食品中金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)方法比較研究

曹建平， 韓 丹， 王 健

(1.寧波市鄞州區(qū)食品檢測(cè)中心，浙江寧波 315100；2.衢州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)中心，浙江衢州 324000)

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食品中金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)方法比較研究

曹建平1， 韓 丹2， 王 健2

(1.寧波市鄞州區(qū)食品檢測(cè)中心，浙江寧波 315100；2.衢州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)中心，浙江衢州 324000)

[目的] 探求一種適應(yīng)食品微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)要求的快速準(zhǔn)確的方法。[方法]比較研究Baird-Parker平板法、MPN法、科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基法和PetrifilmTM測(cè)試片法這4種定量方法對(duì)金黃色葡萄球菌的選擇性、靈敏度和在食品中的應(yīng)用。[結(jié)果]試驗(yàn)顯示，4種方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌選擇性良好；MPN法、顯色培養(yǎng)基法和紙片法靈敏度比Baird-Parker平板法稍高；4種方法應(yīng)用在食品檢測(cè)中，金黃色葡萄球菌檢出率無顯著差異。因此可選擇顯色培養(yǎng)基和PetrifilmTM測(cè)試紙片法作為日常檢驗(yàn)的輔助手段，以提高檢測(cè)靈敏度、縮短檢驗(yàn)周期。[結(jié)論] 研究可為食品檢測(cè)方法的研究及應(yīng)用積累一定的經(jīng)驗(yàn)，為今后金黃色葡萄球菌的檢測(cè)工作提供一定參考。

金黃色葡萄球菌；定量檢測(cè)方法；比較研究

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)屬于葡萄球菌屬，是一種重要的病原菌，是典型的革蘭氏陽性菌，有較強(qiáng)的抵抗力。金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，且有高度的耐鹽性，容易污染肉類、水產(chǎn)品、乳品等食品，在世界各個(gè)國家中，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中均占較大比例[1-2]，金黃色葡萄球菌引起的食物中毒已成為世界性的公共衛(wèi)生問題。

目前關(guān)于食品中金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)方法主要有Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法[3]、MPN計(jì)數(shù)法[3]、測(cè)試紙片法[4]、顯色培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法等。其中Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法為國標(biāo)法的第二法和第三法，但兩者都存在耗時(shí)、工作量大的缺陷，很難適應(yīng)現(xiàn)在快速檢驗(yàn)要求；測(cè)試紙片法、顯色培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法檢測(cè)周期短、工作量小，已經(jīng)得到了很多機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。筆者比較研究了這4種定量方法對(duì)金黃色葡萄球菌的選擇性、靈敏度和在食品中的應(yīng)用，以Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法為基準(zhǔn)，將結(jié)果進(jìn)行比較分析研究，旨在探求一種適應(yīng)食品微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)要求的快速準(zhǔn)確的方法，為食品檢測(cè)方法的研究及應(yīng)用積累一定的經(jīng)驗(yàn)，為今后金黃色葡萄球菌的檢測(cè)工作提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑及培養(yǎng)基。平板計(jì)數(shù)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、BHI肉湯、Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)、卵黃亞碲酸鉀增菌劑、凍干血漿，青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色液，北京陸橋；科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基，法國科瑪嘉公司；PetrifilmTM6491金黃色葡萄球菌測(cè)試片、PetrifilmTM6493金黃色葡萄球菌確認(rèn)反應(yīng)片，美國3M公司。

1.1.2試驗(yàn)菌株。金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸埃希氏菌(ATCC25922)、表皮葡萄球菌(ATCC29069)，寧波市鄞州區(qū)食品檢測(cè)中心提供。

1.1.3樣品。采集寧波市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及超市的食品50份， 其中生肉類10份、熟肉制品10份、生牛奶10份、豆制品10份、糕點(diǎn)10份。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)。Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法：按GB 4789.10-2010第二法檢驗(yàn)。MPN法：按GB 4789.10-2010第三法檢驗(yàn)?？片敿谓瘘S色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基平板法：每個(gè)稀釋度分別吸取1 ml樣品勻液以0.3、0.3、0.4 ml接種量分別加入3塊顯色培養(yǎng)基平板上，然后用無菌L棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣，按說明書判讀。PetrifilmTM測(cè)試片計(jì)數(shù)法：取1 ml稀釋好的菌液接入測(cè)試片，靜置測(cè)試片1 min，(36±1)℃培養(yǎng)24 h，按說明書判讀，有可疑菌落時(shí)，用確認(rèn)反應(yīng)片做補(bǔ)充試驗(yàn)。

1.2.2選擇性鑒定試驗(yàn)。將3株試驗(yàn)菌株分別劃線接種于Baird-Parker平板和顯色培養(yǎng)基平板；MPN法的鑒定同Baird-Parker平板；以生理鹽水作10倍系列稀釋，取1 ml接種PetrifilmTM測(cè)試片(使菌液終濃度在100～1 000 CFU/ml)；36 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察各菌株的典型生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行特異性比較。

1.2.3靈敏度試驗(yàn)。在4種培養(yǎng)基上加入不同菌濃度的金黃色葡萄球菌菌懸液，每個(gè)測(cè)試作2個(gè)平行，按“1.2.1”方法培養(yǎng)，判讀，計(jì)數(shù)，同時(shí)以平板計(jì)數(shù)瓊脂傾注法計(jì)算菌濃度作對(duì)照，評(píng)價(jià)4種試驗(yàn)方法的檢測(cè)靈敏度。

1.2.4食品中檢測(cè)應(yīng)用 。無菌生理鹽水作10倍系列稀釋同一樣品后，選擇適當(dāng)?shù)南♂尪确謩e按“1.2.1”方法檢測(cè)，結(jié)果用SPSS 18.0軟件以χ2檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性試驗(yàn)比較3株試驗(yàn)菌株中，金葡菌在4種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好(MPN法最終也是用BP平板篩選)，特征菌落明顯，表皮葡萄球菌在4種培養(yǎng)基中雖然有生長(zhǎng)，但無典型特征性菌落，大腸埃希氏菌在4種培養(yǎng)基中均不生長(zhǎng)，結(jié)果見表1。分析結(jié)果得出，各種培養(yǎng)基對(duì)金葡菌的選擇性都良好，符合計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的選擇性要求。

2.2 靈敏性試驗(yàn)用4種檢測(cè)方法分別對(duì)金葡菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，MPN法、顯色培養(yǎng)基法和PetrifilmTM測(cè)試片法靈敏度比Baird-Parker平板法稍高一個(gè)數(shù)量級(jí)，但均能滿足計(jì)數(shù)要求，結(jié)果見表2。

表1 選擇性鑒定試驗(yàn)對(duì)比結(jié)果

注：“+”表示有菌落生長(zhǎng)，“-”表示無菌落生長(zhǎng)。

表2 靈敏性試驗(yàn)對(duì)比結(jié)果

注：“+”表示有菌落生長(zhǎng)，“-”表示無菌落生長(zhǎng)。

表3 不同種檢測(cè)方法金黃色葡萄球菌檢出結(jié)果

2.4 金黃色葡萄球菌各種定量檢驗(yàn)方法比較對(duì)檢測(cè)金黃色葡萄球菌幾種方法指標(biāo)的評(píng)價(jià)見表4。Baird-Parker法需涂布后觀察然后挑去可疑菌落轉(zhuǎn)接BHI肉湯后，再做血漿凝固酶進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，耗時(shí)3～4 d。MPN法更是需要對(duì)樣品先進(jìn)行增菌，然后再接種觀察培養(yǎng)驗(yàn)證，耗時(shí)更長(zhǎng)，步驟更是繁瑣、量大。顯色培養(yǎng)基、測(cè)試片法是基于微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應(yīng)顯色底物反應(yīng)顯色的原理，顯色培養(yǎng)基臨用前加熱煮沸溶解即可使用，接種后24 h觀察結(jié)果，無需證實(shí)試驗(yàn)；紙片法只需培養(yǎng)后對(duì)可疑菌落加確認(rèn)反應(yīng)片驗(yàn)證即可對(duì)最終結(jié)果進(jìn)行判定。在實(shí)際檢驗(yàn)運(yùn)用中，顯色培養(yǎng)基、測(cè)試片法較傳統(tǒng)培養(yǎng)基有工作量少、使用簡(jiǎn)便、靈敏度高、周期短的優(yōu)點(diǎn)，但顯色培養(yǎng)基和測(cè)試片成本要比Baird-Parker法和MPN法高。

表4 金黃色葡萄球菌各種定量檢驗(yàn)方法比較

3 結(jié)論與討論

金黃色葡萄球菌其菌落有典型的金黃色特征，是食源性致病菌的一種，但在日常檢測(cè)過程中，常會(huì)造成金黃色色素不典型的現(xiàn)象，若單純使用傳統(tǒng)Baird-Parker平板和血平板，容易造成誤判，張琳從BP平板上隨機(jī)挑取典型菌落做血漿凝固酶驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果檢出率為66%[5]，這一結(jié)果與一文獻(xiàn)中報(bào)道的相符合[6]，這漏檢往往會(huì)導(dǎo)致食品安全事故。Baird-Parker法涂布時(shí)受人員熟練程度等人為因素影響，菌落有時(shí)分布不均勻而難以計(jì)數(shù)。當(dāng)樣品中金葡菌濃度低時(shí)，Barid-Parker法和MPN法結(jié)果沒有顯著差異，但Barid-Parker法更接近理論值，一般不選擇MPN法[7]?？片敿谓瘘S色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基可直觀上對(duì)幾種葡萄球菌進(jìn)行有效區(qū)分，避免了漏檢和誤判，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間。PetrifilmTM測(cè)試片，操作步驟標(biāo)準(zhǔn)化，人為誤差較小，攜帶方便尤其適合現(xiàn)場(chǎng)取樣檢驗(yàn)。但測(cè)試片法計(jì)數(shù)時(shí)，黑色或藍(lán)綠色的可疑菌落較多，而紫紅色菌落相對(duì)較少，加確認(rèn)片反應(yīng)后，也只有少量菌落有粉紅色暈圈。因此使用測(cè)試片法計(jì)數(shù)時(shí)，如雜菌過多，則將會(huì)影響結(jié)果，建議同時(shí)多做幾個(gè)稀釋度。通過比較，雖然顯色培養(yǎng)基法及測(cè)試片法成本較高，但金黃色葡萄球菌的檢出率與傳統(tǒng)國標(biāo)法即Barid-Parker平板法和MPN法相比無顯著差異，卻極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，且操作簡(jiǎn)便。在實(shí)際檢測(cè)工作中，可將選擇顯色培養(yǎng)基和PetrifilmTM測(cè)試紙片法作為日常檢驗(yàn)的輔助手段，在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中推廣應(yīng)用。

[1] 李自然，施春雷，宋明輝，等.上海市食源性金黃色葡萄球菌分布狀況[J].食品科學(xué)，2013,34(1)：268-271.

[2] 陳廣全，張惠媛，曾靜.食品安全檢測(cè)培訓(xùn)教材 微生物檢驗(yàn)[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010：351-352.

[3] 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.10-2010.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn) [S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010

[4] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.SN/T 1895-2007 食品中金黃色葡萄球菌的快速計(jì)數(shù)法PetrifilmTM 測(cè)試片法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[5] 張琳.食品中金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法的比較研究[J].食品工業(yè)科技,2006,27(6):166-169.

[6] SCHOELLER N P,LNGHAM S C.Comparison of the Baird-Parker agar and 3MTMPetrifilm rapidS.aureuscount plate methods for detection and enumeration ofStaphylococcusaureus[J].Food Microbiol, 2001,18:581-587.

[7] 陸嵐，張勇，張勇琪,等.金黃色葡萄球菌定量檢驗(yàn)方法研究[J].大家健康,2011,5(11):39-40.

A Comparative Study on Quantitative Detection ofStaphylococcusaureusin Food

CAO Jian-ping1, HAN Dan2, WANG Jian2

(1.Ningbo Yinzhou Food Testing Center, Ningbo, Zhejiang 315100; 2.Quzhou Measurement and Testing Center for Quality and Technique Supervising, Quzhou, Zhejiang 324000)

[Objective] To explore a rapid and accurate method for detection requirements of food microbiology laboratory.[Method] The four methods Baird-Parker plate, MPN,StaphylococcusaureusCHROMagar chromogenic media and PetrifilmTMtest paper method were compared in quantitative detection ofStaphylococcusaureusin food.[Result] The results showed that all the four methods exhibited high selectivity forS.aureus.Although the MPN, chromogenic media and PetrifilmTMtest paper methods were slightly more sensitive than Baird-Parker plate.The detection rates of the four methods showed no significant difference inS.aureus.It is suggested that chromogenic medium and PetrifilmTMtest paper method may be an auxiliary means for daily inspection ofS.aureusin order to improve detective sensitivity and shorter testing time.[Conclusion] The study can accumulate experience for research and application of food detection method, provide a certain reference for detection work ofStaphylococcusaureusin the future.

Staphylococcusaureus; Quantitative detection; Comparative study

曹建平(1982- )，女，浙江寧波人，工程師，碩士，從事微生物檢驗(yàn)研究。

2015-01-30

S 182

A

0517-6611(2015)08-242-02