番茄青枯病菌拮抗細(xì)菌的篩選及鑒定

羅 坤，胡利鋒，劉開(kāi)林，劉祥英，柏連陽(yáng)

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128;2.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410125)

番茄青枯病是由番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)引起的，是一種典型的土傳病害，長(zhǎng)期以來(lái)威脅著番茄的生產(chǎn)［1-2］。番茄青枯病的防治方法主要有抗病品種和化學(xué)防治，如農(nóng)用硫酸鏈霉素、新植霉素等。番茄青枯病生物防治主要從土壤中或者植株中分離純化篩選拮抗菌［3-4］，與番茄青枯病菌有相同的生態(tài)位，用于防治青枯病前景廣闊［5-6］。筆者從番茄青枯病發(fā)病田塊中的無(wú)病植株根際土壤中篩選獲得拮抗細(xì)菌，鑒定了其分類(lèi)地位，并通過(guò)盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證了其防效，旨在為番茄青枯病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基。NA培養(yǎng)基:蛋白胨5.0 g，牛肉膏3.0 g，酵母粉1.0 g，蔗糖/葡萄糖15.0 g，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水1 000ml，pH 7.0。

1.1.2 供試菌株。番茄青枯菌ND1由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究所提供。

1.1.3 供試土樣。土樣樣品采集于湖南省張家界市高峰鄉(xiāng)，采集病田塊中的健康植株的根圍土壤。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分離、純化與保存。采用稀釋分離法。稱(chēng)取10 g土樣，加入90 ml無(wú)菌水中，從濃度為1×10-5g/ml的菌液中吸取150 μl放入培養(yǎng)基中，涂板。涂布后的平板以30℃培養(yǎng)24 h后觀察，挑取單菌落進(jìn)行劃線(xiàn)純化，并編號(hào)［7］。

1.2.2 拮抗菌的篩選。采用抑菌圈法。以番茄青枯菌ND1為指示菌，檢測(cè)細(xì)菌的拮抗效果。將待測(cè)菌接在含有青枯菌的NA平板中心，30℃下培養(yǎng)48 h后，觀察有無(wú)抑菌圈形成。

1.2.3 拮抗菌的鑒定。

1.2.3.1 細(xì)菌的培養(yǎng)性狀的觀察。按《細(xì)菌分類(lèi)學(xué)》的細(xì)菌培養(yǎng)性狀方法進(jìn)行培養(yǎng)性狀的觀察。

1.2.3.2 生理生化反應(yīng)的測(cè)定。主要包括對(duì)拮抗菌進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、產(chǎn)H2S等試驗(yàn)。

1.2.3.3 細(xì)菌16S rDNA引物測(cè)序及分析。將篩選得到的拮抗細(xì)菌用通用引物16S rDNA進(jìn)行測(cè)序。引物采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F和1492R，即27F:AGA GTT TGATCCTGG CTCAG和1492R:TACGGCTACCTTGTTACGACTT。反應(yīng)程序:95℃變性5 min;94℃變性40 s，56℃復(fù)性40 s，72℃延伸90 s，32次循環(huán);72℃延伸7min，4℃保存。再將PCR產(chǎn)物送交廣東深圳華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序，將序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用Blast程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較分析。序列的比較及系統(tǒng)發(fā)育分析采用MEGA4.0軟件進(jìn)行［8］。

1.2.4 拮抗菌88號(hào)菌株溫室防效測(cè)定。接種病原菌3 d后，采用接抗菌88菌株發(fā)酵液灌根處理，設(shè)發(fā)病對(duì)照(CK)及鏈霉素對(duì)照，每處理4次重復(fù)，每重復(fù)5株番茄苗。記錄14 d的發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)及相對(duì)防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌篩選結(jié)果 以番茄青枯菌ND1為供試菌，從高華鄉(xiāng)番茄土樣中分離純化得到的104株細(xì)菌。將各類(lèi)菌株分別進(jìn)行拮抗作用測(cè)定，篩選到對(duì)番茄青枯病菌拮抗活性菌株有6株，占總數(shù)的5.7%。其中，菌株24號(hào)、菌株88號(hào)的抑菌半徑分別達(dá)6.3和7.2 mm，菌株38號(hào)、菌株39號(hào)、菌株54號(hào)和菌株102號(hào)的抑菌半徑相對(duì)較小，分別為2.5、2.7、1.2和2.3 mm(圖1)。

2.2 細(xì)菌種類(lèi)初步鑒定 菌株88號(hào)的形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)性狀在NA培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)慢，圓形、隆起、光滑、灰白色。在PDA培養(yǎng)基上菌落小，黃乳白色。在KB培養(yǎng)基上不產(chǎn)生熒光。G-，桿狀，極生鞭毛，未見(jiàn)芽孢。形成菌膜陰性，甲基紅陰性，VP試驗(yàn)陰性，石蕊牛乳產(chǎn)堿，明膠液化陽(yáng)性，產(chǎn)生H2S陰性，產(chǎn)生吲哚陽(yáng)性，硝酸鹽還原陽(yáng)性。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第九版，1994)所列的有關(guān)伯克氏屬形態(tài)學(xué)與生理生化形狀的描述初步認(rèn)定拮抗細(xì)菌菌株88號(hào)屬于伯克氏屬(Burkholderia sp.)。

2.3 拮抗菌測(cè)序結(jié)果及分析 用16S rDNA通用引物，以菌株88的DNA為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出1條約1 600 bp特異性片段，并同GenBank中16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，序列與越南伯克氏菌(Burkholderia vietnamiensis)FJ577505.1序列同源性高達(dá)100%。運(yùn)用MEGA3.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，從菌株88所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)來(lái)看，它與許多越南伯克氏菌之間的進(jìn)化距離相隔較近，與菌株88號(hào)的形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)測(cè)定的結(jié)果一致。

2.4 拮抗菌溫室防控效果 結(jié)果表明，菌株88號(hào)對(duì)番茄青枯病菌14 d的防治效果為96.4%，極顯著高于鏈霉素對(duì)照(表1)，拮抗菌88號(hào)具有較大的生防應(yīng)用潛力。

3 討論

番茄青枯病作為番茄生產(chǎn)上的一種頑固的土傳性病害，不易防治［9］。而拮抗菌具有和病原菌相同生態(tài)位等顯著特點(diǎn)，利用生物防治青枯病前景廣闊。該試驗(yàn)在利用前人研究的方法篩選出1株細(xì)菌88號(hào)，對(duì)番茄青枯菌有很強(qiáng)的拮抗作用。經(jīng)研究鑒定，該細(xì)菌均屬于伯克氏屬，與通常研究發(fā)現(xiàn)的青枯菌拮抗菌多屬于芽孢桿菌屬、假單胞桿菌屬不同。分子鑒定結(jié)果顯示，88號(hào)菌株為越南伯克氏菌(Burkholderia vietnamiensis)。此外發(fā)現(xiàn)，菌株88號(hào)對(duì)番茄晚疫病也有很強(qiáng)的拮抗作用，因此在防治番茄土傳病害上具有很好的應(yīng)用前景［10-11］。

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