針刺對(duì)老年大鼠腹部手術(shù)后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響※

徐少群 曾素冰 趙高峰 方素娟 黃祥凌 高巨

（廣東省中醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510120）

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperation cognitive dysfunction，POCD）是患者在全麻術(shù)后出現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，常見于接受大手術(shù)、急診手術(shù)后的老年患者，表現(xiàn)為手術(shù)后數(shù)天至數(shù)周出現(xiàn)記憶力、精神集中能力、語言理解力受損，社會(huì)適應(yīng)能力下降，甚至可發(fā)展為永久性認(rèn)知障礙，喪失獨(dú)立生活能力［1］。本課題組前期研究表明，針刺可明顯改善老年患者腸癌切除POCD的發(fā)生［2］。為進(jìn)一步探討針刺對(duì)中樞神經(jīng)的作用機(jī)制，我們觀察了針刺對(duì)老年大鼠腹部手術(shù)后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20月齡無特定病原體（SPF）級(jí)老年SD大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量550～640 g，由長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證編號(hào):SCXK（湘）2009-0012。

1.1.2 主要儀器及試劑英迪KWD-808Ⅰ型微電腦脈沖針灸治療儀（常州英迪電子醫(yī)療器械有限公司）;TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒、蛋白酶K（南京建成生物工程研究所）;水合氯醛（美國(guó)Sigma公司）;鹽酸布比卡因注射液（上海禾豐制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31022840）;華佗牌15 mm×0.26 mm毫針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）;多聚甲醛（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;Olympus光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組將30只大鼠隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組（以下簡(jiǎn)稱C組）、術(shù)后1 d處死組（以下簡(jiǎn)稱S1組）、術(shù)后3 d處死組（以下簡(jiǎn)稱S3組）、聯(lián)合針刺術(shù)后1 d后處死組（以下簡(jiǎn)稱A1組）及聯(lián)合針刺術(shù)后3 d處死組（以下簡(jiǎn)稱A3組），每組各6只。

1.2.2 操作方法C組不予任何干預(yù)措施;S1組及S3組按照Wan Y等［3］報(bào)道方法開腹行脾切除術(shù)，具體步驟:予大鼠腹腔內(nèi)注射10%（W/V）水合氯醛（0.25 mL/100 g）麻醉后，將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)，手術(shù)切口處備皮、消毒，以0.25%鹽酸布比卡因注射液局部浸潤(rùn)麻醉，在上腹部左鎖骨中線做1.5 cm小切口，游離出脾臟，結(jié)扎脾門神經(jīng)、血管后，完整切除脾臟，然后用手術(shù)縫合線逐層關(guān)腹，所有手術(shù)步驟均無菌操作。A1組及A3組于麻醉前20 min取百會(huì)、印堂行針刺，選用15 mm ×0.26 mm毫針，連接微電腦脈沖針灸治療儀，采用疏密波，頻率2/15 Hz，電針強(qiáng)度為引起局部肌肉微顫動(dòng)，20 min后進(jìn)行再行開腹脾切除術(shù)操作，電針刺激持續(xù)至手術(shù)操作完畢。大鼠穴位根據(jù)中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制訂的《動(dòng)物針灸穴位圖譜》進(jìn)行選擇。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 標(biāo)本采集及制作S1組及A1組大鼠于術(shù)后1 d腹腔注射10%（W/V）水合氯醛（0.4 mL/kg）過量麻醉，C組、S3組及A3組于術(shù)后3d腹腔注射l0%（W/V）水合氯醛（0.4 ml/kg）過量麻醉，然后均經(jīng)心臟灌注0.9%氯化鈉注射液200 mL后，再以4%多聚甲醛300 mL經(jīng)心臟灌注固定，斷頭取腦后，分離出大鼠海馬組織，放入4%多聚甲醛常規(guī)固定24 h后，進(jìn)行包埋切片。

1.3.2 檢測(cè)方法采用TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡情況。具體步驟如下:按常規(guī)方法將石蠟切片進(jìn)行脫蠟及水合，將處理好的樣本浸入磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次，每次5 min，然后加入蛋白酶K工作液（2 μL蛋白酶K+98 μL PBS），21～37℃作用15～30 min，再將樣本浸入PBS漂洗3次，每次5 min，處理好樣本后浸入封閉液（3%雙氧水甲醇溶液）中，室溫（15～25℃）封閉10 min后浸入PBS漂洗2次，每次5 min，然后進(jìn)行標(biāo)記和顯色反應(yīng)。每張切片在海馬CA1區(qū)隨機(jī)選3個(gè)視野，于光學(xué)顯微鏡（×200）下攝片，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析凋亡細(xì)胞光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.15 組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果光鏡下C組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞未見明顯染色（見封3，圖1）;S1組可見大量凋亡細(xì)胞體積縮小，凋亡小體呈黑色或紫藍(lán)色位于細(xì)胞核內(nèi)（見封3，圖2）;S3組（見封3，圖3）及A1組（見封3，圖4）亦可見中量呈灰黃色的凋亡細(xì)胞; A3組可見少量凋亡細(xì)胞（見封3，圖5）。

2.25 組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡光密度值比較見表1。

表15 組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡光密度值比較±s

表15 組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡光密度值比較±s

組別n 神經(jīng)元凋亡光密度值C組0.212±0.068 S1組62.991±0.217 S3組62.182±0.339 A1組61.462±0.175 A3組6 6 0.456±0.073

表1數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析，與C組比較，S1組、S3組、A1組及A3組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡光密度值均明顯升高（P＜0.05），且S1組升高最明顯（P＜0.05）;與S1組及S3組比較，A1組及A3組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡光密度值均明顯降低（P＜0.05），且A3組下降最明顯（P＜0.05）。

3 討論

POCD是老年患者手術(shù)后常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，在非心臟手術(shù)后1周內(nèi)發(fā)病率高達(dá)25.8%～48.6%［1］。目前，隨著社會(huì)老齡化的加劇，多數(shù)老年人在其余生至少會(huì)接受1次手術(shù)，而POCD不僅延長(zhǎng)患者住院時(shí)間，增加術(shù)后死亡率，嚴(yán)重危害老年患者術(shù)后身心健康恢復(fù)，更進(jìn)一步加重了家庭及社會(huì)醫(yī)療保障體系的負(fù)擔(dān)。因此，采取積極措施防治POCD有著十分重要的臨床和社會(huì)意義，并已成為全世界關(guān)注的熱點(diǎn)課題。但迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)POCD的研究才剛剛起步，其現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，更缺乏有效防治策略［4］。為尋找安全有效的防治方案，本課題根據(jù)長(zhǎng)期從事圍手術(shù)期重大疾病防治工作的經(jīng)驗(yàn)，并結(jié)合中醫(yī)經(jīng)絡(luò)學(xué)說理論特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)針刺在多種缺血缺氧性腦病所致認(rèn)知功能障礙中具有良好防治效果，并積極開展探索圍手術(shù)期進(jìn)行針刺干預(yù)對(duì)防治POCD的作用，取得了確切療效［5］。

為進(jìn)一步探討針刺中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選取了百會(huì)及印堂兩穴位對(duì)老年腹部手術(shù)大鼠進(jìn)行術(shù)前干預(yù)。針刺百會(huì)可調(diào)督脈，提升陽(yáng)氣，開竅啟閉，醒神安神;印堂雖屬經(jīng)外奇穴，但其位于督脈循行路線之上，故針刺印堂可推動(dòng)督脈氣血運(yùn)行，可治督脈所過部位病癥，有凝神定志、開竅醒神通絡(luò)的功效。有實(shí)驗(yàn)研究表明，督脈電針刺激可改善腦部缺血，直接作用于腦神經(jīng)，使機(jī)體血氧重新分配，以保護(hù)腦組織［6］，這種保護(hù)機(jī)制在于針刺能增加大鼠皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元Bcl -2蛋白表達(dá)，降低Bax蛋白表達(dá)，抑制神經(jīng)元凋亡和壞死，保護(hù)缺血損傷后的皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元，從而改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，腹部手術(shù)可導(dǎo)致大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，并持續(xù)至術(shù)后3 d仍處于較高水平，但通過術(shù)前及術(shù)中電針針刺持續(xù)干預(yù)后，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡水平在術(shù)后1 d即明顯下降，至術(shù)后3 d僅有少量細(xì)胞凋亡。

綜上所述，手術(shù)創(chuàng)傷可引發(fā)海馬神經(jīng)元凋亡，針刺可抑制大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用，這可能是針刺防治POCD的作用機(jī)制之一。

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（本文編輯:石康）