瑞鮑迪甙A急性毒性和亞慢性毒性試驗

李 楠， 王建明，2， 周澤偉， 鄭玲敏， 余崢嶸， 張雨梅，2*

(1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

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瑞鮑迪甙A急性毒性和亞慢性毒性試驗

李 楠1， 王建明1，2， 周澤偉1， 鄭玲敏1， 余崢嶸1， 張雨梅1，2*

(1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

[目的]為評價瑞鮑迪甙A作為飼料甜味劑的安全性，進行了瑞鮑迪甙A大鼠、小鼠的急性毒性及亞慢性毒性試驗。[方法]急性毒性試驗采用灌胃給予；亞慢性毒性試驗中，瑞鮑迪甙A以20、4和1 g/kg拌料給予大鼠90 d，每周稱量大鼠體重和飼料消耗，并在喂養(yǎng)45和90 d時剖檢，分別進行血液細(xì)胞學(xué)和血液生化指標(biāo)檢測，計算主要臟器系數(shù)以及進行相應(yīng)的組織病理學(xué)檢查。[結(jié)果]瑞鮑迪甙A對大、小鼠的經(jīng)口LD50分別大于34.0 和45.0 g/kg b.w.；亞慢性毒性試驗各劑量組大鼠的采食、體重、臟器系數(shù)、血液細(xì)胞學(xué)及血液生化指標(biāo)、大體解剖及組織病理學(xué)檢查結(jié)果與正常對照組比較無明顯差異。[結(jié)論]瑞鮑迪甙A屬于實際無毒級別物質(zhì)，亞慢性毒性試驗對大鼠無明顯有害作用。

瑞鮑迪甙A；急性毒性；亞慢性毒性

瑞鮑迪甙A是從混合物甜菊糖苷中分離或直接從甜葉菊提取物中純化出的甜味劑。瑞鮑迪苷A在甜菊糖苷中約占15%～20%，甜度為蔗糖的450倍，甜味較純正，且甜味最接近蔗糖，其他組分含量均較少。甜菊糖苷類高甜度低熱量的特點，作為蔗糖的替代品在食品中應(yīng)用越來越多[1]。研究表明瑞鮑迪甙A的吸收和代謝主要在肝腸，而排泄途徑主要是通過糞便排出[2-3]。目前有不少研究表明瑞鮑迪甙A有降血壓和降血糖的作用[4-5]。

由于甜菊糖苷類的規(guī)格資料不足，代謝物甜菊醇體外試驗中表現(xiàn)出致突變性[6-7]，對其應(yīng)用安全性存在著爭議[8]。至2008年，在聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織食品添加劑專家委員會(JECFA)第69屆會議上，確定了甜菊糖苷每日允許攝入量(ADIS)為0～4 mg/kg體重(以甜菊醇表示)[9]。同年，美國藥品食品管理局(FDA)批準(zhǔn)允許在食品中使用甜葉菊提取物瑞鮑迪苷A。2012年，法國成為歐盟第一個批準(zhǔn)在食品和飲料產(chǎn)品內(nèi)使用高純度瑞鮑迪苷A(97%)的國家[10]。但目前國內(nèi)對瑞鮑迪苷A的研究和其在食品中的應(yīng)用還相對較少。為進一步了解瑞鮑迪甙A的使用安全性，該試驗研究瑞鮑迪甙A對大小鼠的急性毒性和亞慢性毒性，為評價瑞鮑迪甙A作為飼料甜味劑的安全性及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試藥物瑞鮑迪甙A，批號BZR2012-002P，白色粉末，由上海某生物科技有限公司提供。臨用前以1%羧甲基纖維素鈉溶液配制成受試物混懸液。

1.2 試驗動物ICR小鼠(清潔級)，體重18～22 g，Wistar大鼠(清潔級)，體重180～220 g，由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2012-0004，使用許可證號SYXK(蘇)2012-0029。飼喂經(jīng)60Co照射飼料，24±2 ℃，濕度(60±20)%，自由采食和飲水，飲水為符合城市飲用水標(biāo)準(zhǔn)的自來水。試驗前在試驗環(huán)境中適應(yīng)3 d，灌胃前停食12 h，不限制飲水。

1.3 方法

1.3.1大、小鼠經(jīng)口急性毒性試驗。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，受試品瑞鮑迪甙A對大、小鼠的毒性較小，無法準(zhǔn)確測出LD50，依據(jù)急性毒性試驗技術(shù)規(guī)范，對受試品進行最大給藥量試驗。ICR小鼠，雌、雄各半，各20只，以可操作的藥物最高濃度、最大給藥容積(0.4 ml/10g b.w.)于24 h內(nèi)灌胃2次，給藥時間間隔6 h，給藥總量為45.0 g/kg b.w.，連續(xù)觀察2周，并記錄動物中毒癥狀及死亡情況。Wistar大鼠，雌、雄各半，各10只，以可操作的藥物最高濃度、最大給藥容積(0.8 ml/100 g b.w.)于24 h內(nèi)灌胃2次，給藥時間間隔6 h，給藥總量為34.0 g/kg b.w.，連續(xù)觀察2周，并記錄動物中毒癥狀及死亡情況。

1.3.2大鼠90 d亞慢性毒性試驗。瑞鮑迪甙A經(jīng)飼料加工廠制作成藥料，飼喂90 d。瑞鮑迪甙A分為20、4和1 g/kg(分別相當(dāng)于100倍、20倍和5倍推薦劑量)3個劑量組；正常對照組飼喂大鼠常規(guī)飼料。Wistar大鼠隨機分為4個組，每組20只，公母各半。試驗期間觀察大鼠的一般行為及飲食，每周稱量體重和飼料消耗。分別在喂養(yǎng)45和90 d時進行大體解剖，每組10只大鼠(雌雄各5只)，分別取抗凝血進行血液細(xì)胞學(xué)檢測；血清樣品進行谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHO)、葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)等血液生化指標(biāo)的檢測；并稱量心、肝、脾、肺、腎、卵巢子宮、睪丸附睪的重量，計算臟器系數(shù)；對肝、腎、脾、肺、十二指腸、睪丸、子宮等主要臟器進行組織病理學(xué)檢查[10]。

1.4 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件處理，統(tǒng)計學(xué)分析采用ANOVA檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗瑞鮑迪甙A大鼠給藥總量為34.0 g/kg b.w.、小鼠給藥總量達(dá)45.0 g/kg b.w.時，大、小鼠精神狀態(tài)均良好、毛色光潔、活動自如，呼吸、飲食欲、糞便正常。試驗組大鼠及小鼠均未出現(xiàn)死亡，亦未出現(xiàn)與給藥相關(guān)的異常反應(yīng)。給藥第14天后，對所有動物進行剖檢，未見明顯的異常。瑞鮑迪甙A對大鼠的經(jīng)口LD50>34.0 g/kg b.w.，對小鼠的經(jīng)口LD50>45.0 g/kg b.w.。根據(jù)WHO對化學(xué)物質(zhì)毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，瑞鮑迪甙A屬于實際無毒級別物質(zhì)。

2.2 亞慢性毒性試驗試驗期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)瑞鮑迪甙A試驗組大鼠有異常行為和表現(xiàn)。除了喂養(yǎng)90 d時高劑量組總蛋白(TP)和總膽固醇(CHO)低于正常對照組(P<0.05)外，瑞鮑迪甙A各劑量組大鼠的采食、體重增重、臟器系數(shù)、血液學(xué)指標(biāo)與正常對照組比較無明顯差異(P>0.05);大體解剖及肝、腎、脾、胃腸、睪丸、卵巢等組織病理學(xué)檢查均未發(fā)現(xiàn)異常(表1～8)?？梢?，瑞鮑迪甙A在1～20 g/kg添加水平，喂養(yǎng)Wistar大鼠90 d時，未表現(xiàn)出明顯的有害作用。

表1 喂養(yǎng)90 d內(nèi)瑞鮑迪甙A對大鼠飼料消耗的影響(n=10) g

表2 喂養(yǎng)90 d內(nèi)瑞鮑迪甙A對大鼠增重的影響 g/(只·d)

表3 大鼠45 d喂養(yǎng)試驗后瑞鮑迪甙A對血液細(xì)胞學(xué)指標(biāo)的影響(n=10)

注：WBC為白細(xì)胞；NEU為中性白細(xì)胞；LYMPH為淋巴細(xì)胞；MONO為單核細(xì)胞；EO為嗜酸性粒細(xì)胞；BASO為嗜堿性粒細(xì)胞；RBC為紅細(xì)胞；HGB為血紅蛋白；HCT為紅細(xì)胞壓積；PLT為血小板。

表4 大鼠90 d喂養(yǎng)試驗后瑞鮑迪甙A對血液細(xì)胞學(xué)指標(biāo)的影響(n=10)

注：WBC為白細(xì)胞；NEU為中性白細(xì)胞；LYMPH為淋巴細(xì)胞；MONO為單核細(xì)胞；EO為嗜酸性粒細(xì)胞；BASO為嗜堿性粒細(xì)胞；RBC為紅細(xì)胞；HGB為血紅蛋白；HCT為紅細(xì)胞壓積；PLT為血小板。

表5 喂養(yǎng)45 d時瑞鮑迪甙A對大鼠血液生化指標(biāo)的影響(n=10)

注：ALT為谷丙轉(zhuǎn)氨酶；AST為谷草轉(zhuǎn)氨酶；TG為甘油三酯；CHO為總膽固醇；Glu為葡萄糖； TP為總蛋白；ALB為白蛋白； BUN為血尿素氮；CRE為肌酐。

表6 喂養(yǎng)90 d時瑞鮑迪甙A對大鼠血液生化指標(biāo)的影響(n=10)

注：ALT為谷丙轉(zhuǎn)氨酶；AST為谷草轉(zhuǎn)氨酶；TG為甘油三酯；CHO為總膽固醇；Glu為葡萄糖； TP為總蛋白；ALB為白蛋白； BUN為血尿素氮；CRE為肌酐。*與正常對照組比較，P﹤0.05。

表7 喂養(yǎng)45 d時瑞鮑迪甙A對大鼠臟器系數(shù)的影響 (n=10) %

注：卵巢和睪丸的數(shù)據(jù)是5個老鼠的平均值，其他數(shù)據(jù)均為10個的平均值。

表8 喂養(yǎng)90 d時瑞鮑迪甙A對大鼠臟器系數(shù)的影響(n=10) %

注：卵巢和睪丸的數(shù)據(jù)是5個老鼠的平均值，其他數(shù)據(jù)均為10個的平均值。

3 結(jié)論

該試驗研究瑞鮑迪甙A對大小鼠的急性毒性和亞慢性毒性，其中，急性毒性試驗采用灌胃給予；亞慢性毒性試驗中，瑞鮑迪甙A以20、4和1 g/kg拌料給予大鼠90 d，每周稱量大鼠體重和飼料消耗，并在喂養(yǎng)45和90 d時剖檢，分別進行血液細(xì)胞學(xué)和血液生化指標(biāo)檢測，計算主要臟器系數(shù)以及進行相應(yīng)的組織病理學(xué)檢查。結(jié)果表明，瑞鮑迪甙A對大、小鼠的經(jīng)口LD50分別大于34.0和45.0 g/kg b.w.；亞慢性毒性試驗各劑量組大鼠的采食、體重、臟器系數(shù)、血液細(xì)胞學(xué)及血液生化指標(biāo)、大體解剖及組織病理學(xué)檢查結(jié)果與正常對照組比較無明顯差異(P>0.05)；瑞鮑迪甙A在1～20 g/kg添加水平，對Wistar大鼠亞慢性毒性試驗未表現(xiàn)出明顯的有害作用。根據(jù)急性毒性試驗LD50數(shù)據(jù)及WHO對化學(xué)物質(zhì)毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，瑞鮑迪甙A屬于實際無毒級別物質(zhì)。在目前研究的基礎(chǔ)上，瑞鮑迪甙A作為甜味劑飼料添加劑是可行性的。

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Studies on the Acute and Sub-chronic Toxicity of Rebaudioside A

LI Nan1, WANG Jian-ming1,2,ZHOU Ze-wei1,ZHANG Yu-mei1,2*et al

(1.College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu 225009;2.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou, Jiangsu 225009)

[Objective]To evaluate the safety of rebaudioside A sweetener used as feed additives, the oral acute toxicity and sub-chronic toxicity tests to mice and rats were studied. [Method]Acute toxicity tests were administered orally.Rebaudioside A was administered with mixture of feedstuffs for 90 d at doses of 20, 4, 1 g/kg to rats in sub-chronic toxicity test. The weight and feed consumption were measured every week. The hematological and biochemical examination, organ coefficient and histopathologic analysis were made at 45 th and 90 th day of test period.[Result]The oralLD50values of rebaudioside A to rats and mice were more than 34.0 and 45.0 g/kg b.w. respectively. The sub-chronic toxicity test indicated that there were no significant difference in feed intake, body weight, organ coefficient, hematological index, blood biochemical parameters, gross anatomy and histopathology between these tested groups and normal control.[Conclusion]The rebaudioside A was belong to nontoxic grade substanct and appeared no obvious sub-chronic toxicity.

Rebaudioside A; Acute toxicity; Sub-chronic toxicity

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目；揚州大學(xué)“新世紀(jì)人才”工程。

李楠(1991- )，男，江蘇大豐人，碩士研究生，研究方向：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)。*通訊作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究。

2014-11-27

S 567

A

0517-6611(2015)02-103-03