水華魚(yú)腥藻類(lèi)菌胞素氨基酸的分子鑒定和化學(xué)檢測(cè)

劉 洋高合意李效宇李仁輝

(1. 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 新鄉(xiāng) 453007; 2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072)

水華魚(yú)腥藻類(lèi)菌胞素氨基酸的分子鑒定和化學(xué)檢測(cè)

劉 洋1高合意2李效宇1李仁輝2

(1. 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 新鄉(xiāng) 453007; 2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072)

類(lèi)菌胞素氨基酸 (MAAs) 是一類(lèi)具有吸收紫外線能力的物質(zhì), 藍(lán)藻MAAs的生物合成及其分子機(jī)制的揭示為 MAAs基因的快速檢測(cè)提供了可能。研究采用分子生物學(xué)方法擴(kuò)增了一株分離自太湖的水華魚(yú)腥藻(Dolichospermum flos-aquae CHAB1629)編碼脫氫醌合成酶(DHQS)基因的部分片段, 系統(tǒng)樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)其與報(bào)道的Anabaena sp. 90核酸序列相似度達(dá)99%, 而與Anabaena variabilis ATCC 29413僅為53.6%; 同時(shí)運(yùn)用HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 該株水華魚(yú)腥藻MAAs的類(lèi)型為shinorine。研究結(jié)果可為后續(xù)浮游類(lèi)魚(yú)腥藻MAAs的分子鑒定及野外適應(yīng)性研究提供依據(jù)。

藍(lán)藻; 水華魚(yú)腥藻; 類(lèi)菌胞素氨基酸; 高效液相色譜

類(lèi)菌胞素氨基酸(Mycosporine-Like Amino Acids, MAAs)是一大類(lèi)以環(huán)己烯酮為基本骨架、與不同類(lèi)型氨基酸縮合形成的水溶性物質(zhì), 共軛雙鍵的結(jié)構(gòu)特征以及側(cè)鏈的活性基團(tuán)決定了其具有強(qiáng)紫外(310—360 nm)吸收的能力(圖1)[1,2]。MAAs在自然界分布廣泛, 從早期在真菌中發(fā)現(xiàn)至今(Leach 1965), 已在多種浮游植物類(lèi)群中發(fā)現(xiàn), 如藍(lán)藻、紅藻等。同時(shí)MAAs的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣, 目前已發(fā)現(xiàn)了近30種, 2013年, Nazifi等[3]和Miyamoto等[4]報(bào)道在地木耳(Nostoc commune)中新發(fā)現(xiàn)了兩種不同類(lèi)型的MAAs。研究表明, MAAs還具有光保護(hù)和抗氧化、防止珊瑚漂白、調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、調(diào)節(jié)休眠體細(xì)胞形成及萌發(fā)、增強(qiáng)細(xì)胞耐受干旱和高溫等多種作用, 其主要的抗紫外作用已被應(yīng)用于相關(guān)護(hù)膚品的商業(yè)開(kāi)發(fā)[1,5]。雖然MAAs較早就被發(fā)現(xiàn), 然而其生物合成機(jī)制的研究較為滯后, 1999年Shick[6]對(duì)產(chǎn)MAAs珊瑚的草甘膦抑制實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了 MAAs的莽草酸合成途徑; 隨后Balskus 和 Walsh[1]揭示了藍(lán)藻 MAAs合成的分子機(jī)制, 他們?cè)贏nabaena variabilis ATCC 29413中確定了shinorine 合成酶基因簇全長(zhǎng)(6.5 kb), 包含了4個(gè) ORFs, 分別負(fù)責(zé)編碼脫氫醌合成酶(DHQS),甲基轉(zhuǎn)移酶(O-MT), ATP-grasp和NRPS-like酶, 其中 DHQS是合成途徑的關(guān)鍵酶, 負(fù)責(zé)催化 3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸生成3-Dehydroquinate[7,8]。MAAs合成分子機(jī)制的揭示為 MAAs基因快速檢測(cè)提供了可能。

圖1 兩種代表性MAAs (shinorine and porphyra-334) 的結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Structures of representative MAAs (shinorine and porphyra-334)

目前已報(bào)道含有MAAs的藍(lán)藻有20多個(gè)屬, 雖然它們分布廣泛, 但不同種類(lèi)的藍(lán)藻MAAs差異較大[5,9]。Singh對(duì) A. variabilis PCC 7937和 Synechocystis sp. PCC 6803研究發(fā)現(xiàn), 前者能產(chǎn)生MAAs, 而后者卻不產(chǎn)[7]。盡管首先在 A. variabilisATCC 29413中揭示了MAAs合成酶的基因簇全長(zhǎng),但通過(guò)對(duì) GenBank的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn), 魚(yú)腥藻相關(guān)MAAs數(shù)據(jù)較少, 這也許是導(dǎo)致魚(yú)腥藻屬內(nèi)編碼DHQS的基因mysA差異較大的原因。不同種屬間含有的MAAs類(lèi)型也不盡相同。Sinha等[10]對(duì)3株絲狀固氮藍(lán)藻進(jìn)行了研究, 發(fā)現(xiàn)它們僅僅含有shinorine這一種類(lèi)型的MAAs物質(zhì); 我國(guó)學(xué)者對(duì)微囊藻屬的銅綠微囊藻調(diào)查發(fā)現(xiàn), 其含有兩種類(lèi)型的MAAs, 即shinorine和porphyra-334[11], 但對(duì)于我國(guó)常見(jiàn)魚(yú)腥藻水華種類(lèi)所含有 MAAs情況還鮮有報(bào)道。水華魚(yú)腥藻(新近的分類(lèi)學(xué)研究將浮游類(lèi)魚(yú)腥藻屬名Anabaena改為Dolichospermum[12])是水華藍(lán)藻中常見(jiàn)種類(lèi), 分布廣泛, 我國(guó)三湖均有分布。本研究通過(guò)對(duì)水華魚(yú)腥藻MAAs合成中編碼關(guān)鍵酶DHQS的mysA基因進(jìn)行特異引物設(shè)計(jì), 同時(shí)用HPLC檢測(cè)了其含有MAAs的類(lèi)型, 為水華魚(yú)腥藻的生態(tài)適應(yīng)性研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 藻株及培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用藻株為分離自太湖的水華魚(yú)腥藻, 保存于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所有害藻類(lèi)學(xué)科組藻種庫(kù)(CHAB), 培養(yǎng)條件: CT培養(yǎng)基, 光照強(qiáng)度為25 μE/(m2·s), 光周期為 12h∶12h (L∶D), 溫度為(25±1)℃。

1.2 藻株DNA提取、引物設(shè)計(jì)與mysA基因擴(kuò)增

藻株基因組DNA提取方法參考Li 等[13]的方法。通過(guò)對(duì)GenBank中已報(bào)道的Anabaena sp. 90、A. variabilis ATCC 29413、Nostoc punctiforme PCC 73102、Nostoc sp. PCC 7524中DHQS同源蛋白進(jìn)行Blast, 定位其核酸序列, 運(yùn)用 Primer 5.0軟件進(jìn)行mysA基因引物設(shè)計(jì), 正向引物為mysaF (5′-TAACC AATTCATTTCCACAG-3′), 反向引物為 mysaR (5′-TCTCAACTCAGAAGTCAAGG-3′)。PCR反應(yīng)體系為50 μL, 包含5—10 ng 模板DNA, 1U Taq DNA聚合酶(Takara, Japan), 10×PCR反應(yīng)緩沖液 2 μL, 1.5 mmol/L MgCl2, 引物各10 pmol, 200 μmol/L 牛血清蛋白和200 μmol/L dNTPs (deoxyribonucleoside triphosphate), 其余用雙蒸水補(bǔ)足。反應(yīng)體系于 MJ Mini BioRad PCR儀(BioRad, USA)上擴(kuò)增, 擴(kuò)增條件為: 94℃預(yù)變性3min; 94℃變性30s, 50℃退火30s, 72℃延伸 1min, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。經(jīng)過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后, 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收(Biospin膠回收試劑盒), 回收后的DNA連接到載體pMD18-T(Takara, Japan)上, 然后克隆載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E. coli Competent Cells DH5α (Takara, Japan)中, 挑取單克隆菌液送北京華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 序列測(cè)定及系統(tǒng)分析

測(cè)序獲得并經(jīng)人工校正的序列數(shù)據(jù)與 GenBank獲得的外源數(shù)整合后利用CLUSTAL X (version 2.0)進(jìn)行對(duì)位排列[14]。然后運(yùn)用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA 4 program package基于Kimura two-parameter模型構(gòu)建鄰接法分子系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)(Neighbor-Joining tree, 簡(jiǎn)稱(chēng)NJ tree), 步展值(Bootstrap value)設(shè)置為1000, 空位或缺失位點(diǎn)均當(dāng)作配對(duì)刪除(Pairwise deletion)處理[15]。

1.4 藻株MAAs的化學(xué)測(cè)定

取5 mL藻液, 富集后, 用25%甲醇在45℃條件下萃取3次, 取2 mL樣品的甲醇萃取液, 在45℃條件下干燥, 溶入200 μL蒸餾水, 通過(guò)0.2 μm濾膜后進(jìn)行反相高效液相色譜分析(SSI HPLC 1500, USA),色譜柱 Grace Prevail C18規(guī)格 5 μm, 4.6 mm× 250 mm。流動(dòng)相為25%的甲醇加0.2%乙酸, 檢測(cè)波長(zhǎng) 250—450 nm。標(biāo)樣為中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所有害藻類(lèi)實(shí)驗(yàn)室制備, 提取藻株為 Microcystis aeruginosa PCC 7806。

2 結(jié)果

2.1 水華魚(yú)腥藻mysA基因擴(kuò)增及系統(tǒng)樹(shù)分析

通過(guò)PCR檢測(cè)我們得到了一株含有mysA基因片段的藻株(D. flos-aquae CHAB1629), 克隆測(cè)序后得到約 859 bp的目的片段, 通過(guò)在 GenBank中對(duì)DHQS酶同源蛋白分析, 進(jìn)一步確定了其為編碼此蛋白的 mysA基因片段。目前, 數(shù)據(jù)庫(kù)中藍(lán)藻相關(guān)mysA數(shù)據(jù)較少, 本研究對(duì)GenBank和EMBL兩大數(shù)據(jù)庫(kù)中完成全基因組測(cè)序的 12株念珠藻科藻株進(jìn)行mysA數(shù)據(jù)挖掘, 以M. aeruginosa PCC 7806為外類(lèi)群構(gòu)建了NJ系統(tǒng)樹(shù)(圖2), 結(jié)果表明, mysA基因在念珠藻科內(nèi)部變異較大, Cylindrospermum stagnale PCC 7417、Nodularia spumigena CCY9414、Nostoc punctiforme PCC 73102、Nostoc sp. PCC 7524、A. variabilis ATCC 29413、Anabaena sp. 90這5株藻mysA基因最大相似度僅為82%, 而同為魚(yú)腥藻屬的A. variabilis ATCC 29413和Anabaena sp. 90其mysA基因最大相似度僅為53.6%。本研究分離的D. flos-aquae CHAB1629與 Anabaena sp. 90及Aphanizomenon flos-aquae NIES-81間的最大相似度分別為99%和97.2%。

2.2 水華魚(yú)腥藻中含有MAAs物質(zhì)的HPLC檢測(cè)

對(duì)含有 mysA基因片段的藻株 D. flos-aquae CHAB1629進(jìn)行了HPLC化學(xué)檢測(cè), 通過(guò)與標(biāo)樣的的保留時(shí)間比較分析, 鑒定了本藻株含有的 MAAs的類(lèi)型為shinorine(圖3)。

圖2 基于mysA 基因序列的NJ分子系統(tǒng)樹(shù) (節(jié)點(diǎn)處的數(shù)字代表1000重復(fù)步展值的百分?jǐn)?shù), 低于50% 的未顯示)Fig. 2 The phylogenetic tree (NJ) based on mysA sequences (The numbers at each node represented the percentage of bootstrap setting as 1000, only showing those above 50%)

圖3 MAAs的HPLC檢測(cè)Fig. 3 MAAs detection by HPLC

3 討論

在長(zhǎng)期的自然進(jìn)化與選擇過(guò)程中, 生物有機(jī)體形成了多種應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的保護(hù)機(jī)制, 如部分生物在體內(nèi)合成和積累MAAs來(lái)抵抗紫外線的損傷, 便是這些機(jī)制中較為重要的一種。藍(lán)藻作為地球上較早出現(xiàn)的原核生物, 同樣具有合成 MAAs的能力,不僅如此, 藍(lán)藻體內(nèi)具有紫外吸收的物質(zhì)還有偽枝藻素(Scytonemin)、類(lèi)胡蘿卜素(Carotenoids)、糖苷蝶呤(Biopterin glucoside)等[9,16]。雖然MAAs的化學(xué)結(jié)構(gòu)和抗紫外特性很早就被認(rèn)識(shí), 然而其生物合成及其分子機(jī)制直到最近才被揭示。通過(guò)對(duì)A. variabilis ATCC 29413研究, 發(fā)現(xiàn)了編碼MAAs的4個(gè)基因(mysA、B、C、D), 分別編碼 DHQS、O-MT、ATP-grasp和NRPS-like 4個(gè)酶, 并且發(fā)現(xiàn)A. variabilis ATCC 29413與Nostoc punctiforme ATCC 29133中MAAs合成基因中的前3個(gè)較為保守, 而第4個(gè)基因編碼的酶為 NRPS-like或者 D-Ala D-Ala ligase-like, 并且這兩種藍(lán)藻含有的 MAAs均為shinorine。然而并非所有藍(lán)藻均含有相同的MAAs、Nodularia baltica、Nodularia harveyana和Nodularia spumigena 3種節(jié)球藻所含 MAAs為 shinorine和porphyra-334[16,17], 有些藍(lán)藻卻不含有 MAAs, 如Synechocystis sp. PCC 6803 和 Synechococcus sp. PCC 6301。有關(guān)微囊藻中 MAAs的檢測(cè)已有報(bào)道,而對(duì)于另一種藍(lán)藻水華群體—水華魚(yú)腥藻的研究較少。本研究針對(duì)水華魚(yú)腥藻群體, 設(shè)計(jì)了檢測(cè)其mysA基因的引物, 并且對(duì)其片段進(jìn)行擴(kuò)增和系統(tǒng)分析, 發(fā)現(xiàn)水華魚(yú)腥藻 mysA基因片段與預(yù)想情況并不相同, 其編碼區(qū)域差異較大, 這也許跟數(shù)據(jù)量有關(guān)。通過(guò)對(duì)GenBank和EMBL中報(bào)道的念珠藻科的12株全基因組進(jìn)行分析, 構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù), 發(fā)現(xiàn)我國(guó)的水華魚(yú)腥藻D. flos-aquae CHAB1629與Anabaena sp. 90較為相近, 而與 A. variabilis ATCC 29413、Anabaena cylindrica PCC 7122和Anabaena sp. PCC 7108差異較大。推測(cè)可能的原因有兩種: 一是在魚(yú)腥藻屬內(nèi)部基于 mysA基因確實(shí)分為幾個(gè)類(lèi)群, 二是由于序列數(shù)據(jù)較少, 并且是通過(guò)同源蛋白比對(duì)后預(yù)測(cè)片段, 僅有少數(shù)藻株被化學(xué)驗(yàn)證可產(chǎn)生 MAAs,而其他藻株是否能夠產(chǎn)生MAAs, 還需要化學(xué)驗(yàn)證。因此通過(guò)基因的初步篩查和化學(xué)檢測(cè), 才能較為準(zhǔn)確的判定藻株含有MAAs情況。同時(shí), 結(jié)合化學(xué)方法, 本研究檢測(cè)了 D. flos-aquae CHAB1629含有MAAs的類(lèi)型(shinorine), 這與先前報(bào)道的我國(guó)銅綠微囊藻所含有的MAAs類(lèi)型較為相似。但推測(cè)本藻株含有的類(lèi)型不止一種(可能含有 porphyra-334)這需要獲取標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)一步研究。由于本研究中的藻株較少, 還不能代表眾多浮游魚(yú)腥藻類(lèi)群的情況, 因此需要大量分離我國(guó)野外水體中不同種類(lèi)的魚(yú)腥藻進(jìn)行深入研究, 評(píng)估其產(chǎn)MAAs能力及其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。本研究結(jié)果可為后續(xù)浮游類(lèi)魚(yú)腥藻 MAAs的分子鑒定提供參考。

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IDENTIFICATION AND DETERMINATION OF MYCOSPORINE-LIKE AMINO ACIDS (MAAS) IN DOLICHOSPERMUM FLOS-AQUAE

LIU Yang1, GAO He-Yi2, LI Xiao-Yu1and LI Ren-Hui2
(1. College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China; 2. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

Mycosporine-like aminoacids (MAAs) exist in cyanobacteria, fungi, and eukaryotic micro- and macro-algae. They absorb ultraviolet (UV) and hence protect these organisms from the damages caused by the environmental UV radiation. The understanding of the biosynthetic pathway and the genetic properties of MAAs is fundamental for the fast-detection of MAAs genes. In the present study, we amplified the partial coding sequence of the gene encoding DHQS enzyme in Dolichospermum flos-aquae CHAB1629 that was isolated from the Taihu Lake. The nucleotide similarity between D. flos-aquae CHAB1629 and Anabaena sp. 90 was 99%, and it was only 53.6% between D. flos-aquae CHAB1629 and Anabaena variabilis ATCC 29413. High-performance liquid chromatography (HPLC) assays confirmed that MAAs in D. flos-aquae CHAB1629 were shinorine.

Cyanobacteria; Dolichospermum flos-aquae; MAAs; HPLC

Q943.2

A

1000-3207(2015)03-0549-05

10.7541/2015.72

2014-06-24;

2014-11-25

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(31400395); 國(guó)家博士后科學(xué)基金(2014M552006); 河南省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目(144300510046); 河南師范大學(xué)博士基金(qd13034)資助

劉洋(1983—), 男, 河南新鄉(xiāng)人; 講師; 主要從事藍(lán)藻分子生態(tài)學(xué)研究。E-mail: liuyang6368@126.com

李仁輝(1965—), 研究員; 主要從事藍(lán)藻分類(lèi)系統(tǒng)以及藻類(lèi)環(huán)境生物學(xué)研究。E-mail: reli@ihb.ac.cn