5-氮雜-2′-脫氧胞苷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株SLIT2基因去甲基化的實(shí)驗(yàn)研究

李培坤 耿小平

5-氮雜-2′-脫氧胞苷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株SLIT2基因去甲基化的實(shí)驗(yàn)研究

李培坤 耿小平

目的 觀察肝細(xì)胞癌(HCC)細(xì)胞株SUN449、BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B及epG2中SLIT2基因在5-Aza-CdR作用后，其啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及表達(dá)的變化，探討HCC細(xì)胞株中SLIT2基因調(diào)控規(guī)律及甲基化調(diào)節(jié)抑制劑5-Aza-CdR對SLIT2基因轉(zhuǎn)錄的影響。方法對上述HCC細(xì)胞株體外培養(yǎng)，MSP法檢測HCC細(xì)胞株中SLIT2啟動子相關(guān)區(qū)域的甲基化狀況。應(yīng)用10 mmol/L濃度的5-Aza-CdR處理體外培養(yǎng)的5種HCC細(xì)胞后，MSP法檢測用藥前后細(xì)胞中SLIT2基因的甲基化狀態(tài)，RT-PCR法檢測用藥前后細(xì)胞中SLIT2 mRNA的變化。結(jié)果SLIT2基因在各細(xì)胞株中啟動子區(qū)呈異常高甲基化狀態(tài)，mRNA低表達(dá)。經(jīng)過5-Aza-CdR 處理后，SLIT2 基因啟動子區(qū)呈顯著去甲基化狀態(tài)，其mRNA表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論啟動子區(qū)異常甲基化是HCC細(xì)胞SLIT2基因失活的主要原因之一，去甲基化制劑5-Aza-CdR 能逆轉(zhuǎn)SLIT2 基因甲基化狀態(tài), 從而調(diào)控SLIT2 基因表達(dá)。

5-氮雜-2'-脫氧胞苷；肝細(xì)胞癌；SLIT2基因；DNA甲基化

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC) 為起源于肝細(xì)胞的惡性腫瘤，其惡性度高，缺乏較有效的治療手段，術(shù)后復(fù)發(fā)和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移普遍，在惡性腫瘤中，HCC發(fā)病率位列第5，病死率位列第3[1]。近年來，表觀遺傳學(xué)改變與HCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系逐步被揭開，目前認(rèn)為抑癌相關(guān)基因啟動子DNA堿基異常甲基化修飾導(dǎo)致其表達(dá)失活在HCC發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，本研究小組前期在HCC組織標(biāo)本和HCC細(xì)胞株中對多種基因進(jìn)行了甲基化檢測，篩選出甲基化率較高的SLIT2等基因[2]，本文擬在前期研究基礎(chǔ)上，應(yīng)用甲基化特異PCR技術(shù)(methylation-specific PCP，MSP)，探討去甲基化制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-CdR)對SUN449、BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B和HepG2 5種HCC細(xì)胞株中SLIT2基因異常高甲基化的逆轉(zhuǎn)作用，為HCC的去甲基化治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 所用HCC細(xì)胞株系香港中文大學(xué)惠贈并于我實(shí)驗(yàn)中心留存，試劑5-Aza-CdR購自Sigma公司，DNA提取試劑盒購于Qiagen公司；提取全細(xì)胞RNA Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自Hyclone公司；DNA提取并甲基化修飾試劑盒為GEPIGENTEK公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、Taq酶和dNTP購自TaKaRa公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HCC細(xì)胞培養(yǎng) 各細(xì)胞株在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃中5%CO2的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞處于對數(shù)生長期后，活細(xì)胞計(jì)數(shù)比例大于95%時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。在含10 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中待饑餓培養(yǎng)24 h后，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入含有10 mmol/L 5-Aza-CdR的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)后第1、3天換取同樣含藥濃度的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至第5天收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。設(shè)未加藥物培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組。

1.2.2 MSP法檢測各細(xì)胞株中SLIT2啟動子甲基化狀態(tài) 各細(xì)胞株加入含5-Aza-CdR培養(yǎng)液作用5 d后，分別收集細(xì)胞，提取各細(xì)胞株基因組DNA，細(xì)胞基因組DNA提取及甲基化修飾：按照QIAmp DNA Mini and Blood Mini Kit 成品試劑盒步驟提取各細(xì)胞株基因組DNA，應(yīng)用紫外線分光光度法檢測提取DNA濃度和純度，應(yīng)用一步法DNA修飾試劑盒對所提取的DNA進(jìn)行修飾，甲基化特異PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系25 μL，包括樣本DNA 1.0 μL, 10×PCR buffer 2.5 μL, 甲基化或非甲基化引物各0.5 μL, dNTP 2 μL, Taq酶0.2 μL, PCR-Water 18.3 μL。MSP反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min; 95℃ 1 min，甲基化及非甲基化均 68℃退火1 min, 72℃ 1 min, 45個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。以未加引物只加PCR-Water的體系作為空白對照，梯度為100 bp 的1 000 bp DNA Ladder作為分子量標(biāo)記，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)提供序列合成引物：①SLIT2基因甲基化引物：上游序列：5′-TTG GGG CGC GGG TTT GGG TTT TTA CGC-3′，下游序列：5′-CGT AAA CGA CGC CGA CCC CAC TA-3′;②非甲基化引物： 上游序列：5′-TTG GGG TGT GGG TTT GGG TTT TTA TG-3′，下游序列：5′- CAT AAA CAA CAC CAA CCC CAC TA -3′ ，甲基化及非甲基化產(chǎn)物大小均為160 bp，2%瓊脂糖凝膠電泳，設(shè)定電壓100 V，電泳時(shí)間30 min，紫外凝膠成像系統(tǒng)下照相分析。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.3 RT- PCR法分析SLIT2 mRNA表達(dá) 用TRIzol 法提取各HCC細(xì)胞總RNA, 紫外分光光度測定判斷提取RNA濃度及純度，按濃度算取 2 μg 總RNA，以其為模板并與逆轉(zhuǎn)錄酶和Oliga(dT)引物反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SLIT2引物序列：上游序列：5′-GGT GTC CTC TGT GAT GAA GAG-3′，下游序列：5′-GTG TTT AGG AGA CAC ACC TCG-3′，SLIT2產(chǎn)物片段387 bp。選擇GADPH為內(nèi)參：其上游引物序列：5′-GAC CCC TTC ATG ACC TCA ACT ACA-3′，下游引物序列：5′-CTA AGC AGT TGG TGG TGC AGG A-3′，產(chǎn)物片段為100 bp，兩對引物同時(shí)加入 25 μL 體系中，聚合酶鏈反應(yīng)反應(yīng)條件： 95℃ 預(yù)變性5 min; 95℃ 變性90 s, 61℃ 復(fù)性30 s, 72℃延伸30 s, 共30循環(huán); 72 ℃延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，核酸凝膠圖像分析儀攝影并分析RT-PCR產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-CdR對SLIT2甲基化狀態(tài)的影響 SLIT2基因在5種HCC細(xì)胞株中表現(xiàn)為異常高甲基化狀態(tài)，未擴(kuò)增出非甲基化產(chǎn)物，對各HCC細(xì)胞株用10 mmol/L濃度的5-Aza-CdR作用5 d后，各HCC細(xì)胞株MSP產(chǎn)物同時(shí)擴(kuò)增出甲基化和非甲基化產(chǎn)物，表現(xiàn)為甲基化和非甲基化狀態(tài)并存，而對照組未見擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。實(shí)驗(yàn)得出，HCC細(xì)胞株中SLIT2基因啟動子呈完全甲基化狀態(tài)，去甲基化制劑5-Aza-CdR能使SLIT2基因異常高甲基化狀態(tài)得到一定程度的逆轉(zhuǎn)，使該基因啟動子表現(xiàn)為部分甲基化現(xiàn)象，有效降低該基因甲基化程度。

2.2 SLIT2基因 mRNA的表達(dá) 以5-Aza-CdR干預(yù)前，SUN449、BEL-7402、Hep3B 細(xì)胞株中SLIT2 mRNA微弱表達(dá)甚至不表達(dá)，以10 mmol/L 濃度的5-Aza-CdR干預(yù)各細(xì)胞后，3種細(xì)胞株RT-PCR結(jié)果均出現(xiàn)明顯產(chǎn)物條帶，表明此3種HCC細(xì)胞株中異常高甲基化狀態(tài)的SLIT2基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，異常高甲基化狀態(tài)得到逆轉(zhuǎn)后重新獲得mRNA的表達(dá)能力；在HCC細(xì)胞株SMMC-7721和HepG2中，5-Aza-CdR干預(yù)前后均可見mRNA表達(dá)(圖2)。

3 討論

神經(jīng)生長導(dǎo)向因子2(SLIT2)基因被認(rèn)為是候選抑癌基因[3]，是SLIT-ROBO基因家族成員之一，該基因家族編碼的膜相關(guān)蛋白與ROBO相關(guān)基因表達(dá)的蛋白相互作用，發(fā)揮配體功能[4]，主要介導(dǎo)炎性趨化、細(xì)胞和凋亡、血管內(nèi)皮的生成和移動[5]。SLIT2基因啟動子異常高甲基化已在多系統(tǒng)腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)SLIT2在HCC組織標(biāo)本中甲基化率為78%[6]，在SUN449、BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B和HepG2細(xì)胞株中均出現(xiàn)完全甲基化，甲基化率為100%，推測SLIT2基因異常甲基化使基因表達(dá)沉默可能在HCC的發(fā)生及侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，提示SLIT2可能是HCC的靶基因。

DNA異常甲基化為表觀遺傳學(xué)變化[7]，其在原基因堿基排列順序不變的基礎(chǔ)上，通過加減甲基的方式改變基因結(jié)構(gòu)，從而使改變后的基因表達(dá)發(fā)生變化，開啟或關(guān)閉基因的表達(dá)行為，這就使對某些腫瘤相關(guān)基因，如抑癌基因的調(diào)控，改變其遺傳特性作為治療腫瘤的手段成為可能。甲基化調(diào)節(jié)劑能上調(diào)或下調(diào)基因甲基化水平，5-AZA-CdR為核苷類甲基化調(diào)節(jié)劑，主要作用于細(xì)胞周期的S期[8]，其機(jī)制主要通過特異性抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性阻斷其甲基化反應(yīng)[9]，下調(diào)基因甲基化狀態(tài)而被研究用于抑制腫瘤的生長，其在間質(zhì)性腫瘤中的基礎(chǔ)和臨床研究已初見成效，并逐漸被推廣至實(shí)性腫瘤的研究中，Liu 等[10]用5-AZA-CdR干預(yù)中國視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株HXO-RB44發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)后HXO-RB44 抑癌相關(guān)基因RASSF1A甲基化率明顯降低，且能抑制細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Ma等[11]同時(shí)檢測了肺癌癌旁組織及肺癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)Syk基因在肺癌細(xì)胞株異常高甲基化同時(shí)表達(dá)沉默，癌組織較癌旁組織Syk表達(dá)明顯降低，4 μmol/L的5-Aza-CdR使異常高甲基化狀態(tài)的Syk得到逆轉(zhuǎn)而重新表達(dá)。Mirza等[12]用5-AZA-CdR聯(lián)合PTX、ADR、5-FU對MDA、MB231 和MCF-7乳腺癌細(xì)胞株進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合10 μmol/L的5-Aza-CdR能增強(qiáng)化療藥物的作用，藥物聯(lián)合使用較單用5-Aza-CdR更顯著降低 SLIT2基因的甲基化水平。

Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR處理HCC細(xì)胞株Huh7后誘導(dǎo)甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶-1A基因mRNA轉(zhuǎn)錄及相應(yīng)蛋白表達(dá)，同時(shí)通過下調(diào)Bcl-2、上調(diào) Bax 和Caspase-3抑制細(xì)胞生長。黃鈾新等[14]用不同濃度的5-Aza-CdR作用HepG2細(xì)胞后，RT-PCR、Western blot分別檢測DLK1基因及蛋白的表達(dá)水平，用MTT、Transwell和流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2細(xì)胞的生長、侵襲性變化，發(fā)現(xiàn)處理后DLK1 mRNA及蛋白表達(dá)量均降低；HepG2細(xì)胞生長、增殖、侵襲能力得到抑制。在本實(shí)驗(yàn)中，對5種HCC細(xì)胞株進(jìn)行多種基因的去甲基化檢測，發(fā)現(xiàn)SLIT2基因在5種HCC細(xì)胞株中均出現(xiàn)甲基化產(chǎn)物條帶而無非甲基化產(chǎn)物條帶，提示SLIT2基因啟動子區(qū)域在五種HCC細(xì)胞株中為完全甲基化，甲基化狀態(tài)相同，證實(shí)SLIT2基因啟動子區(qū)域在五種HCC細(xì)胞株中均呈異常高甲基化現(xiàn)象，提示SLIT2基因異常甲基化在肝癌細(xì)胞株中為普遍現(xiàn)象，SLIT2基因異常甲基化預(yù)示腫瘤的發(fā)生，為肝癌發(fā)生的表觀遺傳學(xué)特征之一。用去甲基化制劑5-Aza-CdR處理各HCC細(xì)胞株后，SLIT2基因甲基化和非甲基化產(chǎn)物條帶同時(shí)出現(xiàn)，提示SLIT2基因異常甲基化得部分到逆轉(zhuǎn)。同時(shí)在轉(zhuǎn)錄水平應(yīng)用RT-PCR方法檢測去甲基化處理后SLIT2基因再表達(dá)情況，RT-PCR顯示處理前SLIT2 mRNA不表達(dá)或低表達(dá)，而處理后其產(chǎn)物表達(dá)則明顯增加。SLIT2基因去甲基化伴隨著轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)，說明兩者存在著內(nèi)在關(guān)聯(lián)，可以認(rèn)為該基因在肝癌細(xì)胞株中異常高甲基化導(dǎo)致了基因表達(dá)沉默，甲基化水平得到逆轉(zhuǎn)后又部分恢復(fù)了轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，從而部分開放了基因功能。本實(shí)驗(yàn)5-Aza-CdR通過甲基化調(diào)節(jié)作用誘導(dǎo)SUN449、 BEL-7402、Hep3B 3種細(xì)胞株中原本微弱表達(dá)甚至低表達(dá)的SLIT2 mRNA 重新表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符，但SMMC-7721和HepG2 細(xì)胞株中處理前后均出現(xiàn)明顯條帶，未得出5-Aza-CdR干預(yù)前后對轉(zhuǎn)錄的影響，原因可能是缺乏定量或半定量數(shù)據(jù)顯示表達(dá)變化，也可能有其他遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)機(jī)制參與抑癌相關(guān)基因的調(diào)控，下一步研究擬運(yùn)用定量及半定量的方法，設(shè)置藥物的濃度梯度干預(yù)判定去甲基化干預(yù)效果，另外尋找基因去甲基化修飾與其他表觀遺傳學(xué)變化之間的內(nèi)在聯(lián)系，進(jìn)一步探討HCC去甲基化干預(yù)的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

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(2014-10-11 收稿 2014-12-21 修回)

5-Aza-CdR induces demethylation of SLIT2 gene in human hepatoma cell lines

LiPeikun,GengXiaoping

DepartmentofGeneralSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230601,China

Objective To investigate the effect of 5-Aza-CdR on methylation state and transcription of SLIT2 gene in hepatocellular carcinoma cell lines, and to discuss mechanism of SLIT2 gene silencing in 5 human hepatoma cell lines as well as the effect of demethylation agent on its expression.MethodsAll cell lines of SUN449, BEL-7402, SMMC-7721, Hep3B and HepG2 were cultured in vitro and treated with 10 mmol/L 5-Aza-CdR. The promoter methylation state of SLIT2 gene and the mRNA expression of SLIT2 gene in the 5 hepatoma cell lines before and after 5-Aza-CdR treatment were detected by methylation-specific PCP (MSP) and reverse transcription-PCR (RT-PCR), respectively.ResultsPromoter hypermethylation of SLIT2 gene was detected in all 5 hepatoma cell lines and SLIT2 gene was expressed at a low level before 5-Aza-CdR treatment. After treated with demethylation agent 5-Aza-CdR, the promoter region of SLIT2 gene exhibited demethylation state, and gene expression increased significantly at mRNA level.ConclusionPromoter hypermethylation is a main mechanism of SLIT2 gene silencing in 5 human hepatoma cell lines, and could be reversed by demethylation agent 5-Aza-CdR.

5-Aza-CdR; Hepatocellular carcinoma; SLIT2 gene; DNA methylation

安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃面上項(xiàng)目 (編號：08010302191)

230601 合肥 安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.02.002