三黃片對糖尿病模型大鼠氧化應(yīng)激水平的影響實(shí)驗(yàn)

王芳玲 田風(fēng)勝 王元松 馬小允 賈彩霞 王慶凱宋哲

（滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中醫(yī)教研室，河北滄州 061001）

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，機(jī)體內(nèi)高活性分子，如反應(yīng)性氧化物和活性氮簇，產(chǎn)生過多或消除減少，從而導(dǎo)致組織損傷［1］。糖尿病合并動脈硬化是糖尿病慢性并發(fā)癥的共同病理基礎(chǔ)，氧化應(yīng)激參與了動脈硬化的過程［2-3］。三黃片為臨床常用清熱類中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒的功效，研究表明清熱類中藥具有良好的抗氧化作用［4］。我們以丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）為觀察指標(biāo)，探討三黃片對糖尿病模型大鼠氧化應(yīng)激水平的影響，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康雄性Wistar大鼠50只，清潔級，體質(zhì)量180～220 g，均由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號1009065。

1.2 主要試劑及儀器三黃片（哈藥集團(tuán)三精黑河藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20053409）;SOD試劑盒、MDA試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所;鏈脲佐菌素（STZ）、檸檬酸鈉（美國Sigma公司）;戊巴比妥鈉（石家莊華瑞創(chuàng)新生物科技開發(fā)中心）;冰醋酸（河北健寧醫(yī)藥化工廠）;無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;7600-010型全自動生化分析儀（日本日立公司）;752N型紫外-可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）;美國雅培安妥超越血糖儀，XCF028-1009型。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備［5-6］將50只大鼠隨機(jī)分為2組，正常組12只，造模組38只。造模組大鼠禁食12 h后，將STZ用檸檬酸鈉緩沖液配制成濃度1%、pH 4.2的溶液，按60 mg/kg一次性腹腔注射;正常組予等量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。72 h后尾靜脈取血，測血糖≥16.7 mmol/L;尿糖（+ ++）～（++++），即可確定為糖尿病大鼠造模成功，穩(wěn)定1周后列入研究對象。

1.3.2 分組及給藥方法造模成功后，隨機(jī)選取造模成功大鼠24只，分為糖尿病組、三黃片組，各12只。三黃片組給予三黃片研末10 g/kg灌胃;正常組、糖尿病組予等容積純凈水灌胃。給藥期間觀察大鼠飲水、活動、體質(zhì)量及毛色等一般情況的變化。

1.4 觀察指標(biāo)及方法3組大鼠均連續(xù)灌胃飼養(yǎng)8周后，禁食12 h，取尾靜脈血測定血糖，然后以3%戊巴比妥鈉（80 mg/kg）腹腔注射麻醉，迅速開腹，分離腹主動脈，從腹主動脈采血，分離血清測定SOD及MDA。同時留取雙側(cè)腎臟，在冰冷的0.9%氧化鈉注射液中漂洗，除去血液，濾紙拭干，除去腎包膜，分離皮質(zhì)，取少許腎皮質(zhì)加9倍質(zhì)量預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液在冰浴中制成10%腎組織勻漿，低溫離心機(jī)離心，吸取上清液，分別檢測SOD及MDA。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析比較組間差異，有顯著差異者用Student-Newman–Keuls test進(jìn)行組間多重比較。

2 結(jié)果

2.13 組大鼠灌胃前及灌胃8周后血糖變化比較見表1。

表13 組大鼠灌胃前及灌胃8周后血糖變化比較mmol/L，±s

表13 組大鼠灌胃前及灌胃8周后血糖變化比較mmol/L，±s

與正常組比較，*P＜0.05

組別n灌胃前灌胃8周后正常組124.88±0.704.88±0.54糖尿病組1223.13±3.43*24.51±3.10*三黃片組1222.38±2.21*23.40±3.21*

由表1可見，3組灌胃8周后血糖水平與本組灌胃前比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;糖尿病組及三黃片組灌胃前及灌胃8周后血糖水平均高于正常組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且糖尿病組與三黃片組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.23 組大鼠灌胃前及灌胃8周后體質(zhì)量變化比較見表2。

由表2可見，3組灌胃前體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），體質(zhì)量相當(dāng);灌胃8周后，正常組體質(zhì)量與本組灌胃前比較增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;糖尿病組及三黃片組體質(zhì)量較灌胃前雖有所下降，但比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且2組體質(zhì)量均低于正常組且（P＜0.05）。

表23 組大鼠灌胃前及灌胃8周后體質(zhì)量變化比較g，±s

表23 組大鼠灌胃前及灌胃8周后體質(zhì)量變化比較g，±s

與灌胃前比較，*P＜0.05;與正常組比較，△P＜0.05

組別n灌胃前灌胃8周后正常組12196.5±13.6228.4±8.1*糖尿病組12205.7±16.2196.0±16.3△三黃片組12195.5±15.0192.0±12.6△

2.33 組大鼠灌胃8周后血清SOD及MDA水平比較見表3。

表33 組大鼠灌胃8周后血清SOD及MDA水平比較±s

表33 組大鼠灌胃8周后血清SOD及MDA水平比較±s

與正常組比較，*P＜0.05;與糖尿病組比較，△P＜0.05

組別nSOD（U/mL）MDA（nmol/mL）正常組12172.19±16.885.72±0.63糖尿病組12104.21±6.96*7.41±0.58*三黃片組12129.68±8.29＊△6.65±0.77＊△

由表3可見，糖尿病組及三黃片組灌胃8周后血清SOD及MDA水平與正常組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），SOD明顯降低，MDA明顯升高，但三黃片組SOD降低幅度及MDA升高幅度均低于糖尿病組（P＜0.05）。

2.43 組大鼠灌胃8周后腎臟組織SOD及MDA水平比較見表4。

表43 組大鼠灌胃8周后腎臟組織SOD及MDA水平比較±s

表43 組大鼠灌胃8周后腎臟組織SOD及MDA水平比較±s

與正常組比較，*P＜0.05;與糖尿病組比較，△P＜0.05

組別nSOD（mg prot）MDA（mg prot）正常組1239.09±4.172.79±0.74糖尿病組1226.73±3.17△4.63±0.92△三黃片組1233.74±3.05△＊3.77±0.55△＊

由表4可見，糖尿病組及三黃片組灌胃8周后腎臟組織SOD及MDA水平與正常組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），SOD均明顯降低，MDA均明顯升高，但三黃片組SOD降低幅度及MDA升高幅度均低于糖尿病組（P＜0.05）。

3 討論

氧化應(yīng)激作用機(jī)制可概括為活性氧分子生成增多或者活性氧分子清除減少，當(dāng)氧化和抗氧化能力之間有不平衡時，氧化應(yīng)激發(fā)生，糖尿病患者對氧化應(yīng)激更敏感［7-8］，機(jī)體處于明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)［9］。氧化應(yīng)激是糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的中間環(huán)節(jié)［10］，2004年Ceriello教授首先提出共同土壤學(xué)說［11］，即氧化應(yīng)激是胰島素抵抗、糖尿病及心血管疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ)。氧化應(yīng)激在糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，參與了動脈硬化的形成和進(jìn)展［12］，胰島素抵抗和糖尿病又增加了心血管疾病的發(fā)病率和病死率。因此，機(jī)體氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［13］。

MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其高低可間接反映機(jī)體細(xì)胞受氧自由基損傷的程度，研究顯示動脈粥樣硬化患者血清MDA含量顯著升高［14］。SOD是一種糖蛋白，可清除氧自由基及其分解產(chǎn)物，對細(xì)胞生物膜具有保護(hù)作用［15］。這2項指標(biāo)常常被應(yīng)用于反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平的研究。腎臟病變是糖尿病常見且重要的慢性并發(fā)癥之一，因此我們同時選取大鼠腎臟組織測定SOD及MDA水平，以初步了解三黃片在影響血清SOD及MDA水平的同時對腎臟的作用，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

三黃片主要成分為大黃、黃連、黃芩，3味中藥均為苦寒藥，具有清熱解毒、瀉火通便的作用，臨床上多用于治療結(jié)膜炎、小兒急性口瘡、急性扁桃體炎、急慢性胃腸炎、黃疸等證屬實(shí)熱者［16］。研究表明，清熱類中藥具有明顯抗氧化作用，能升高SOD活性，抑制脂質(zhì)過氧化［17-19］;同時具有顯著抗動脈硬化的作用，預(yù)防糖尿病血管病變［20-22］;還能明顯抑制腎臟細(xì)胞間黏附分子-1 （ICAM-1）及血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）水平的表達(dá)，對糖尿病腎病有積極防治作用［23］。既往文獻(xiàn)尚無三黃片抗糖尿病氧化應(yīng)激的研究報道，故本實(shí)驗(yàn)引申清熱類中藥的抗氧化作用，選三黃片作為研究對象。

本研究結(jié)果顯示:①灌胃前糖尿病組及三黃片組大鼠血糖水平與正常組比較均顯著升高（P＜0.05），糖尿病組及三黃片組比較無顯著差異（P＞0.05）。灌胃8周后，3組血糖水平較灌胃前比較均無明顯變化（P＞0.05），糖尿病組及三黃片組與正常組比較仍顯著升高（P＜0.05），糖尿病組與三黃片組比較無明顯差異（P＞0.05）。提示三黃片對糖尿病大鼠血糖水平無明顯作用。②灌胃前3組大鼠體質(zhì)量無差異（P＞0.05）。灌胃8周后，正常組大鼠體質(zhì)量較灌胃前明顯增加（P＜0.05），糖尿病組及三黃片組較灌胃前均無明顯變化（P＞0.05）。提示糖尿病可影響大鼠正常生長，三黃片對改善大鼠體質(zhì)量無明顯作用。③灌胃8周后，糖尿病組及三黃片組與正常組比較血清SOD明顯降低（P＜0.05），MDA明顯升高（P＜0.05），且三黃片組變化幅度均低于糖尿病組（P＜0.05）。提示三黃片能夠升高糖尿病大鼠血清SOD水平，降低MDA水平，從血清學(xué)水平具有抗氧化應(yīng)激作用。④灌胃8周后，糖尿病組及三黃片組與正常組比較腎臟組織SOD明顯降低（P＜0.05），MDA明顯升高（P＜0.05），且三黃片組變化幅度均低于糖尿病組（P＜0.05）。提示三黃片能夠升高糖尿病大鼠腎臟SOD水平，降低MDA水平，在組織學(xué)水平具有抗糖尿病氧化應(yīng)激的作用。

本研究結(jié)果表明，三黃片對糖尿病模型大鼠具有明顯抗氧化應(yīng)激作用，可以升高SOD水平，降低MDA水平，預(yù)防糖尿病血管病變，預(yù)防動脈硬化，保護(hù)腎臟組織，從而為拓展清熱類中藥的臨床應(yīng)用提供了新思路，為新藥的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯:石康）