基于線粒體控制區(qū)的中華絨螯蟹群體遺傳多樣性分析

閆 龍宋 娜王 俊鹿志創(chuàng)高天翔

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所, 青島 266003; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 青島 266002; 3. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院, 大連 116000; 4. 浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院, 舟山 316022)

基于線粒體控制區(qū)的中華絨螯蟹群體遺傳多樣性分析

閆 龍1宋 娜1王 俊2鹿志創(chuàng)3高天翔4

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所, 青島 266003; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 青島 266002; 3. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院, 大連 116000; 4. 浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院, 舟山 316022)

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis H. Milne Edwards)隸屬于十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae)、絨螯蟹屬(Eriocheir), 廣泛分布于我國(guó)沿海各大水系[1]。中華絨螯蟹肉味鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高, 是我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)物種。目前, 中華絨螯蟹的增殖放流和水產(chǎn)養(yǎng)殖等生產(chǎn)活動(dòng)的開(kāi)展已造成不同水系種質(zhì)資源嚴(yán)重混雜[2,3]。因此, 為深入了解不同水系中華絨螯蟹的遺傳特征和種質(zhì)差異, 有效管理利用和保護(hù)中華絨螯蟹資源, 對(duì)不同水系中華絨螯蟹的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)研究勢(shì)在必行。

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究生物的遺傳變異提供了有效的手段。進(jìn)化速度快、較小的基因組、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單而穩(wěn)定、世代傳遞過(guò)程中幾乎不發(fā)生重組、無(wú)組織特異性、單性母系遺傳等特征使線粒體DNA(mtDNA)成為進(jìn)化和群體遺傳學(xué)研究的有效標(biāo)記[4,5]。線粒體DNA控制區(qū)(D-loop)因缺乏編碼選擇壓力而成為線粒體基因組中進(jìn)化速率最快的基因, 比線粒體PNA其他基因片段更適合用于種間或種下水平的遺傳學(xué)研究[6,7]。

目前, 國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)中華絨螯蟹的形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)開(kāi)展了大量研究。形態(tài)學(xué)方面, 有學(xué)者運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)方法對(duì)中國(guó)沿海不同水域中華絨螯蟹的形態(tài)差異進(jìn)行研究[8,9],唐伯平等[10]基于光鏡和掃描電鏡對(duì)中華絨螯蟹的觸角形態(tài)特征進(jìn)行了研究; 遺傳學(xué)方面, Sui等[11]以及Xu和Chu[12]分別運(yùn)用微衛(wèi)星(SSR)和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)核基因標(biāo)記對(duì)國(guó)內(nèi)各大水系的中華絨螯蟹開(kāi)展了群體遺傳學(xué)分析; 另有諸多學(xué)者運(yùn)用線粒體COⅠ、Cyt b等基因片段對(duì)中華絨螯蟹開(kāi)展了群體遺傳學(xué)研究[13-15]。迄今, 尚未見(jiàn)mtDNA控制區(qū)序列在中華絨螯蟹群體遺傳學(xué)研究中的報(bào)道。本研究采用mtDNA控制區(qū)高變區(qū)序列對(duì)中華絨螯蟹四個(gè)野生群體的遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)展開(kāi)研究, 以揭示不同水系中華絨螯蟹的遺傳差異,探討其遺傳多樣性水平, 為中華絨鰲蟹資源的合理開(kāi)發(fā)利用與保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用中華絨螯蟹樣品于1999年 7月至 2013年 10月間分別采自丹東(DD)、盤(pán)錦(PJ)、墾利(KL)、南京(NJ), 采用地點(diǎn)如圖1所示。另外, 我們還采集了廣西北海合浦絨螯蟹(Eriocheir hepuensis)19個(gè)個(gè)體作為外群來(lái)進(jìn)行比較分析。樣品采樣方式為天然水域抓捕或地籠網(wǎng)捕捉, 新鮮或冷凍樣品送至中國(guó)海洋大學(xué)漁業(yè)生態(tài)實(shí)驗(yàn)室低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 中華絨螯蟹采樣地點(diǎn)Fig. 1 Sampling sites of E. sinensis

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

取中華絨螯蟹螯足肌肉組織約100 mg, 經(jīng)細(xì)胞裂解液STE和蛋白酶K完全消化, 采用酚-氯仿抽提法提取基因組DNA, 100 μL超純水溶解, 4℃保存。

根據(jù)GenBank發(fā)布的中華絨螯蟹線粒體基因組全序列[16]設(shè)計(jì)中華絨螯蟹和合浦絨螯蟹控制區(qū)高變區(qū)引物序列為YL-F: 5′-ACGTAACTGAAATGCTGTTC-3′和YL-R: 5′-ACCCGTTTCCCCTCTAGAGGA-3′。PCR反應(yīng)體系為25 μL, 包括: 基因組DNA(20 ng), 1.25 U Taq DNA聚合酶(大連寶生物工程有限公司), 200 nmol/L的正反向引物, 200 μmol/L的每種dNTP, 10 mmol/L Tris pH 8.3, 50 mmol/L KCl和1.5 mmol/L MgCl2(大連寶生物工程有限公司)。PCR循環(huán)參數(shù)為: 95℃預(yù)變性5min, 95℃變性45s, 50℃退火50s, 72℃度延伸1min, 循環(huán)35次, 然后72℃后延伸10min。所有PCR均在Biometra熱循環(huán)儀上完成。每組PCR均設(shè)陰性對(duì)照用來(lái)檢測(cè)是否存在污染, 取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 用UNIQ-10柱式DNA凝膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化, 然后送生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用DNAStar(DNASTAR, inc, Madison, USA)軟件包對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)排序并輔以人工校正。運(yùn)用MEGA4.0[17]計(jì)算序列的堿基組成、多態(tài)性、序列間的轉(zhuǎn)換顛換比。利用 PAUP和 Modeltest3.7[18]軟件篩選核苷酸最佳替代模型并計(jì)算不同位點(diǎn)間異質(zhì)性的gamma分布性狀參數(shù)。以合浦絨螯蟹為外群, 基于模型篩選所得參數(shù)在 MEGA4.0軟件中構(gòu)建 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 系統(tǒng)樹(shù)的可靠性采用 1000次重抽樣評(píng)估。利用Arlequin3.0[19]軟件計(jì)算單倍型數(shù)、單倍型多樣度、核苷酸多樣度等遺傳學(xué)參數(shù); 計(jì)算兩兩群體間的遺傳分化指數(shù) FST值, 并進(jìn)行分子差異分析(AMOVA)和確切P檢驗(yàn), 以評(píng)估中華絨螯蟹的群體遺傳結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 序列組成與變異分析

對(duì)4個(gè)群體共84個(gè)中華絨螯蟹個(gè)體擴(kuò)增后所得目的片段長(zhǎng)度為 475 bp, 其中包括 18 bp的 tRNA序列和457 bp的控制區(qū)高變區(qū)序列。18 bp的tRNA序列內(nèi)無(wú)變異位點(diǎn), 457 bp的控制區(qū)高變區(qū)共檢測(cè)到58個(gè)多態(tài)位點(diǎn), 31個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn), 47處轉(zhuǎn)換和9處顛換(轉(zhuǎn)換顛換比為5.2), 同時(shí)有 8處插入/缺失。在堿基組成上, A+T含量(81.58%)明顯高于G+C含量(18.42%)。58個(gè)多態(tài)位點(diǎn)定義了41個(gè)單倍型, 包括28個(gè)獨(dú)有單倍型和13個(gè)共享單倍型。共享單倍型中6個(gè)單倍型被兩個(gè)以上群體的個(gè)體所共享。Hap.16是分布最普遍的單倍型, 被三個(gè)群體的 13個(gè)個(gè)體共享, 丹東群體和南京群體之間沒(méi)有出現(xiàn)共享單倍型(表2)。合浦絨螯蟹與中華絨螯蟹在線粒體控制區(qū)序列上存在較大差異。19個(gè)合浦絨螯蟹的目的片段長(zhǎng)度為476 bp, 在18 bp的tRNA序列內(nèi)也無(wú)變異位點(diǎn), 在458 bp的控制區(qū)高變區(qū)序列共檢測(cè)到55個(gè)多態(tài)位點(diǎn), 定義了19個(gè)單倍型, 其中包括 44處轉(zhuǎn)換和2處顛換, 轉(zhuǎn)換顛換比為22, 同時(shí)有9處插入/缺失。在堿基組成上, A+T含量(80.13%)明顯高于G+C含量(19.87%)。兩種絨螯蟹控制區(qū)的A+T含量均高于G+C, 但中華絨螯蟹的G+C含量更低。

總體來(lái)看, 中華絨螯蟹遺傳多樣性處于較高水平,單倍型多樣度、核苷酸多樣度平均值分別為 0.958±0.010和0.016±0.009(表1)。南京群體的單倍型多樣度為0.848± 0.070, 核苷酸多樣度為 0.010±0.006, 略低于其他三個(gè)群體。四個(gè)群體遺傳多樣性水平從高到低依次為: 墾利＞盤(pán)錦＞丹東＞南京。合浦絨螯蟹的單倍型多樣度為1.000±0.017,核苷酸多樣度為0.027±0.014, 均高于中華絨螯蟹。

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

兩兩群體間遺傳分化指數(shù) FST值顯示: 丹東群體與其他群體間FST值較大, 且經(jīng)Bonferroni校正后差異均顯著(P＜0.05); 盤(pán)錦群體與其他群體間 FST值較小, 經(jīng)Bonferroni校正后差異顯著(P＜0.05); 墾利群體和南京群體之間FST值最小, 且差異不顯著(P＞0.05)(表3)。將所有群體作為一個(gè)組群進(jìn)行 AMOVA分析的結(jié)果顯示: 組內(nèi)

群體間遺傳差異極顯著(ΦST=0.0681, P=0)。為進(jìn)一步檢測(cè)群體遺傳結(jié)構(gòu), 運(yùn)用確切 P檢驗(yàn)來(lái)揭示群體間是否存在隨機(jī)交配現(xiàn)象。在 0.05置信水平下, 除墾利群體和南京群體之間存在隨機(jī)交配現(xiàn)象外, 其他兩兩群體間都不存在隨機(jī)交配(P＜0.05)(表3)。以上結(jié)果均表明: 丹東群體與其他三個(gè)群體間存在中度且顯著的遺傳分化, 盤(pán)錦群體與墾利、南京群體間存在微弱但顯著的遺傳分化, 墾利群體和南京群體之間遺傳差異最小且不顯著。

表1 中華絨螯蟹各群體的采樣信息和遺傳多樣性參數(shù)Tab. 1 The sample information and genetic diversity parameters of different populations for E. sinensis

表2 中華絨螯蟹單倍型在不同群體間分布情況Tab. 2 Distribution of haplotype of populations of E. sinensis

表3 中華絨螯蟹群體間的遺傳分化指數(shù)(下對(duì)角線)和確切P值(上對(duì)角線)Tab. 3 Pairwise FST(below diagonal) and exact P values (above diagonal) among E. sinensis populations

通過(guò)PAUP和Modeltest軟件計(jì)算得到中華絨螯蟹控制區(qū)的核苷酸最佳替代模型為 TVM+I+G(I=0.54, G=0.97)。以合浦絨螯蟹為外群, 基于篩模型所得參數(shù)構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示: 中華絨螯蟹鄰接關(guān)系樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單, 沒(méi)有檢測(cè)到與采樣地點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的分支,不存在顯著的譜系結(jié)構(gòu)(圖 2)。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖與 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果一致, 也沒(méi)有出現(xiàn)與地理分布相對(duì)應(yīng)的譜系結(jié)構(gòu)(圖3)。

圖2 中華絨螯蟹單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig. 2 Reduced median-network showing genetic relationship in E. sinensis

3 討論

遺傳多樣性的高低是評(píng)價(jià)物種對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力和物種進(jìn)化潛力的重要依據(jù)。遺傳多樣性越豐富, 物種對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強(qiáng), 遺傳多樣性的貧乏會(huì)導(dǎo)致物種低的進(jìn)化適應(yīng)性, 使得物種易于遭受生態(tài)環(huán)境改變的影響[20]。種群遺傳結(jié)構(gòu)是指遺傳多樣性在種內(nèi)和種間的分布, 即遺傳分化。掌握種群的遺傳結(jié)構(gòu)可以明確物種在分布范圍內(nèi)是否存在隨機(jī)交配, 確定物種的管理單元[21]。20世紀(jì)70年代以來(lái), 隨著河蟹養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展, 商品蟹流通、養(yǎng)殖親蟹移植等人為因素打破了各水系中華絨螯蟹天然分布格局, 導(dǎo)致不同水系中華絨螯蟹種質(zhì)資源混雜、退化情況越來(lái)越嚴(yán)重[22—24]。因此, 準(zhǔn)確了解中華絨螯蟹的遺傳多樣性水平和群體遺傳結(jié)構(gòu)可以為其資源的可持續(xù)利用與保護(hù)提供依據(jù)。

圖3 基于鄰接法構(gòu)建的中華絨螯蟹系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree in E. sinensis based on neighbor joining method

本研究結(jié)果表明, 中華絨螯蟹的控制區(qū)序列的堿基組成與三疣梭子蟹[25]以及合浦絨螯蟹一致, 都表現(xiàn)出A+T含量明顯偏高的特點(diǎn)。核苷酸多樣度是衡量線粒體DNA遺傳多樣性的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究中丹東、盤(pán)錦、墾利三個(gè)群體的核苷酸多樣度處于較高水平, 南京群體的核苷酸多樣度明顯低于其他三個(gè)群體, 但維持在中等水平。運(yùn)用Cyt b基因的研究結(jié)果也表明南京中華絨螯蟹的核苷酸多樣度明顯低于其他水系[26]。這可能與長(zhǎng)江水系中華絨螯蟹過(guò)度捕撈利用有關(guān), 長(zhǎng)期的過(guò)度捕撈和水體污染、生境破壞等造成中華絨螯蟹有效種群數(shù)量減少,可能經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)[27,28], 導(dǎo)致南京群體核苷酸多樣度低于其他群體。

有關(guān)中華絨螯蟹群體的遺傳多樣性研究報(bào)道較多,運(yùn)用不同分子標(biāo)記得到的結(jié)果有所差異。運(yùn)用AFLP、RAPD等的研究表明中華絨螯蟹的遺傳多樣性處于較低水平[12,14,29]; 而運(yùn)用微衛(wèi)星和Cyt b的研究表明中華絨螯蟹的遺傳多樣性水平較高[11,13]。本研究結(jié)果支持中華絨螯蟹遺傳多樣性處于較高水平的結(jié)論。本研究4個(gè)中華絨螯蟹群體的單倍型多樣度水平均較高, 南京群體的單倍型多樣度雖略低于其他三個(gè)群體, 但差異不明顯。中華絨螯蟹廣泛分布于中國(guó)沿海各大水系且具有較強(qiáng)的繁殖力和環(huán)境適應(yīng)能力, 大的有效群體可能是造成中華絨螯蟹遺傳多樣性水平較高的原因。另外, 多年來(lái)不同水系中華絨螯蟹之間頻繁的基因交流在加劇了各水系中華絨螯蟹混雜的同時(shí)[23—25], 也可能在一定程度上提高了中華絨螯蟹的遺傳多樣性。

Sui等[11]和Chang等[30]運(yùn)用SSR對(duì)中華絨螯蟹群體遺傳學(xué)度研究表明: 遼河水系與黃河水系、長(zhǎng)江水系中華絨螯蟹群體之間存在顯著的遺傳差異, 而黃河水系與長(zhǎng)江水系中華絨螯蟹群體間遺傳差異不明顯。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相近, 除墾利與南京中華絨螯蟹群體間遺傳分化不顯著外, 其他兩兩群體之間都存在不同程度的遺傳差異。中華絨螯蟹有限的擴(kuò)散能力和不同群體沿岸距離較遠(yuǎn)可能是造成群體間產(chǎn)生顯著遺傳分化的主要原因。雖然中華絨螯蟹蚤狀幼體可隨海流沿岸被動(dòng)遷移, 但其蚤狀幼體的浮游期短且中國(guó)沿岸海流流速緩慢[31,32], 可能尚不足以使不同水系中華絨螯蟹群體間產(chǎn)生基因交流[11]。生存環(huán)境的差異和地理隔離使得不同地理群體為適應(yīng)各自環(huán)境而發(fā)生定向變異, 經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期積累而最終出現(xiàn)遺傳分化。雖然四個(gè)中華絨螯蟹群體之間存在一定的遺傳結(jié)構(gòu),但不同地理群體之間還未能積累足夠多的遺傳變異。因此NJ系統(tǒng)樹(shù)和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖均未檢測(cè)到與采樣地點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的譜系結(jié)構(gòu)。商品蟹流通、增殖放流和人工養(yǎng)殖中親蟹及苗種的異地使用可能是導(dǎo)致南京群體和墾利群體間不存在遺傳分化的主要原因。

綜上所述, 丹東、盤(pán)錦、墾利三個(gè)中華絨螯蟹群體的遺傳多樣性均處于較高水平。南京群體的遺傳多樣性略低于其他三個(gè)群體, 需盡快采取措施對(duì)其野生資源進(jìn)行保護(hù), 以實(shí)現(xiàn)資源的可持續(xù)開(kāi)發(fā)。不同水系中華絨螯蟹群體間存在一定程度的遺傳分化, 必須建立科學(xué)有效的監(jiān)督管理體系, 防止盲目的人工移植和引種導(dǎo)致各水系中華絨螯蟹種質(zhì)資源退化和優(yōu)良性狀的丟失, 保證中華絨螯蟹野生資源得到有效保護(hù)和合理開(kāi)發(fā)利用。

致謝:

感謝南京市農(nóng)林局漁政處孫希福在采樣過(guò)程中提供的幫助。感謝李寧博士和李淵在數(shù)據(jù)分析方面給予的幫助。

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STUDIES ON GENETIC DIVERSITY OF CHINESE MITTEN CRAB ERIOCHEIR SINENSIS BASED ON MITOCHONDRIAL DNA CONTROL REGION

YAN Long1, SONG Na1, WANG Jun2, LU Zhi-Chuang3and GAO Tian-Xiang4
(1. Institute of Evolution & Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266002, China; 3. Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116000, China; 4. School of Fishery, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

中華絨螯蟹; 線粒體控制區(qū); 單倍型多樣度; 核苷酸多樣度; 遺傳結(jié)構(gòu); 遺傳多樣性

Chinese mitten crab; mtDNA control region; Haplotype diversity; Nucleotide diversity; Genetic structure; Genetic diversity

Q349+.1

A

1000-3207(2015)03-0615-06

10.7541/2015.81

2014-05-26;

2014-08-25

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303050)資助

閆龍(1988—), 男, 甘肅高臺(tái)人; 碩士; 主要從事水生生物系統(tǒng)發(fā)育與遺傳多樣性研究。E-mail: 307605811@qq.com

高天翔, E-mail: gaotianxiang0611@163.com