中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白基因序列特征及表達(dá)研究

李 偉史 燕趙 建洪孝友朱新平

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510380; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白基因序列特征及表達(dá)研究

李 偉1,2史 燕1趙 建1,2洪孝友1朱新平1,2

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510380; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

轉(zhuǎn)鐵蛋白是呼吸鏈的關(guān)鍵因子, 參與體液和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié), 具有抗菌抗病毒等功能。研究從嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)的中華鱉肝臟SMART cDNA文庫中, 分離克隆了中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白基因cDNA和gDNA全序列,對(duì)其序列特征、組織表達(dá)及原核表達(dá)進(jìn)行了分析研究。結(jié)果顯示, 中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)應(yīng)全長(zhǎng)cDNA的基因組DNA全長(zhǎng)為19100 bp, 由17個(gè)外顯子和16個(gè)內(nèi)含子組成; cDNA全長(zhǎng)為2359 bp, 開放閱讀框?yàn)?2094 bp, 編碼697個(gè)氨基酸; 轉(zhuǎn)鐵蛋白的分子量為76.6 kD, 包含2個(gè)糖基化位點(diǎn), 存在4個(gè)二硫鍵形成區(qū)域的缺失, 兩個(gè)同源結(jié)構(gòu)域的相似性為37%, 信號(hào)肽位于第1—19位點(diǎn)。熒光定量PCR結(jié)果顯示, 正常組中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在肝臟中的表達(dá)量最大; 以嗜水氣單胞菌刺激后, 其在心、肝、脾和腎臟組織中的表達(dá), 均有一個(gè)上調(diào)后減少的趨勢(shì)。此外, 實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了重組轉(zhuǎn)鐵蛋白原核表達(dá)和Western blot 檢測(cè)鑒定, 為深入研究中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白功能的提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

中華鱉; 轉(zhuǎn)鐵蛋白; 序列分析; 組織表達(dá); 原核表達(dá)

中華鱉(Pelodiscus sinensis)是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一[1,2], 2012年養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)3.3×108kg[3]。在養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大過程中, 出現(xiàn)了一些不規(guī)范的養(yǎng)殖方式, 產(chǎn)生一些影響產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸問題, 種質(zhì)混雜、種苗質(zhì)量參差不齊、疾病頻發(fā)等現(xiàn)象普遍存在[4]。近年來, 人們開始重視中華鱉的良種培育,特別是中華鱉抗病優(yōu)良品種的培育。因此, 與中華鱉抗病免疫相關(guān)基因結(jié)構(gòu)與功能的研究也越來越多[5]。

轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrins Tf)分布于動(dòng)物不同器官和組織, 具有不同的生理特性[6], 是細(xì)胞攝入鐵的主要輔助因子之一, 是呼吸鏈的關(guān)鍵因子, 參與體液和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié), 具有氧化還原作用, 還是抑制細(xì)菌繁殖的重要因子[7,8]。目前, 轉(zhuǎn)鐵蛋白在人類(Homo sapiens)、家鼠(Rattus noruegicsu)等哺乳動(dòng)物和魚類中研究報(bào)道較多[7—9], 在龜鱉動(dòng)物中的研究報(bào)道較少, 僅在黃喉擬水龜(Mauremys mutica)、紅耳龜(Trachemys scripta elegans)、綠海龜(Chelonia mydas)中有一些相關(guān)研究[10,11]。中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的相關(guān)研究則尚未見報(bào)道。

近年通過構(gòu)建cDNA文庫來獲取基因全長(zhǎng)序列及進(jìn)行EST分析的方法在生物學(xué)研究領(lǐng)域得到了長(zhǎng)足的發(fā)展及廣泛的應(yīng)用[5,12]。本研究根據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的嗜水氣單胞誘導(dǎo)的中華鱉肝臟全長(zhǎng) cDNA文庫的分析, 選擇了表達(dá)豐度較高的轉(zhuǎn)鐵蛋白基因進(jìn)行研究。在轉(zhuǎn)鐵蛋白 cDNA全長(zhǎng)序列基礎(chǔ)上, 采用PCR及TA克隆方法, 獲得轉(zhuǎn)鐵蛋白gDNA全長(zhǎng)序列, 并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、組織表達(dá)及原核表達(dá)進(jìn)行了研究, 以期為探索中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白在機(jī)體中的免疫機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中華鱉 本實(shí)驗(yàn)所用中華鱉取自綠卡實(shí)業(yè)有限公司(廣東省, 東莞市), 共 33只, 平均體重為(160±16) g, 體表完好健康。隨機(jī)取3只作為空白組, 其他30只隨機(jī)分為5組, 每組6只(其中隨機(jī)3只為對(duì)照組, 其余3只為實(shí)驗(yàn)組)?？瞻捉M不做處理,實(shí)驗(yàn)組腹腔注射500 μL濃度為1010cfu/mL新鮮培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌, 對(duì)照組腹腔注射 500 μL生理鹽水(0.75%), 分別在0、12h、24h、36h和48h采集樣本。

實(shí)驗(yàn)試劑 致病嗜水氣單胞菌菌株, 由珠江水產(chǎn)研究所譚愛萍老師提供。PCR反應(yīng)試劑、感受態(tài)細(xì)胞以及PCR切膠回收試劑盒等均購自廣州合達(dá)生物科技有限公司; 原核表達(dá)、Western-blot試劑、引物合成、RNA以及DNA提取試劑盒等均購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

基因組 DNA和總 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及 Tf gDNA全長(zhǎng)序列克隆 取中華鱉肝、脾、腎、心等組織, 液氮速凍后–80℃冰箱保存?zhèn)溆?。用試劑盒提取各組織總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 并提取空白組基因組DNA。以基因組DNA為模板, 根據(jù)Tf 基因 cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異性引物, 擴(kuò)增 Tf 基因gDNA全長(zhǎng)?？俁NA提取、cDNA反轉(zhuǎn)錄、PCR反應(yīng)體系、產(chǎn)物純化回收、連接及單克隆測(cè)序等參照高明英等的方法[10]。

組織表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR采用 SYBR Green I 染料法在DNA Engine Chromo 4 Real-Time (美國 ABI公司)系統(tǒng)上進(jìn)行, 并采用相對(duì) CT法(2–△△Ct法)來計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。以反轉(zhuǎn)錄的 cDNA為模板, 以 actin-F (TGTTACCCATACTGTGCCC ATC) 和 actin-R (GCCATCTCCTGTTCAAAATCCA)為內(nèi)參, 用 Tf 特異性引物 TFf/TFr (CTACAACT ACTGGACCGACATTCA/ACACTTCTCCTTCTCG T GCTTAC)對(duì)試驗(yàn)樣本進(jìn)行熒光定量PCR分析, 每組設(shè)三個(gè)重復(fù)。

原核表達(dá)及 Western-blot印記分析 采用In-Fusion法進(jìn)行重組表達(dá)載體的構(gòu)建, 以合成的cDNA為模板, 以特異性引物TF1f/TF1r (CGATATC CGACCTGGAGCAGAGTAA/GAACAGGCTGGAC TCCTCTTG)和TF2f/TF2r (GTGCCGCGCGGCAGC CATATGGCCGACGTGATCCCGGCATT/TGGTGGT GGTGGTGCTCGAGCTAAGCCAAGGTCGTCAAG TCGCT)進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化、回收后連接到pET-32a載體上, 構(gòu)建pET-32a-PSTf 表達(dá)載體, 并將重組后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 BL21感受態(tài)細(xì)胞中。誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE凝膠電泳分析方法按高明英等的方法[10]。在 SDS-PAGE電泳后, PVDF膜甲醇中浸泡20s, 然后轉(zhuǎn)移到Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液(5%甲醇)中平衡至少 5min; SDS-PAGE膠在Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液平衡至少30min; 在冷卻條件下以 100 v恒壓轉(zhuǎn)膜 2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后, 放到T-TBS(含5%脫脂奶粉)室溫封閉1h, 然后T-TBS漂洗3次, 每次5min。用增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒鑒定表達(dá)產(chǎn)物。

序列分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用Vector NTI 11.5對(duì)獲得的DNA序列進(jìn)行拼接和分析。利用在線分析軟件Expasy、ScanProsite和 SingalP 4.1對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析[13,14]。用CLUSTALX2軟件和MEGA 5.0程序, 以最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[15]。用ESyPred3D web server 1.0構(gòu)建Tf的三維結(jié)構(gòu), 并用 RasMol-Raindy軟件分析[10]。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 11.5進(jìn)行單因素相關(guān)性分析, 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間P＜0.05為差異顯著, P＜0.01則為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白基因序列分析

Tf基因序列分析 中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白cDNA全長(zhǎng)為2359 bp。開放閱讀框(Open reading frame, ORF)長(zhǎng)度為 2094 bp, 起始密碼子為 ATG, 終止密碼子為TAG, 編碼697個(gè)氨基酸。其5′ UTR長(zhǎng)為46 bp, 3′-UTR長(zhǎng)217 bp, 且3′端存在一個(gè)33 bp的PolyA序列。其中, mRNA 3′端的加尾信號(hào)(AATAAA)位于polyA上游21 bp處。通過NCBI數(shù)據(jù)庫, 將中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白的cDNA序列進(jìn)行blastn對(duì)比分析, 結(jié)果顯示: 與其同源性最高的為綠海龜、紅耳龜和黃喉擬水龜, 均高達(dá) 97%, 其次是揚(yáng)子鱷(Alligator sinensis)、豹紋守宮(Eublepharis macularius)、綠頭鴨(Anas platyrhynchos), 相似性均大于80%。構(gòu)建的23個(gè)物種的轉(zhuǎn)鐵蛋白發(fā)育進(jìn)化樹(圖1)顯示, 4種龜鱉目動(dòng)物在進(jìn)化樹中首先聚類, 后與爬行類和鳥類聚類在一起, 然后與哺乳類聚類在一起, 但與兩棲類在進(jìn)化樹上的距離比較遠(yuǎn)。

中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)應(yīng)全長(zhǎng)cDNA的基因組DNA全長(zhǎng)為19100 bp, 其中包含16個(gè)內(nèi)含子, 17個(gè)外顯子。每個(gè)內(nèi)含子都包含剪切供體或受體連接處的“GT/AG”序列特征(表1)。基因組DNA與cDNA序列結(jié)構(gòu)比較(圖 2), 其中 ORF區(qū)的起始密碼子位于第一個(gè)外顯子處, 終止密碼子位于最后一個(gè)外顯子處。5′端和3′端非編碼區(qū)均為單一外顯子, 不包含內(nèi)含子。

圖1 23個(gè)物種轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig. 1 The phylogenetic tree of Tf gene of 23 species

圖2 中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白基因cDNA及DNA結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 The above schematic diagram shows the structural features of cDNA and genomic DNA of Pelodiscus sinensis Tf

表1 中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白基因內(nèi)含子與外顯子的接點(diǎn)及兩側(cè)的序列Tab. 1 Intron-exon junctions and flanking sequences of Tf gene of Pelodiscus sinensis

Tf基因結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)ProtParam在線軟件分析, 中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白分子量為 76.6126 kD, 分子式為 C3376H5230N912O1044S41, 共包含 10603個(gè)原子,理論等電點(diǎn)(pI)為6.07。利用SignalP 4.1 Server在線工具對(duì)其氨基酸序列分析, 在序列的第1至第19位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽序列“MRFAPRAALAWALLVFCSA”。利用 ScanProsite在線工具, 預(yù)測(cè)中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)功能位點(diǎn), 信號(hào)肽后的氨基酸序列可以分為兩個(gè)同源的結(jié)構(gòu)域: N-端的結(jié)構(gòu)域(23—340位點(diǎn))和C-端的結(jié)構(gòu)域(349—678位點(diǎn)), 兩個(gè)同源結(jié)構(gòu)域的相似性為37%, 中間間隔8個(gè)氨基酸。每個(gè)結(jié)構(gòu)域均包含兩個(gè)亞基, 并分別具有4個(gè)重金屬(Fe3+)結(jié)合位點(diǎn)(為Asp76/Asp399、Tyr108/Tyr436、Tyr 202/Tyr 532和 His261/His600)和 4個(gè)碳酸根陰離子(CO32–)結(jié)合位點(diǎn)(為 Thr76/Thr399、Arg108/Arg436、Ala 202/ Ala532和Gly261/ Gly600)。此外, 中華鱉Tf還包含11個(gè)二硫鍵形成區(qū)域(N-端5個(gè)和C-端6個(gè))、糖基化位點(diǎn)2個(gè)、酰胺化位點(diǎn)3個(gè)、?；稽c(diǎn)10個(gè)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)10個(gè)、cAMP- and cGMP-dependent 蛋白激酶磷酸化位點(diǎn) 2個(gè)以及酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)20個(gè)。發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的標(biāo)志序列, 分別為 108—117(序列為 YySVAVVKKG)、436—445(序列為YyAVAVVKKS)和532—547 (序列為YtGAFRCLvek.GDVAF)。

使用ExPASy在線分析中的SOPMA功能對(duì)中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析, 其中α螺旋數(shù)占全結(jié)構(gòu)的31.28%, 延伸鏈占17.79%, β轉(zhuǎn)角占5.88%, 不規(guī)則卷曲占45.05%。利用EsyPred 3D web server 1.0在線軟件, 對(duì)中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白氨基酸序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)顯示(圖3), 中華鱉Tf由兩個(gè)半球型功能結(jié)構(gòu)葉反向結(jié)合構(gòu)成一個(gè)完整的球蛋白構(gòu)象; 每個(gè)功能結(jié)構(gòu)域分為兩個(gè)子結(jié)構(gòu)域, 互靠近構(gòu)成Fe3+和CO32–的結(jié)合區(qū)域。

2.2 中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白基因組織表達(dá)特征

正常狀態(tài)下中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白基因組織表達(dá)特征通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè), 轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在正常(空白組)中華鱉的 4個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量, 以β-actin為內(nèi)參基因, 其中轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在腎臟組織的表達(dá)設(shè)定為10, 其他3個(gè)組織的表達(dá)量分別是相對(duì)腎臟組織的表達(dá)量(圖4)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在中華鱉的心臟、肝臟、脾臟和腎臟組織中均有表達(dá)。其中在肝臟中的表達(dá)量最高, 且與其他組織相比差異極顯著(P＜0.01)。脾臟組織的表達(dá)量次之, 且與其他組織相比差異顯著(P＜0.05)。在心臟和腎臟組織中的表達(dá)量較低。

圖3 中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig. 3 The tertiary structure of Pelodiscus sinensis Tf

嗜水氣單胞菌刺激誘導(dǎo)后中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白基因組織表達(dá)特征 為了進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)鐵蛋白的功能,實(shí)驗(yàn)設(shè)置了嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn), 分別在中華鱉感染后0、12h、24h、36h和48h后采集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組樣本, 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中華鱉在嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)刺激后, 轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在中華鱉心臟、肝臟、脾臟和腎臟組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明, 隨著誘導(dǎo)時(shí)間的推移, 轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在心臟、肝臟、脾臟和腎臟組織中的表達(dá)均為先被誘導(dǎo)上調(diào)后減少的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)(圖5)。其中, 中華鱉在嗜水氣單胞菌誘導(dǎo) 12h后, 轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在肝臟和心臟中的表達(dá)出現(xiàn)了顯著上調(diào)(P＜0.05), 實(shí)驗(yàn)組分別是對(duì)照組的6.05倍和1.89倍; 在誘導(dǎo)24h后, 轉(zhuǎn)鐵蛋白在脾臟中的表達(dá)出現(xiàn)了顯著上調(diào)(P＜0.05), 實(shí)驗(yàn)組分別是對(duì)照組的5.60倍; 在誘導(dǎo)36h時(shí), 轉(zhuǎn)鐵蛋白在腎臟中的表達(dá)出現(xiàn)了顯著上調(diào)(P＜0.05), 實(shí)驗(yàn)組分別是對(duì)照組的1.69倍。

2.3 中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白原核表達(dá)及Western blot鑒定

將pET-32a-Tf重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21,重組菌經(jīng)0.8 mmol/L IPTG 37℃分別誘導(dǎo)表達(dá)1h、2h、3h及4h后, 與空載BL21/pET重組菌(37℃誘導(dǎo)4h)的結(jié)果一起通過SDS-PAGE電泳檢測(cè)(圖6)。重組誘導(dǎo)菌與空載菌比較發(fā)現(xiàn), 在目標(biāo)條帶處出現(xiàn)了很強(qiáng)的蛋白條帶, 且與理論推算的蛋白分子量(95 kD)相符。IPTG誘導(dǎo)3—4h的表達(dá)菌, 融合蛋白的表達(dá)量較大。以pET-32a 為表達(dá)載體所表達(dá)的融合蛋白帶 His標(biāo)簽, 實(shí)驗(yàn)以 His-probe 抗體(H-15) (sc-803)為一抗, 羊抗兔 IgG-HRP(美國 Pierce)為二抗。進(jìn)行 Western blot檢測(cè)(圖 7)。進(jìn)行 Western blotting 分析在 95 kD 位置出現(xiàn)了特異的反應(yīng)帶,特意條帶的位置與預(yù)期相符, 表明蛋白表達(dá)成功。

圖 5 不同感染時(shí)間中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在不同組織中的表達(dá)特征Fig. 5 The expression characteristics of Pelodiscus sinensis TF in different tissues with different stimulation time

圖6 重組菌表達(dá)SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 SDS-PAGE of Pelodiscus sinensis Tf expressed in BL21

圖7 Western blot 檢測(cè)中華鱉重組轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)鐵蛋白Fig. 7 Western blot analysis of the recombinant transferrin of Pelodiscus sinensis TF

3 討論

自 1945年人類轉(zhuǎn)鐵蛋白首次從血清鑒別出以來, 關(guān)于轉(zhuǎn)鐵蛋白的研究一直持續(xù)至今[16]。人類和家鼠等哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)鐵蛋白相關(guān)研究已經(jīng)深入到臨床檢測(cè)和治療應(yīng)用等方面[5,17]。但是龜鱉動(dòng)物的相關(guān)研究卻剛剛開始, 僅在黃喉擬水龜、紅耳龜、綠海龜中有一些相關(guān)研究報(bào)道[10,11]。

中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白基因組DNA序列包含16個(gè)內(nèi)含子和 17個(gè)外顯子, 與家鼠、石斑魚(Epinephelus awoara)和黃喉擬水龜?shù)霓D(zhuǎn)鐵蛋白基因組DNA結(jié)構(gòu)組成相似[10,18]。但有報(bào)道稱, 人的Tf 有17個(gè)內(nèi)含子和18個(gè)外顯子, 其編碼區(qū)起始于第2個(gè)外顯子[19]。中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白cDNA的ORF區(qū)可編碼697個(gè)氨基酸組成的多肽鏈, 比黃喉擬水龜短 9個(gè)氨基酸, 但兩者信號(hào)肽長(zhǎng)度相同[10]。在目前已報(bào)道的人、鼠、鳥類、魚類以及兩棲爬行類中, 轉(zhuǎn)鐵蛋白具有高度保守的功能結(jié)構(gòu)域[20]。中華鱉具有典型轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu), 含有兩個(gè)相似的同源結(jié)構(gòu)域, 相似性為 37%,黃喉擬水龜、草魚(Ctenopharyngodon idellus)、人和真鯛(Pagrosomus major)的為 38.4%[10]、40%[19]、31%[21]和36%[22]。每個(gè)結(jié)構(gòu)域都含有 4個(gè)Fe3+和4個(gè)CO32–結(jié)合位點(diǎn), 可以可逆結(jié)合運(yùn)輸金屬離子, 完成生理功能。中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵離子結(jié)合位點(diǎn)包括1個(gè)Asp76、1個(gè)His和2個(gè)Tyr, 和人轉(zhuǎn)鐵蛋白X-ray構(gòu)象研究的結(jié)果相一致, 這些活性功能位點(diǎn)高度保守[20]。

研究發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)鐵蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域起源于機(jī)體進(jìn)化中基因復(fù)制形成的, 且 C-端結(jié)構(gòu)域與鐵離子的結(jié)合作用更穩(wěn)定[23]。二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象起維持穩(wěn)定作用, 多數(shù)脊椎動(dòng)物的轉(zhuǎn)鐵蛋白通常具有 15 個(gè)二硫鍵[24]: N端6個(gè)和C端9個(gè)。但中華鱉和黃喉擬水龜一樣均存在二硫鍵形成區(qū)域的缺失情況, 均在N端缺少1個(gè), C端缺少3個(gè)。在C端, 中華鱉比黃喉擬水龜多一個(gè)糖基化位點(diǎn), 增加了 C-端結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性和可修飾性。

對(duì)基因組織表達(dá)和免疫刺激表達(dá)圖譜的研究,是分析基因功能的重要方法, 也可直接反應(yīng)其免疫相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 正常中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在肝臟中的表達(dá)量最高, 與黃喉擬水龜[10]等其他很多脊椎動(dòng)物相似。雞的肝臟灌流實(shí)驗(yàn)顯示肝臟是轉(zhuǎn)鐵蛋白的主要合成組織, 揭示了轉(zhuǎn)鐵蛋白在肝臟組織中較高表達(dá)量的原因[25]。以嗜水氣單胞菌刺激后,中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在心、肝、脾和腎臟組織中的表達(dá)量均有上調(diào), 表明轉(zhuǎn)鐵蛋白參與了中華鱉的免疫應(yīng)答反應(yīng)。其中, 轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在肝臟組織中的表達(dá)最先呈現(xiàn)顯著上調(diào), 且在肝臟和脾臟組織中的表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)最明顯。通過嗜水氣單胞菌的免疫刺激, 激活了中華鱉先天免疫系統(tǒng), 可能導(dǎo)致呼吸或體液的改變, 誘導(dǎo)肝臟合成更多的轉(zhuǎn)鐵蛋白。脾臟是重要的造血器官和免疫器官, 嗜水氣單胞菌引起轉(zhuǎn)鐵蛋白在脾臟中的表達(dá)上調(diào)[21]。此外, 中華鱉轉(zhuǎn)鐵蛋白原核表達(dá)的成功, 為此后蛋白分離純化、抗菌活性以及功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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MOLECULAR CHARACTERISTICS AND THE EXPRESSION OF TRANSFERRIN GENE IN CHINESE SOFT SHELL TURTLE

LI Wei1,2, SHI Yan1, ZHAO Jian1,2, HONG Xiao-You1and ZHU Xin-Ping1,2
(1. Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation of Ministry of Agriculture, Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China; 2. College of Fisheries and Life, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Transferrin has a variety of biological functions such as iron transportation, anti-microbial, and immunoregulation. In this study, we isolated the full length cDNA of transferrin of Chinese soft shell turtle (Pelodiscus sinensis) from the constructed liver cDNA library. The cDNA sequence consisted of 2359 bp, including an open reading frame (ORF) of 2094 bp which could encode a 674-aa peptide. The genomic DNA of transferrin consisted of 19100 bp and contained 17 exons and 16 introns, with a structure similar to that of other vertebrates. Using the online software we predicted the molecular characteristics of transferrin. The results indicated that the N-lobe of transferrin had a signal peptide of 19 amino acids; this gene was composed of two similar domains with a similarity of 37%. There were 2 N-linked glycosylation sites in the N-lobe, and 11 disulfide bonding formation areas in amino acids peptide. The quantitative PCR results showed that the expression of transferrin was the highest in liver in the normal group. The results also showed that after the infection with Aeromonas hydrophila the expression of this gene was first increased and then decreased in liver, spleen, kidney and heart, and the increase was particularly high in liver and spleen. Moreover, we applied western-blot to testify the prokaryotic expression of transferrin of Chinese soft shell turtle. This study could provide insights into the biological functions of transferrin in non-specific immune responses.

Chinese soft shell turtle; Transferrin; Sequence analysis; Tissue-specific expression; Prokaryotic expression

Q781

A

1000-3207(2015)03-0482-08

10.7541/2015.64

2014-06-06;

2014-09-12

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)(A201201E05); 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012B020307003); 廣州市珠江科技新星專項(xiàng)(2012J2200091)資助

李偉(1984—), 女, 山東聊城人; 博士研究生; 研究方向?yàn)榉N質(zhì)資源與遺傳育種。E-mail: 15013083966@163.com

朱新平(1964—), 男, 研究員, 博士生導(dǎo)師; E-mail: zhuxinping_1964@163.com