì)胞總RNA，具體操作按說明書進(jìn)行。美國伯樂分光光度儀測OD260 nm/OD280 nm比值判斷RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。

1．4 RT－PCR

合成cDNA第一鏈:①dNTP Mixture(10 mM each)1 μl，Oligo dT Primer(2．5 μM)和Random 6 mers (20 μM)各0．5 μl，模板RNA 1 μg，無核酶水補(bǔ)足10 μl;置恒溫水浴鍋65℃5 min，4℃。②上述反應(yīng)液10 μl，5×PrimerScript Buffer 4 μl，RNase Inhibitor(40 u/μl)0．5 μl，PrimeScript RTase 0．5 μl，無核酶水，5 μl;共20 μl體系。置PCR儀30℃10 min，42℃15 min，95℃5 min，4℃。PCR反應(yīng):①10×PCR Buffer II 2 μl，dNTP Mixture(10 mM each)0．8 μl，上游引物0．2 μl，下游引物0．2 μl，Takara Ex Taq HS(5 u/μl) 0．2 μl，上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2 μl，無核酶水補(bǔ)足20 μl。②PCR反應(yīng)以95℃預(yù)變性10 min;95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃1 min，β－HCG 33循環(huán)和GAPDH 29循環(huán)，4℃。③取5 μl PCR液和1 μl 6×DNA上樣緩沖液混勻后上樣于3%瓊脂糖凝膠，另取5 μl 50 bp DNA marker上樣，1×TAE電泳緩沖液中180 V電泳20 min，EB染色10 min后凝膠成像系統(tǒng)下觀察并保存，以出現(xiàn)144 bp擴(kuò)增條帶為陽性。使用Quantity one V4．62測定條帶灰度值，以β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值對(duì)β－HCG mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析。④設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，空白對(duì)照為不加RNA模板，陰性對(duì)照為不加RT酶，陽性對(duì)照為清宮術(shù)后的葡萄胎組織。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．5 隨訪

采用門診復(fù)診和電話隨訪相結(jié)合的方式。起始事件為診斷妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤，終點(diǎn)事件為腫瘤進(jìn)展或復(fù)發(fā)，觀察指標(biāo)為無進(jìn)展生存期及無疾病生存期。隨訪截止時(shí)間為2014年4月，以月為計(jì)算單位。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。比較各組β－HCG mRNA表達(dá)水平，采用Kruskal－Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用秩變換后SNK檢驗(yàn)。比較妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤β－HCG mRNA在不同臨床參數(shù)組的表達(dá)情況，采用Fisher確切概率法。顯著性水平α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 總RNA鑒定

OD260 nm/OD280 nm比值為1．7～2．0，1%瓊脂糖凝膠電泳EB染色可見18 S和28 S 2條亮帶，且28 S條帶亮度大約是18 S的2倍(圖1)。

2．2 外周血β－HCG mRNA表達(dá)情況

10例非妊娠婦女外周血β－HCG mRNA表達(dá)均陰性(見圖2)。10例正常妊娠婦女外周血中3例肉眼可見β－HCG mRNA擴(kuò)增條帶，條帶亮度較陽性對(duì)照弱(見圖3)，β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值范圍為0．01～0．77。15例葡萄胎患者外周血中8例肉眼可見β－HCG mRNA擴(kuò)增條帶，條帶亮度不等，較陽性對(duì)照弱，(見圖4)，β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值范圍為0．02～3．56。28例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血中24例肉眼可見β－HCG mRNA擴(kuò)增條帶，條帶亮度不等，較陽性對(duì)照弱(見圖5、6)，β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值范圍為0．04～4．56。本組中正常妊娠婦女β－HCG mRNA表達(dá)水平低于葡萄胎、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者(P＜0．05)，但葡萄胎與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者β－HCG mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

2．3 妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血β－HCG mRNA表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血β－HCG mRNA表達(dá)與治療前血B－HCG水平、肺轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，P＜0．05;而與年齡、前次妊娠、距前次妊娠時(shí)間、最大腫瘤大小、預(yù)后評(píng)分、耐藥、化療療程及化療療效均無關(guān)(P＞0．05)。見表1。

表1 妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血β－HCG mRNA表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系

2．4 妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血β－HCG mRNA表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

28例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者無失訪病例，隨訪時(shí)間為6～12個(gè)月。28例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者中1例因化療5個(gè)月后出現(xiàn)肺部新病灶判定為腫瘤進(jìn)展，現(xiàn)仍在化療中。該病例外周血β－HCG mRNA擴(kuò)增條帶陽性，β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值為4．16，為28例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者中β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值第二高者(最高者比值為4．56)。28例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者中只觀察到1例腫瘤進(jìn)展事件，無復(fù)發(fā)事件，截尾值過多，28例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者無進(jìn)展生存期及無疾病生存期與外周血β－HCG mRNA表達(dá)關(guān)系無法進(jìn)行Logrank檢驗(yàn)，亦無法采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型做多因素預(yù)后分析。

3 討論

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤根據(jù)組織學(xué)分類包括侵蝕性葡萄胎、妊娠性絨毛膜癌、胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤和上皮樣滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤。前兩者主要由細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)成，在我國最常見，江西省也屬高發(fā)地區(qū);后兩者主要由中間型滋養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)成，較少見。侵蝕性葡萄胎和妊娠性絨毛膜癌在臨床表現(xiàn)、診斷和處理原則等方面基本相同，均具有增生活躍、易早期血行轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，2000年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)婦科腫瘤委員會(huì)建議將兩者合稱為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤。本研究收集的病例為侵蝕性葡萄胎和妊娠性絨毛膜癌，將兩者放在一起討論，不包括中間型滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤。

檢測外周血β－HCG mRNA的表達(dá)首先需要收集患者新鮮的血液標(biāo)本，在檢測外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的相關(guān)文獻(xiàn)中有些作者采用肝素抗凝［2］，也有些作者采用EDTA抗凝［3］。因有文獻(xiàn)提及肝素是一種逆轉(zhuǎn)錄的抑制劑，對(duì)RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的過程有較強(qiáng)的抑制作用［4］。本研究采用EDTA抗凝管收集血液標(biāo)本，并在4 h內(nèi)處理血液標(biāo)本。對(duì)于所采集的血液標(biāo)本量各文獻(xiàn)報(bào)道不一。Cohen等收集了50例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者外周血經(jīng)免疫磁珠分離技術(shù)富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞儀平均每7．5 ml外周血中檢測到2個(gè)目標(biāo)細(xì)胞［5］。有文獻(xiàn)稱RT－PCR檢測方法可在106～107個(gè)正常細(xì)胞中檢出1個(gè)目標(biāo)細(xì)胞，相當(dāng)于在0．1～1 ml血液中檢出1個(gè)細(xì)胞［6］。本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)階段比較了2 ml和4 ml外周血經(jīng)密度梯度離心后提取總RNA濃度，后者更適合逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書中加1 μg總RNA的要求，因此本研究均采集4 ml外周血用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

富集單個(gè)核細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞后最關(guān)鍵的是鑒定滋養(yǎng)細(xì)胞，依據(jù)合體滋養(yǎng)細(xì)胞相對(duì)特異性表達(dá)β－HCG mRNA，分泌β－HCG蛋白，本研究采用常規(guī)RT－PCR方法檢測β－HCG mRNA表達(dá)以鑒定外周血中的滋養(yǎng)細(xì)胞。目前檢測外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物mRNA表達(dá)時(shí)除常規(guī)RT－PCR［2］方法外，還有學(xué)者用到巢式RTPCR或?qū)崟r(shí)熒光定量RT－PCR［3］等，后者是目前較熱門的鑒定外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞mRNA表達(dá)的方法。但多數(shù)文獻(xiàn)［3］采用的實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR仍是相對(duì)定量方法，得到目的基因與內(nèi)參基因的Ct值(循環(huán)閾值)后再以2－△△Ct計(jì)算樣品中目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR相對(duì)定量方法更多用于確定不同處理(如細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)中不同時(shí)相)的樣本目的基因mRNA的表達(dá)差異，適于科研。這種方法用于比較手術(shù)前后或不同放化療時(shí)程腫瘤患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞mRNA表達(dá)變化時(shí)更佳，但在比較某腫瘤不同患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞mRNA表達(dá)情況時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR絕對(duì)定量方法更佳，這需要制備已知目的基因cDNA拷貝數(shù)的質(zhì)?；蚧瘜W(xué)合成目的基因cDNA，再繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線從而計(jì)算樣本中目的基因mRNA表達(dá)量，步驟較為復(fù)雜，適于臨床應(yīng)用。呂時(shí)銘等［7］將不同細(xì)胞濃度的絨癌細(xì)胞株(JAR細(xì)胞)摻入正常人外周血，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR獲得β－HCG mRNA熒光釋放曲線并以此為外標(biāo)準(zhǔn)，通過檢測妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血中β－HCG mRNA熒光釋放曲線推算患者外周血中相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的量。但由于腫瘤異質(zhì)性，不同絨癌細(xì)胞株、絨癌細(xì)胞株與原代絨癌細(xì)胞及正常滋養(yǎng)細(xì)胞之間β－HCG mRNA表達(dá)均存在差異，以單一絨癌細(xì)胞株推算妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量較為粗略，只能用于估算。鑒于國內(nèi)外檢測妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的相關(guān)文獻(xiàn)較少，且標(biāo)本量均較少［2，7］，本研究先期采用常規(guī)RT－PCR初步檢測妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞β－HCG mRNA表達(dá)情況，積累外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集和檢測的經(jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)，以便后續(xù)采用實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR絕對(duì)定量法檢測妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞β－HCG mRNA表達(dá)，深入分析其與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤早期轉(zhuǎn)移、化療療程及療效、耐藥及復(fù)發(fā)等臨床參數(shù)的關(guān)系，探究其對(duì)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤診斷、治療和預(yù)后的指導(dǎo)意義。

檢測非妊娠婦女外周血β－HCG mRNA的表達(dá)，可以判斷外周血中血細(xì)胞成分(主要是單個(gè)核細(xì)胞)是否表達(dá)β－HCG mRNA，以除外其對(duì)外周血中滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)β－HCG mRNA的影響。本研究收集了10例非妊娠婦女(單純子宮肌瘤患者)外周血，經(jīng)外周血密度梯度離心和RT－PCR后均未檢測到β－HCG mRNA特異性擴(kuò)增條帶，初步說明外周血中單個(gè)核細(xì)胞不表達(dá)β－HCG mRNA。Hotakainen等［8］曾收集了5例非妊娠婦女和6例男性外周血，其中B細(xì)胞、T細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞均表達(dá)β－lh mRNA，但均不表達(dá)β－HCG mRNA。

妊娠時(shí)胎盤絨毛持續(xù)浸浴在母血中，絨毛膜上的滋養(yǎng)細(xì)胞可通過脫落方式直接進(jìn)入母血。據(jù)此國內(nèi)外已開展從母血中分離胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的研究。Lim等［9］研究發(fā)現(xiàn)胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞和有核紅細(xì)胞數(shù)量及平均純化百分比隨孕齡增加而下降，孕1～3月母血中胎兒細(xì)胞更多，產(chǎn)前診斷宜安排在此期間采血。故本研究選擇采集孕2～3月正常妊娠婦女外周血。Taniguchi等［10］在23例正常妊娠婦女(4～32周)中檢測到1例孕早期婦女表達(dá)α－HCG mRNA和β－HCG mRNA。本研究收集的10例正常孕早期婦女外周血中3例見β－HCG mRNA特異性擴(kuò)增條帶，但條帶亮度較葡萄胎和妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者的弱，即正常妊娠婦女外周血β－HCG mRNA表達(dá)弱于葡萄胎和妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者，可能與葡萄胎和妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤入血的滋養(yǎng)細(xì)胞過表達(dá)β－HCG mRNA有關(guān)，也可能與正常妊娠婦女進(jìn)入外周血的滋養(yǎng)細(xì)胞較葡萄胎和妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者少有關(guān)。要證實(shí)后者需要在滋養(yǎng)細(xì)胞鑒定階段采用保留細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方法如流式細(xì)胞儀檢測。

Taniguchi等［10］經(jīng)外周血密度梯度離心及巢式RT－PCR在7例葡萄胎患者中檢測到3例表達(dá)α－HCG mRNA和β－HCG mRNA。本研究在15例葡萄胎患者中檢測到8例表達(dá)β－HCG mRNA，且表達(dá)強(qiáng)于正常妊娠婦女，與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者無明顯差異，提示相比正常妊娠婦女，葡萄胎患者入血的滋養(yǎng)細(xì)胞過表達(dá)β－HCG mRNA或有更多的滋養(yǎng)細(xì)胞脫落入血。Taniguchi等［10］在4例絨癌患者外周血中檢測到1例表達(dá)α－HCG mRNA和β－HCG mRNA。Suzuka等［2］在4例無轉(zhuǎn)移的侵蝕性葡萄胎患者子宮切除術(shù)前及術(shù)中外周血中均檢測到β－HCG mRNA表達(dá)，術(shù)中β－HCG mRNA表達(dá)量最高，術(shù)后快速下降，并認(rèn)為即使無轉(zhuǎn)移外周血也存在滋養(yǎng)細(xì)胞播散，手術(shù)干預(yù)能減少循環(huán)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量。呂時(shí)銘等［7］在9例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者治療前外周血中檢測到4例表達(dá)β－HCG mRNA，推算腫瘤細(xì)胞量為104～107個(gè)/10 ml外周血。本研究在28例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者中檢測到24例表達(dá)β－HCG mRNA，且表達(dá)強(qiáng)于正常妊娠婦女，與葡萄胎患者無明顯差異，提示相比正常妊娠婦女，妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者入血的滋養(yǎng)細(xì)胞過表達(dá)β－HCG mRNA或有更多的滋養(yǎng)細(xì)胞脫落入血。

本研究顯示妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血β－HCG mRNA表達(dá)與年齡、前次妊娠、距前次妊娠時(shí)間、最大腫瘤大小、預(yù)后評(píng)分、耐藥、化療療程及化療療效無關(guān)，與治療前血β－HCG水平、肺轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)。治療前血β－HCG＜104mIU/ml組β－HCG mRNA表達(dá)陽性率低于治療前血β－HCG≥104mIU/ml組。Taniguchi等［10］在3例葡萄胎、1例絨癌及1例正常孕早期婦女外周血中檢測到的β－HCG mRNA表達(dá)量與血清β－HCG成正比。這可能與治療前血β－HCG高的患者原發(fā)灶中腫瘤性滋養(yǎng)細(xì)胞負(fù)荷高，相應(yīng)入血的滋養(yǎng)細(xì)胞更多有關(guān)。無肺轉(zhuǎn)移組β－HCG mRNA表達(dá)陽性率低于有肺轉(zhuǎn)移組，同時(shí)臨床分期Ⅰ/Ⅱ組β－HCG mRNA表達(dá)陽性率低于臨床分期Ⅲ/Ⅳ組，提示外周血β－HCG mRNA表達(dá)與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能成為評(píng)價(jià)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤早期血行轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。本研究隨訪的28例病例中只有1例進(jìn)展，無復(fù)發(fā)病例，目前無法評(píng)估外周血β－HCG mRNA與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤進(jìn)展及復(fù)發(fā)的關(guān)系。進(jìn)展的這個(gè)病例外周血β－HCG mRNA陽性且相對(duì)表達(dá)量較高，提示外周血β－HCG mRNA表達(dá)可能與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，后續(xù)可通過增加樣本量并延長隨訪時(shí)間來證實(shí)。播散在外周血中的腫瘤性滋養(yǎng)細(xì)胞可能是妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素，但由于其復(fù)發(fā)率相對(duì)較低(4%～8%)且復(fù)發(fā)時(shí)間不等(2月～20年)［11］，要評(píng)估外周血β－HCG mRNA表達(dá)與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系需要多中心研究(增加樣本量)并延長隨訪時(shí)間。

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The Relationship between the Expression of β-HCG mRNA in Peripheral Blood and the Hematogenous Metastasis of Gestational Trophoblastic Neoplasia

FAN Sisi，PAN Mei，QIN Haiyan，et al．Nanchang University of Medicine，Nanchang，330006

ObjectiveTo study the expression of β－Human Chorionic Gonadotrophin(β－HCG)in peripheral blood of the patients with gestational trophoblastic tumor，and its relationship with various clinical indicators．MethodsPeripheral blood of 28 cases of gestational trophoblastic tumors，15 cases of hydatidiform moles，10 cases of normal pregnant women and 10 cases of non－pregnant women were collected．Mononuclear cells and trophoblast cells were extracted from the peripheral blood by density gradient centrifugation method，then reverse transcription－polymerase chain reaction(RT－PCR)was used to detect the expression of β－HCG mRNA of the 4 groups．The correlation between the expression of β－h(huán)cg mRNA and the clinical indicators of gestational trophoblastic tumor was analyzed．ResultsThe expression of β－HCG mRNA in peripheral blood of 10 cases of non－pregnant women was negative．In 10 cases of normal pregnant women，3 women showed β－HCG mRNA amplified bands．There were 8 cases showed β－HCG mRNA amplified bands in 15 cases of hydatidiform moles．In 28 cases of gestational trophoblastic tumors，β－HCG mRNA amplified bands were seen in 24 patients．The β－HCG mRNA expression of normal pregnancy was lower than that of hydatidiform moles and gestational trophoblastic tumors(P＜0．05)．There were correlation between the expression of β－HCG mRNA and the serumβ－HCG levels before treatment，lung metastasis and clinical stage(P＜0．05)．Only 1 case showed progression among 28 cases during follow－up．No case recurred．ConclusionMononuclear cells in peripheral blood do not express β－HCG mRNA．Trophoblast cells can disseminate into peripheral blood in normal pregnancy，hydatidiform mole and gestational trophoblastic tumor．β－HCG mRNA of trophoblast cell in peripheral blood may be an effective marker in assessing the early hematogenous metastasis of gestational trophoblastic tumor．

Gestational trophoblastic neoplasia;β－Human chorionic gonadotrophin(β－HCG);Density gradient centrifugation;Reverse transcription－polymerase chain reaction(RT－PCR)

10．3969/j．issn．1001－5930．2015．06．005

R737

:A

:1001－5930(2015)06－0806－06

2015－01－06

2015－04－07)

(編輯:甘艷)

330006南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生院(范思斯，鄭芳); 330006江西省婦幼保健院(潘玫，秦海燕)

潘玫