O型口蹄疫病毒衣殼蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及其抗原性鑒定

解銀麗，馬 琪，李志勇

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046)

?

O型口蹄疫病毒衣殼蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及其抗原性鑒定

解銀麗，馬 琪，李志勇*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046)

為構(gòu)建并表達(dá)O型口蹄疫病毒( Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)的空衣殼蛋白的重組桿狀病毒并鑒定其抗原性。以質(zhì)粒pMD19-P12A3C為模板，擴(kuò)增出編碼O型FMDV衣殼蛋白前體P12A及其蛋白酶3C的P12A3C基因，插入至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual PH啟動(dòng)子下，構(gòu)建出重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual-P12A3C，并轉(zhuǎn)化DH10BacTM大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-P12A3C，將其轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得表達(dá)O型FMDV衣殼蛋白的重組桿狀病毒rBac-P12A3C。增殖重組桿狀病毒然后用其感染Sf9細(xì)胞，最后通過(guò)間接免疫熒光檢測(cè)外源蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物能夠被O型FMDV VP1多克隆抗體識(shí)別，并具有良好的反應(yīng)原性，表明表達(dá)O型FMDV衣殼蛋白的重組桿狀病毒rBac-P12A3C構(gòu)建成功。該研究為進(jìn)一步研究O型FMDV空衣殼的體外組裝提供前期實(shí)驗(yàn)材料，并為后期研制出口蹄疫的基因工程亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

O型口蹄疫病毒；衣殼蛋白；重組桿狀病毒

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引發(fā)牛、羊、豬等偶蹄動(dòng)物易感染的一種動(dòng)物疫病，其傳播速度快、感染率高[1-2]，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties，OIE)列為必須上報(bào)的傳染病，被我國(guó)列為一類(lèi)動(dòng)物傳染病[3-4]。FMDV屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，是單股的正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約8.5 kb，包含編碼1個(gè)多聚蛋白的開(kāi)放閱讀框(ORF)。其中，在非結(jié)構(gòu)蛋白3C蛋白酶作用下，P1結(jié)構(gòu)蛋白被解離成單體蛋白VP0、VP3、VP1，然后VP0進(jìn)一步解離成單體蛋白VP4 和VP2，F(xiàn)MDV基因組 RNA 能與解離后的單體蛋白組裝成為成熟的146S病毒粒子[1]。接種疫苗是FMD防控最為有效的措施，在控制FMD暴發(fā)的過(guò)程中，口蹄疫滅活疫苗起到了極為重要的防控作用，但是由于其在生產(chǎn)的過(guò)程中需要大量增殖FMD強(qiáng)毒，存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)MDV空衣殼蛋白75S具有與完整FMDV 146S粒子非常相似的抗原特性，可以引起與完整FMDV病毒粒子極其相似的免疫反應(yīng)，由于病毒空衣殼不含核酸成分，安全性好，不存在散毒風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此，研制FMDV空衣殼疫苗顯得極為重要。

目前，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)Bac-to-Bac是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中最常用的一種，具有高效、快速的特性，其表達(dá)的外源目的蛋白，可以在細(xì)胞內(nèi)完成翻譯后的修飾和加工，因此生物功能和天然的目的蛋白更為接近。筆者采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)Bac-to-Bac，成功構(gòu)建并表達(dá)了O型FMDV衣殼蛋白的重組桿狀病毒，然后鑒定了所表達(dá)衣殼蛋白的抗原性，以期為研究基因工程亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒和細(xì)胞質(zhì)粒pMD19-P12A3C為家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞為家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 質(zhì)粒、抗體及試劑pFastBacDual載體、DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)染試劑CellfectinII Reagent、細(xì)胞培養(yǎng)基Sf900-II SFM、PureLinkTMHipure Plasmid Miniprep Kit、購(gòu)自Invitrogen公司；JM109感受態(tài)細(xì)胞、GXL高保真DNA聚合酶及DNA Marker等均購(gòu)自大連寶生物公司；T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶Hind III、SpeI購(gòu)自美國(guó)NEB公司；切膠回收試劑盒、PCR清潔試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均購(gòu)自杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；FITC標(biāo)記羊抗兔IgG，購(gòu)自中杉金橋公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒pMD19-P12A3C中基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增P12A3C基因的特異性引物，上游引物P12A3CF：5′-CGCAAGCTTGCCACCATGGGCGCCGGGCAATCCA-3′和下游引物P12A3CR：5′-CGCACTAGTTCACTCGTGGTGTGGTTC-3′，下劃線分別為Hind III和SpeⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。M13通用引物為Invitrogen公司推薦的通用引物，引物由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual-P12A3C的構(gòu)建以質(zhì)粒pMD19-P12A3C為模板，利用特異性引物P12A3CF和P12A3CR在GXL高保真DNA聚合酶作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增P12A3C基因，用限制性內(nèi)切酶SpeI和Hind III分別將PCR產(chǎn)物P12A3C和供體質(zhì)粒pFastBacDual雙酶切后回收，然后用T4連接酶將P12A3C切膠回收產(chǎn)物與線性化的載體pFastBacDual連接，以使P12A3C定向插入到供體質(zhì)粒pFastBacDual。然后，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，利用α-互補(bǔ)篩選、酶切鑒定與PCR鑒定得到疑似陽(yáng)性克隆，命名為pFastBacDual-P12A3C，由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司對(duì)疑似陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.5 重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-P12A3C的構(gòu)建將重組轉(zhuǎn)移pFastBacDual-P12A3C轉(zhuǎn)化入DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞，然后利用四環(huán)霉素、慶大霉素、卡那霉素以及α-互補(bǔ)篩選出重組的轉(zhuǎn)座子Bacmid-P12A3C。同時(shí)，將無(wú)外源基因插入的供體質(zhì)粒pFastBacDual轉(zhuǎn)化DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞篩選出重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-NC為陰性對(duì)照。用PureLinkTMHipure Plasmid Miniprep Kit對(duì)重組轉(zhuǎn)座子進(jìn)行質(zhì)粒提取，采用通用引物M13F和M13R PCR鑒定外源基因的插入情況。

1.6 重組桿狀病毒rBac-P12A3C的構(gòu)建在轉(zhuǎn)染試劑CellfectinII Reagent的介導(dǎo)下，將重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-P12A3C和Bacmid-NC轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，并作僅含CellfectinII Reagent的陰性對(duì)照，將細(xì)胞放置于28 ℃下培養(yǎng)并觀察。當(dāng)轉(zhuǎn)染的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收取病變的細(xì)胞培養(yǎng)上清，將收取的上清作為第1代的重組桿狀病毒rBac-P12A3C和rBac-NC。

1.7 間接免疫熒光(IFA)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白表達(dá)將重組的桿狀病毒rBac-P12A3C及rBac-NC接種Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，細(xì)胞病變后，利用4%多聚甲醛固定，一抗為O型口蹄疫VP1多克隆抗體(1∶300)，用FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶300)作為熒光二抗，進(jìn)行IFA試驗(yàn)檢測(cè)，置于熒光顯微鏡下觀察熒光產(chǎn)生情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 P12A3C基因的克隆及鑒定以質(zhì)粒pMD19-P12A3C為模板，利用特異性引物P12A3CF和P12A3CR在GXL高保真DNA聚合酶作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增P12A3C基因得到大小約3 000 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

注：M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；p.P12A3C基因的PCR產(chǎn)物。圖1 P12A3C片段的PCR擴(kuò)增

2.2 重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual-P12A3C的構(gòu)建及鑒定以重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual-P12A3C為模板，利用特異性引物P12A3CF和P12A3CR在GXL高保真DNA聚合酶作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增P12A3C基因得到大小約3 000 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)；重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual-P12A3C由限制性內(nèi)切酶SpeI和Hind III雙酶切得到大小分別約5 238 bp 和約3 000 bp 的條帶，與預(yù)計(jì)條帶大小相符(圖3)，說(shuō)明目的基因正確克隆入供體質(zhì)粒上。將疑似陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，寄送至南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。結(jié)果表明，重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual-P12A3C 攜帶正確的O型FMDV毒株空衣殼的蛋白編碼基因P12A3C，進(jìn)一步證明了包含完整的編碼口蹄病毒疫空衣殼蛋白表達(dá)基因P12A3C的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual-P12A3C構(gòu)建成功。

注：M.DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；p.重組質(zhì)粒的Hind III+Spe Ⅰ雙酶切產(chǎn)物。圖2 重組質(zhì)粒pFastBacDual-P12A3C的雙酶切鑒定

注：M.DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；p.P12A3C基因的PCR產(chǎn)物。圖3 重組質(zhì)粒pFastBacDual-P12A3C的PCR鑒定

2.3 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座子Bacmid-P12A3C的構(gòu)建與鑒定以重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-P12A3C和Bacmid-NC為模板，采用通用引物M13F和M13R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到分別約5 560 bp和2 560 bp大小的條帶(圖4～5)，說(shuō)明重組轉(zhuǎn)座子構(gòu)建成功。

注：M.DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；p.PCR產(chǎn)物。圖4 重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-P12A3C的PCR鑒定

注：M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；p.PCR產(chǎn)物。圖5 重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-NC的PCR鑒定

2.4 重組桿狀病毒rBac-P12A3C的構(gòu)建轉(zhuǎn)染后的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞在28 ℃培養(yǎng)5 d后，出現(xiàn)細(xì)胞變大、脫落等明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(圖6)，而陰性對(duì)照細(xì)胞未出現(xiàn)相應(yīng)的病變。收取病變的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)上清為第1代的重組病毒rBac-P12A3C和rBac-NC。

2.5 IFA檢測(cè)外源基因的表達(dá)重組桿狀病毒rBac-P12A3C和rBac-NC感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞3 d后，用O型FMDV VP1多克隆抗體進(jìn)行IFA檢測(cè)。結(jié)果表明，感染rBac-P12A3C的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，檢測(cè)到明顯的黃綠色熒光，而感染rBac-NC的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞未檢測(cè)到特異性黃綠色熒光(圖7)。這表明重組桿狀病rBac-P12A3C中P123CA基因在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)成功。

注：A.感染重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞；B.陰性對(duì)照。圖6 重組桿狀病毒對(duì)Sf9細(xì)胞的致病變作用

注：A.感染桿狀病毒rBac-P12A3C的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞；B.感染桿狀病毒rBac-NC的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞。圖7 間接免疫熒光檢測(cè)Sf9細(xì)胞中的目的蛋白

3 討論

FMD是全球范圍重點(diǎn)防控的動(dòng)物傳染病之一，該病的預(yù)防和控制主要以疫苗接種為主，同時(shí)結(jié)合撲殺病畜、隔離疑似病畜、定期消毒等綜合防控措施，但其對(duì)畜牧業(yè)的危害仍然不容忽視。研究FMDV衣殼蛋白的表達(dá)，然后以所表達(dá)的以殼蛋白研制疫苗，是許多科學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。很多表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)被用于表達(dá)FMDV 空衣殼蛋白，但大都存在免疫原性不好、組裝效率不高以及成本高等缺點(diǎn)，生產(chǎn)的FMDV 空衣殼蛋白不足以用作FMDV亞單位疫苗的研制[6-7]。

Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是通過(guò)轉(zhuǎn)座子原理構(gòu)建重組轉(zhuǎn)座子。該系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座過(guò)程全部在大腸桿菌內(nèi)完成，重組轉(zhuǎn)座子可直接用于轉(zhuǎn)染，此系統(tǒng)還利用α-互補(bǔ)原理篩選重組轉(zhuǎn)座子，不會(huì)造成非重組型病毒和野生型病毒交叉污染。Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的外源目的蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中可以進(jìn)行翻譯后修飾以及加工，所得目的蛋白的生物學(xué)功能與天然的目的蛋白更接近[8]?；钶d體疫苗的研究也是FMD基因工程疫苗研究的熱點(diǎn)，此前有學(xué)者嘗試過(guò)用痘病毒[6]、大腸桿菌[9]、轉(zhuǎn)基因植物[10]、腺病毒載體[11]和畢赤酵母[12]等表達(dá)FMDV衣殼蛋白，但經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是大規(guī)模生產(chǎn)表達(dá)FMDV空衣殼蛋白的最優(yōu)體系之一。曹軼梅等在Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中構(gòu)建并表達(dá)了Asia 1型FMDV 的P12A基因和3C蛋白酶基因，然后成功組裝了其空衣殼，并用以免疫豚鼠，產(chǎn)生了良好的免疫效果[13]。

該研究將O型FMDV的P12A3C基因克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual中，并在大腸桿菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)座重組，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞后構(gòu)建了重組桿狀病毒rBac-P12A3C。經(jīng)IFA試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，O 型FMDV P12A3C 基因在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)成功，且具有良好的反應(yīng)原性。該研究為O型FMDV空衣殼蛋白的體外組裝及其基因工程亞單位疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] MAHY B W J.Foot-and-mouth disease virus [M].Springer-verlag Berlin and Heidelberg GmbH & Co.k，2005.

[2] SOBRINO F，DOMINGO E.Foot-and-mouth disease in Europe [J].EMBO Reports，2001，2(6)：459-461.

[3] DOMINGO E，BARANOWSKI E，ESCARMIS C，et al.Foot-and-mouth disease virus [J].Comparative Immunology，Microbiology and Infectious Diseases，2002，25(5)：297-308.

[4] BAXI M K，BAXI S，CLAVIJO A，et al.Microarray-based detection and typing of foot-and-mouth disease virus [J].The Veterinary Journal，2006，172(3)：473-481.

[5] RODRIGUEZ L L.GRUBMAN M J.Foot-and-mouth disease virus vaccines [J].Vaccine，2009，27：90-94.

[6] ABRAMS C C，KING A M Q，BELSHAM G J.Assembly of foot-and-mouth disease virus empty capsids synthesized by a vaccinia virus expression system [J].Journal of General Virology，1995，76(12)：3089-3098.

[7] GRUBMAN M J，MORAES M P，SCHUTTA C，et al.Adenovirus serotype 5-vectored foot and mouth disease subunit vaccines：the first decade [J].Future Virology，2010，5(1)：51-64.

[8] 蘭麗盼，吳小鋒.昆蟲(chóng)桿狀病毒研究和應(yīng)用新進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，16(6)：1056-1060.

[9] KLEID D G，YANSURA D，SMALL B，et al.Cloned viral protein vaccine for foot-and-mouth disease：responses in cattle and swine [J].Science，1981，214(4525)：1125-1129.

[10] DUS SANTOS M J，CARRILLO C，ARDILA F，et al.Development of transgenic alfalfa plants containing the foot and mouth disease virus structural polyprotein gene P1 and its utilization as an experimental immunogen [J].Vaccine，2005，23(15)：1838-1843.

[11] MAYR G A，O’DONNELL V，CHINSANGARAM J，et al.Immune responses and protection against foot-and-mouth disease virus(FMDV)challenge in swine vaccinated with adenovirus-FMDV constructs [J].Vaccine，2001，19(15)：2152-2162.

[12] BALAMURUGAN V，RENJI R，SAHA S N，et al.Protective immune response of the capsid precursor polypeptide(P1)of foot and mouth disease virus type ‘O’produced inPichiapastoris[J].Virus Research，2003，92(2)：141-149.

[13] CAO Y，LU Z，SUN J，et al.Synthesis of empty capsid-like particles of Asia I foot-and-mouth disease virus in insect cells and their immunogenicity in guinea pigs [J].Veterinary Microbiology，2009，137(1)：10-17.

Expression and Identification of Capsid Protein of Foot-and-mouth Disease Virus Type O in Insect Cells

XIE Yin-li, MA Qi, LI Zhi-yong*

(State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou, Gansu 730046)

The capsid protein precursor P12A and protease 3C coding P12A3C gene of FMDV type O were amplified from the plasmid pMD19-P1A3C, then the gene P12A3C were inserted into the baculovirus transfer vector pFastBacDual to construct recombinant transfer vector pFastBacDual-P12A3C, in which the P12A3C gene were under the control of PH promoter.The recombinant baculovirus plasmids were transformed into Escherichia coli DH10BacTMto construct the recombinant baculovirus bacmid Bacmid-P12A3C, then transfected into Sf9 cells, the recombinant baculovirus was harvested when obvious cytopathic effect was observed.After amplied, the baculovirus were infected into the Sf9 cells.At last the expressed proteins were analyzed by the immunouorescent assay.The result indicated that the expressed protein were expressed in Sf9 cells, and displayed specificity to FMDV type O VP1 polyclonal antibody.From this study, the recombinant baculovirus including the virus capsid P1 gene and 3C protease gene coding regions of FMDV type O were successfully obtained, this provides a basis for the research of FMDV type O empty capsid assembly in vitro and empty capsid vaccine reaserch.

Type O Foot-and-mouth disease virus; Capsid protein; Recombinant baculovirus

解銀麗(1988- )，女，河南許昌人，碩士研究生，研究方向：分子疫苗與動(dòng)物免疫學(xué)。*通訊作者，副研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事分子疫苗與動(dòng)物免疫學(xué)研究。

2015-02-02

S 855

A

0517-6611(2015)08-095-03