芽孢桿菌BSC6-1中纖維素酶基因的異源表達及酶學(xué)性質(zhì)

林蒙蒙， 張華青， 黃曉莉， 韋鑫斐， 楊江華， 于 嵐

(湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 湖州 313000)

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芽孢桿菌BSC6-1中纖維素酶基因的異源表達及酶學(xué)性質(zhì)

林蒙蒙， 張華青， 黃曉莉， 韋鑫斐， 楊江華， 于 嵐*

(湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 湖州 313000)

從土壤中篩選獲得1株高產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌BSC6-1，為了進一步研究其纖維素酶的性質(zhì)，克隆表達來自BSC6-1的新的纖維素酶基因Celbsc6，并通過純化后用于酶學(xué)性質(zhì)的研究。結(jié)果表明：成功在大腸桿菌中異源表達，該基因的表達產(chǎn)物為50 kDa的蛋白。在70℃條件下酶活力保持80%以上，當(dāng)pH 7～8時內(nèi)酶活力保持在94%以上。證明，重組纖維素酶Celbsc6具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。最佳的酶促反應(yīng)條件為55℃和pH 7.5，鎂離子濃度10 mmol/L。在該條件下Celbsc6的米氏常數(shù)，Km值為7.89×10-3g/mL，最大反應(yīng)速率Vmax為0.11 μmol /(L·s)。

芽孢桿菌； 大腸桿菌； 纖維素酶基因； 重組纖維素酶； 酶學(xué)性質(zhì)

纖維素酶在食品、酒業(yè)、造紙、紡織、洗滌、農(nóng)業(yè)等方面應(yīng)用廣泛[1]。纖維素酶降解生物質(zhì)纖維的過程中包括3種酶的共同催化作用：葡聚糖內(nèi)切酶，主要切割非結(jié)晶纖維素的β-1,4-糖苷鍵從而產(chǎn)生長鏈的寡糖；纖維二糖水解酶催化這些長鏈寡糖的還原和非還原末端從而產(chǎn)生纖維二糖；最后由β葡萄糖苷酶水解纖維二糖產(chǎn)生葡萄糖用于發(fā)酵生產(chǎn)其他生物產(chǎn)品[2-3]。為了適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需要，纖維素酶需具有高度穩(wěn)定性，如對堿穩(wěn)定的纖維素酶合適用于洗滌劑生產(chǎn)工業(yè)；對于造紙工業(yè)和食品工業(yè)，熱穩(wěn)定性的纖維素酶是生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。隨著纖維素酶日益增長的市場需求，不斷從各種生物中發(fā)掘新的催化穩(wěn)定、高的底物專一性纖維素酶，包括采用定點突變、DNA重組技術(shù)以及從自然界極端環(huán)境中篩選獲得穩(wěn)定、催化活性高的纖維素酶[4-9]。目前，工業(yè)化生產(chǎn)用的纖維素酶主要來源于微生物，細菌由于其能夠高密度培養(yǎng)，并且能夠產(chǎn)生熱穩(wěn)定、堿穩(wěn)定的纖維素酶，被認為是工業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶的主要菌株[10-11]。近年來，關(guān)于篩選高產(chǎn)纖維素酶的細菌研究較多，主要為放線菌和芽孢桿菌，其中放線菌來源的纖維素酶主要具有耐堿性[12]，而芽孢桿菌來源的纖維素酶由于具有很好的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、環(huán)境適應(yīng)性和較高的催化活性而受到廣泛關(guān)注[13-15]。

在前期的工作中，篩選到1株纖維素酶生產(chǎn)菌株BSC6-1，經(jīng)菌種鑒定屬于芽孢桿菌的新亞種，其生產(chǎn)的纖維素酶在較寬的溫度和pH范圍內(nèi)保持較高的酶活，具有良好的穩(wěn)定性。筆者通過對BSC6-1中纖維素酶基因進行克隆，并利用pET28a表達載體構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，使得纖維素酶在大腸桿菌中成功異源表達，利用組氨酸標(biāo)簽進行親和層析對重組纖維素酶進行分離純化獲得純酶后研究酶學(xué)性質(zhì)，旨在為芽孢桿菌的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

1.1.1 菌株 芽孢桿菌BSC6-1由湖州師范學(xué)院發(fā)酵實驗室自主篩選并保存，大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)由湖州師范學(xué)院發(fā)酵實驗室保藏。

1.1.2 質(zhì)粒 T-pMD19質(zhì)粒用于纖維素酶基因的克隆和測序，pET28a質(zhì)粒用于纖維素酶基因的表達，均由湖州師范學(xué)院發(fā)酵實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

1.2.1 芽孢桿菌活化培養(yǎng)基 CMC-Na 1%，蛋白胨 1%，K2HPO40.2%，NH4SO40.5%，瓊脂2%，pH自然。

1.2.2 芽孢桿菌菌體培養(yǎng)基 CMC-Na 1%，K2HPO40.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，蛋白胨 1%，CaCl20.002%，F(xiàn)eSO40.0004%，pH 7.0。

1.2.3 大腸桿菌培養(yǎng)基(LB) 胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，pH 7.0。用于大腸桿菌活化的固體培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂。

1.2.4 重組大腸桿菌的活化或菌體培養(yǎng)條件 在LB培養(yǎng)基中添加100 μg/mL的氨芐青霉素或50 μg/mL的卡那霉素，37℃ 170 r/min條件下培養(yǎng)12 h。

1.2.5 芽孢桿菌BSC6-1的培養(yǎng)條件 從甘油保存管中接種BSC6-1至活化培養(yǎng)基平板，35℃條件下培養(yǎng)24 h，在芽孢桿菌菌體培養(yǎng)基中接入約5%的菌體，35℃條件下，200 r/min搖床培養(yǎng)30 h，收集菌體。

1.3 重組表達載體pET28a-Celbsc6和重組菌的構(gòu)建

采用基因組DNA小量制備試劑盒(Axygen)提取芽孢桿菌BSC6-1基因組DNA。根據(jù)芽孢桿菌中纖維素酶基因測序信息設(shè)計引物：CGCGGATCCATTGCAATGGTATGGCGATT和TTGCGGCCGCCTAATTGGGTTCTGTTCCCCA在引物的5′端分別引入1個BamHI和NotI酶切位點，以基因組DNA為模板，擴增Celbsc6基因，PCR程序為92℃預(yù)變性3 min后，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)然后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，連接T-載體，送樣上海生工測序。利用BamHI和NotI消化Celbsc6基因和pET28a質(zhì)粒，切膠回收酶切片段。利用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細胞，涂布LB(含有卡那霉素50 μg/mL)平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，至新鮮的LB(含有卡那霉素50 μg/mL)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)37℃ 170 r/min培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHI和NotI雙酶切驗證得到正確的質(zhì)粒pET28a-Celbsc6。

將驗證正確的重組質(zhì)粒pET28a-Celbsc6轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)培養(yǎng)及提取質(zhì)粒雙酶切驗證后獲得重組菌E.coli/pET28a-Celbsc6。同時采用空載體pET28a轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞獲得對照菌，E.coli/pET28a。

1.4Celbsc6在大腸桿菌中的表達與純化

接種重組菌E.coli/pET28a-Celbsc6至LB(含有50 μg/mL卡那霉素)平板上劃線培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)過夜后挑取單菌落至5 mL LB(含有50 μg/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，37℃ 170 r/min 培養(yǎng)12 h后作為種子液，以1%的接種量接種至新鮮的LB(含有50 μg/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，37℃ 170 r/min培養(yǎng)至菌密度達到OD600=1時添加IPTG(終濃度為1 mmol/L)在30℃ 200 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h。將E.coli/pET28 a重組菌在同樣條件下培養(yǎng)作為陰性對照。10 000 r/min常溫條件下離心10 min收集重組大腸桿菌菌體細胞，超聲波破碎后，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液，用于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析[16]。

按上述方法誘導(dǎo)表達重組大腸桿菌E.coli/pET28a-Celbsc6， 收集菌體重懸于50 mmol/L Tris·HCl(pH 7.0)中，超聲波破碎，收集上清液，采用鎳柱(QIAGEN)純化，并利用(50～200 mmol/L)咪唑梯度洗脫，將洗脫得到的蛋白溶液利用超濾管(Milipore)進行去鹽及濃縮，重懸于50 mmol/L Tris·HCl(pH 7.0)中。采用10% SDS-PAGE檢驗純化后蛋白的純度，獲得純的重組纖維素酶。

1.5 不同條件對纖維素酶穩(wěn)定性的影響

1.5.1 溫度 純化的Celbsc6酶液在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃條件下分別保溫1 h后，在55℃條件下，以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為底物進行酶促反應(yīng)，測定相對酶活[17]。

1.5.2 pH 將純化后的酶液分別保存于pH=5.0～9.5的緩沖液中，于4℃放置24 h后，30℃保持3 h，在pH 7.0和55℃條件下，測定相對酶活。

1.6 不同條件對重組纖維素酶Celbsc6活力的影響

1.6.1 酶促反應(yīng)溫度 在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃條件下分別進行酶促反應(yīng)，并測定相對酶活。

1.6.2 酶促反應(yīng)pH 在pH為5.0、5.5、 6.0、6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 8.5、 9.0和9.5的條件下分別進行酶促反應(yīng)，并測定相對酶活。

1.6.3 不同金屬離子 在酶促反應(yīng)液中分別添加10 mmol/L的Mn2+、 Fe3+、 Co2+、 Mg2+和Fe2+，在最佳酶促反應(yīng)溫度和pH條件下進行酶促反應(yīng)，并測定相對酶活力。

1.7 米氏常數(shù)和最大酶促反應(yīng)速率的測定

以不同濃度的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為底物(20～70 mg/L)，在最佳酶促反應(yīng)溫度條件下分別測定相對酶活力，將米氏方程轉(zhuǎn)換成林貝氏方程，1/v=Km/Vmax ·1/c[S]+1/Vmax，以1/v對1/c[S]作圖計算獲得Km和Vmax值。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET28a-Celbsc6如圖1 A所示，采用BamHI和NotI雙酶切驗證(圖1B)，結(jié)果表明，E.coli/pET28a-Celbsc6中有1條大小約為50 kDa的條帶，而在E.coli/pET28a中并未表達，證明Celbsc6在大腸桿菌中成功表達，蛋白的大小與預(yù)計相符(圖2A)。純化后的蛋白溶液中雜帶較少，目標(biāo)條帶占有總蛋白濃度的90%以上(圖2 B)。因此，經(jīng)純化后的蛋白為較純的蛋白溶液。

注：A為重組質(zhì)粒pET28a-Celbsc6圖譜；B為重組質(zhì)粒的雙酶切驗證，M為DL15000 DNA marker，1為重組質(zhì)粒pET28a-Celbsc6的BamHI 單酶切，2為重組質(zhì)粒pET28a-Celbsc6的BamHI和NotI雙酶切。

Note: A, map of recombinant plasmid pET28a-Celbsc6; B, the digestion of recombinant plasmid by two restrict enzymes; M, DL15000 DNA marker; 1, recombinant plasmid pET28a-Celbsc6 digested byBamHI; 2, recombinant plasmid pET28a-Celbsc6 digested byBamHI andNotI.

圖 1 重組質(zhì)粒pET28a-Celbsc6的構(gòu)建

Fig.1 Construction of recombinant plasmid pET28a-Celbsc6

注：A為SDS-PAGE分析重組大腸桿菌中Celbsc6的表達，M為蛋白Marker，1和3為重組大腸桿菌E.coli/pET28a-Celbsc6誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞破碎上清液，2和4為對照菌E.coli/pET28a誘導(dǎo)后的細胞破碎上清液；B為SDS-PAGE分析純化后的重組纖維素酶Celbsc6，M為蛋白Marker，5和6為純化后的蛋白溶液。

Note: A, SDS-PAGE analysis of the expression of Celbsc6 in recombinantE.coli, M, protein marker; Lane 1 and 3, the cell supernatant of induced recombinant E.coli/pET28a-Celbsc6; Lane 2 and 4, the cell supernatant of induced controlE.coli/pET28a; B, SDS-PAGE analysis of the purified recombinant Celbsc6; M, protein marker; Lane 5 and 6, the purified recombinant Celbsc6.

圖2 重組纖維素酶Celbsc6在大腸桿菌中的表達

Fig.2 The heterogeneous expression of Celbsc6 inE.coli

圖3 重組纖維素酶Celbsc6的穩(wěn)定性

結(jié)果表明，重組質(zhì)粒的BamHI單酶切獲得大小約為6.9 kb的條帶，雙酶切分別獲得約為5.4 kb和1.5 kb的條帶，表明重組質(zhì)粒的構(gòu)建正確。

2.2 重組纖維素酶Celbsc6的表達和純化

2.3 重組纖維素酶Celbsc6的穩(wěn)定性

2.3.1 溫度 由圖3可見，重組酶在30～55℃內(nèi)酶活力保持在100%，溫度高于70℃酶活力降至80%以下，因而重組纖維素酶Celbsc6具有熱穩(wěn)定性。

2.3.2 pH 由圖3還可見，重組酶在pH 7～8內(nèi)酶活力保持在94%以上，pH低于6.0或高于9.0，酶活力降至60%以下。因此，該酶在堿性條件下具有穩(wěn)定性。

2.4 不同條件下重組纖維素酶Celbsc6的酶活力

不同酶促反應(yīng)條件下重組纖維素酶Celbsc6的酶活力見圖4。表明：

最適的反應(yīng)溫度為55℃，但在45～65℃酶促反應(yīng)保持在較高的催化效率(90%以上)。酶促反應(yīng)的最佳pH條件為7.5，在pH為7～8，重組酶保持較高的催化效率(90%以上)，證明Celbsc6是堿性纖維素酶。在含有10 mmol/L Mn2+的酶促反應(yīng)條件下，Celbsc6的酶活力提高約7.86%；在同樣濃度的Mg2+和Fe2+條件下，Celbsc6的酶活力分別提高12.35%和10.11%；在含有10 mmol/L的Fe3+條件下，Celbsc6的酶活力下降9.88%，在10 mmol/L Co2+和Zn2+存在條件下，酶活力分別下降2.81%和19.10%。

圖4 不同條件下重組纖維素酶Celbsc6的活力

圖5 重組纖維素酶Celbsc6的米氏常數(shù)

Fig.5 Michaelis constant of the recombinant cellulase Celbsc6

2.5 米氏常數(shù)的測定

如圖5所示， 根據(jù)趨勢線的回歸方程可以計算出Km值為7.89×10-3g/mL， Vmax為0.11 μmol /(L·s)。證明，以CMC-Na為底物時重組纖維素酶Celbsc6對底物有較好的親和力。

3 結(jié)論與討論

3.1 芽孢桿菌纖維素酶基因的表達

通過克隆表達來自芽孢桿菌BSC6-1中1個新的纖維素酶基因Celbsc6，使其在大腸桿菌中過量表達。結(jié)果表明，Celbsc6的分子量大小約為50 kDa，與預(yù)計大小相符。

3.2 芽孢桿菌纖維素酶基因的酶學(xué)性質(zhì)

進一步對純化后的重組酶Celbsc6進行酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，重組纖維素酶Celbsc6在70℃條件以下酶活力保持在80%以上，在pH 7～8酶活力保持在94%以上。最佳的酶促反應(yīng)條件為55℃和pH 7.5，鎂離子濃度10 mmol/L，在該條件下Celbsc6的米氏常數(shù)，Km值為7.89×10-3g/mL，最大反應(yīng)速率Vmax為0.11 μmol葡萄糖/L/s，與其他已報道的純化后纖維素酶的底物親和力相比較[18-20]，具有較高的底物親和力和較大的酶促反應(yīng)速率。因此，Celbsc6具有工業(yè)應(yīng)用的潛力，是值得開發(fā)的酶制劑。

由于Celbsc6是內(nèi)切β-葡聚糖酶，無法單獨完成降解粗纖維，如玉米秸稈等材料的過程，因而需要和其他纖維素酶β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶共同作用，芽孢桿菌BSC6-1是湖州師范學(xué)院發(fā)酵實驗室從自然界中篩選到的1株纖維素酶高產(chǎn)菌株，對該菌株中粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)研究表明其具有較高的降解濾紙的活性，因而具有良好的應(yīng)用潛力。進一步對BSC6-1中其他纖維素酶組分的克隆表達及純化獲得酶制劑，對于推廣BSC6-1中纖維素酶的應(yīng)用具有重要意義。將進一步對BSC6-1的全基因組測序，獲得其含有的纖維素酶系基因，用于其纖維素酶系基因的克隆表達及大規(guī)模生產(chǎn)。

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(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Heterologous Expression and Enzymatic Properties of Cellulae fromBacillussp.BSC6-1

LIN Mengmeng, ZHANG Huaqing, HUANG Xiaoli, WEI Xinfei, YANG Jianghua, YU Lan*

(SchoolofLifeScience,HuzhouUniversity,Huzhou,Zhejiang313000,China)

A cellulase gene Celbsc6, fromBacillussp. BSC6-1, was cloned and heterologously expressed inE.coli, in order to insight into the enzymatic properties. The results indicated that, Celbsc6 was successfully heterogeneously expressed inE.coli, and the molecular weight of the recombinant Celbsc6 protein was about 50 kDa. The relative activity of Celbsc6 remained above 80% at 70℃, and its relative activity maintained above 94% at the pH range from 7 to 8, which indicated that the recombinant Celbsc6 represents heat and pH stability. The maximum activity of recombinant Celbsc6 was detected under the condition of 55℃, pH 7.5 and 10 mmol/L Mg2+, with Km of 7.89×10-3g/mL and Vmax of 0.11 μmol glucose/(L·s).

Bacillussp.;E.coli; cellulase gene; recombinant cellulase; enzymatic properties

2014-12-11； 2015-05-11修回

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃“新苗人才計劃”(2014R425010)

林蒙蒙(1992-)，女，本科，研究方向：微生物工程。E-mail: 813127480@qq.com

*通訊作者：于 嵐(1980-)，女，講師，博士，從事微生物工程研究。E-mail: yulanwt@hutc.zj.cn

1001-3601(2015)07-0373-0105-05

Q936

A