線粒體全基因組測序在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

姚 嵐，李萬水，胡 蘭， 徐 珍，*

（1.公安部物證鑒定中心 法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點實驗室，北京 10 0038；2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016）

線粒體全基因組測序在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

姚 嵐1，2，李萬水1，胡 蘭1， 徐 珍1，*

（1.公安部物證鑒定中心 法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點實驗室，北京 10 0038；2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016）

線粒體DNA檢測是法醫(yī)DNA檢驗的重要手段之一。隨著分子生物學(xué)和計算機技術(shù)的發(fā)展，二代測序技術(shù)的出現(xiàn)，使得線粒體DNA檢測從傳統(tǒng)的部分測序進入到全基因組測序時代。相對于部分測序，線粒體全基因組測序能夠提供更全面的序列信息，提高線粒體DNA檢測的識別率；同時也能夠通過對全基因組信息的深入分析，獲得樣本來源信息。本文介紹了經(jīng)典以及新出現(xiàn)的線粒體DNA測序策略，簡述了各種測序策略的優(yōu)缺點，在此基礎(chǔ)上重點介紹了線粒體全基因組測序在法醫(yī)遺傳學(xué)、線粒體相關(guān)疾病、衰老機制等方面的研究和應(yīng)用，最后探討了線粒體全基因組序列分析在法醫(yī)遺傳學(xué)實踐中應(yīng)用的可能性以及可能面臨的一些問題。

法醫(yī)遺傳學(xué)； 線粒體DNA；二代測序

人類線粒體DNA（mitochondrial DNA，mt DNA）位于細胞質(zhì)中，是一套獨立于核染色體之外的完整的遺傳物質(zhì)。線粒體DNA是一個雙鏈閉合環(huán)狀分子，其全長16569 bp的序列可分為編碼區(qū)和控制區(qū)兩個部分。其中，編碼區(qū)較為保守，共37個基因編碼多種RNA和蛋白質(zhì)?？刂茀^(qū)變異率較高，根據(jù)其在基因組上的位置，通常將其分為三個區(qū)域：位于線粒體DNA鏈16024～16365 bp的高變1區(qū) （hypervariable regionⅠ， HVⅠ），位于73～340 bp的高變2區(qū)（hypervariable regionⅡ， HVⅡ），以及位于340～576 bp的高變3區(qū) （hypervariable region Ⅲ， HVⅢ）。線粒體DNA具有許多獨特的特點和不可替代的作用。相對于核DNA，線粒體DNA的優(yōu)點在于：（1）在細胞中具有更高的拷貝數(shù)，在降解檢材中特別是當核DNA無法得到完整分型時，線粒體DNA信息便顯示出重要的利用價值；（2）由于經(jīng)常暴露于各種氧化反應(yīng)中［1］，線粒體DNA的變異率比核DNA更高，由此產(chǎn)生的多態(tài)性能夠為母系DNA比對提供依據(jù)，且部分多態(tài)性位點亦與地域人群進化相關(guān)；（3）線粒體DNA完全由母系遺傳，不存在基因重組，故在母系親屬關(guān)系鑒定中發(fā)揮著無可替代的作用。過去，由于測序技術(shù)以及樣本量有限等原因的限制，線粒體DNA在法醫(yī)遺傳學(xué)中的應(yīng)用主要是對其高變1區(qū)和2區(qū)的DNA序列進行測序比對，但僅對線粒體整個基因組的一部分進行分析會因信息不完整導(dǎo)致線粒體DNA鑒定結(jié)果無法判斷甚至出現(xiàn)錯誤，從而削弱線粒體檢測的識別能力［2， 3］，限制了其在法醫(yī)DNA鑒定中的應(yīng)用。

在分子生物學(xué)和計算機技術(shù)等相關(guān)技術(shù)飛速發(fā)展的今天，多種高新技術(shù)如多重PCR、高通量測序等技術(shù)的出現(xiàn)，使得在短時間內(nèi)快速準確地測定線粒體全基因組序列成為可能，而且隨著高通量測序成本的不斷降低，線粒體全基因組序列分析已逐漸成為線粒體DNA檢測的主要手段。尤其是二代測序技術(shù)的出現(xiàn)，使得法醫(yī)工作者能夠方便地獲得更全面的線粒體基因組信息，在提高線粒體DNA檢測識別率的同時，能夠獲得更多樣品來源信息。二代測序通過一個檢測過程就能得到目前所需的所有信息，非常適用于微量檢材的檢驗。有實驗室對線粒體全基因組測序結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)其能夠提供除高變區(qū)外的單倍體類型，從而獲得更全面的樣本mtDNA單倍群信息。更全面的單倍群信息的應(yīng)用可明顯降低線粒體DNA異質(zhì)性的假陽性率［4］，同時還能夠?qū)M織特異性進行檢測［5，6］。Parsons、Coble等［7， 8］提出，相對于僅對高變區(qū)進行測序分析，對線粒體的全基因組測序比對能夠明顯提高線粒體DNA在人群中的分辨力。除此之外，線粒體DNA本身還包含有許多其它的信息。線粒體在體內(nèi)作為能量供給站，其編碼的基因包括呼吸鏈的相關(guān)蛋白、氧化磷酸化相關(guān)蛋白、部分rRNA和tRNA等。相對于控制區(qū)，編碼區(qū)的變異率較低［9］，編碼區(qū)的序列能夠提供樣本來源有關(guān)的疾病信息，如有研究發(fā)現(xiàn)心肌?。?0］、腫瘤或動脈粥樣硬化［11］等疾病與線粒體DNA序列突變有關(guān)。

1 線粒體測序

線粒體DNA測序，主要有傳統(tǒng)的Sanger測序法，以及以DNA合成為基礎(chǔ)的二代測序方法。Sanger測序法是以雙脫氧核苷三磷酸（dideoxynucleotide triphosphate， ddNTP）終止反應(yīng)為基礎(chǔ)的測序方法。近年來由于硬件的不斷更新，亦能用于線粒體的全長測序，但由于其時間和成本均較高，該方法的推廣和應(yīng)用受到很大限制。目前，Sanger測序法仍是唯一符合法醫(yī)學(xué)驗證標準的測序法［12］。二代測序，又稱新一代測序（next generation sequencing， NGS），它以DNA合成為基礎(chǔ)，在多個片段同時復(fù)制時，通過檢測每條DNA鏈復(fù)制過程中釋放的離子轉(zhuǎn)化成的電信號或者DNA新鏈摻入時釋放的熒光信號而實現(xiàn)高通量并行測序。二代測序法能在短時間內(nèi)完成對線粒體基因組的高深度測序，相對經(jīng)典Sanger測序法靈敏度更高。

1.1 測序策略

測序的策略根據(jù)測序目的以及測序平臺的不同而有不同選擇。根據(jù)獲得線粒體DNA方法的不同可將測序分為直接測序和間接測序。直接測序是指先通過DNA提取或擴增獲得足夠的線粒體DNA后對其進行測序［13］。由于檢材量的限制，直接提取得到的DNA量往往非常有限，通常需對線粒體DNA進行PCR擴增或探針捕獲［14］進行富集后測序。對于線粒體DNA 16569 bp全基因組的擴增，需使用多對引物進行分段擴增。有文獻推薦使用65對引物［15］或34個擴增片段［16］對線粒體全基因組進行分段擴增，也有報道僅使用12對相互重疊的引物也能獲得良好的線粒體全基因組擴增效果［7，8］。由于法醫(yī)鑒定中的檢材大部分為降解檢材，為了提高DNA的檢出率，測序的策略應(yīng)盡量采用較小的擴增片段，并且為避免擴增片段間的相互干擾，還應(yīng)該減少不必要的擴增子數(shù)目。對于線粒體DNA而言，因其序列包含較多高變位點，且存在與核染色體高度同源的序列，使得線粒體測序策略的選擇有一定難度。Fendt等［17］先將16 kb長的線粒體DNA擴增為A、B兩個約8.5 kb長的片段，然后用48對測序引物對上述兩個長片段進行測序。此方法適合于DNA質(zhì)量較好的線粒體樣本。Lyons等［18］利用Sanger法對人群的線粒體全基因組進行測序，采用的是將16 kb的線粒體全基因組序列在96孔板中分成8個擴增子進行擴增，然后再利用多個測序引物進行多重擴增，共將其分為135個片段來進行測序。此方法大大降低了核線粒體DNA（nuclear mitochondrial DNA， NUMT）的干擾，使得測序DNA起始用量降至50 pg～1 ng。間接測序是指先通過測序得到樣品所有的DNA序列信息后，通過生物信息學(xué)的方法將線粒體DNA序列篩選出來。此方法很難進行質(zhì)量控制，也極易受假陽性和核DNA的干擾。在二代測序方面，Mikkelsen等［19］用二代測序平臺對10個無關(guān)個體的線粒體全基因組進行了檢測，采用的是將整個線粒體DNA片段分為2個擴增子進行測序。Schonberg［20］和Templeton［21］等也是先將線粒體DNA分成2個片段進行特異擴增后，再用物理方法將其打斷為適當大小的片段進行測序。此方法雖然可以減少其它非線粒體DNA的污染，但是如此大的擴增子在法醫(yī)降解檢材中很難擴增得到，而Templeton等在擴增片段前還利用探針捕獲的方法對線粒體DNA進行富集，能夠明顯提高二代測序的數(shù)據(jù)質(zhì)量。

1.2 線粒體DNA異質(zhì)性

線粒體DNA的異質(zhì)性，是指在同一個來源的線粒體基因組中，同一位置上出現(xiàn)兩種或兩種以上的分子類型?，F(xiàn)在的研究多認為異質(zhì)性的產(chǎn)生跟瓶頸理論［22］有關(guān)，且多發(fā)生在高代謝的組織上，如毛發(fā)等。線粒體的異質(zhì)性可分為兩種，一種是長度異質(zhì)性（length heteroplasmy， LHP），另一種為點異質(zhì)性（point heterolasmy， PHP）［4］。異質(zhì)性的發(fā)生類型多種多樣，包括：同一組織來源，不同細胞間；同一細胞，不同線粒體拷貝間；同一線粒體中，不同線粒體DNA分子間［23］。異質(zhì)性的出現(xiàn)，為法醫(yī)線粒體DNA鑒定帶來一定挑戰(zhàn)。但需要注意的是，異質(zhì)性并非出現(xiàn)于線粒體基因組的必然之物。傳統(tǒng)異質(zhì)性的研究是通過Sanger法測序獲得的，但通過Sanger法判斷點異質(zhì)性易受到引物或者異質(zhì)點位置的干擾，且沒有一個確定的異質(zhì)性標準，靈敏度也較低；而利用二代測序的方法，能夠得到整個線粒體DNA序列的異質(zhì)性位點信息，并且由于是通過雙向測序獲得，其結(jié)果更加準確可靠。通過目前二代測序?qū)€粒體DNA異質(zhì)性的研究表明，線粒體DNA異質(zhì)性的發(fā)生率要高于以往的研究結(jié)果［4］，但到底是由于檢測方法敏感度的增加導(dǎo)致的假陽性還是由于異質(zhì)性的確比之前認為的更易發(fā)生，以及如何將此方面研究應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實際案例，尚需進一步深入研究。除此之外，為了避免不完整測序造成的將可能的單倍型誤認為變異，現(xiàn)在一些線粒體DNA數(shù)據(jù)庫以全基因組范圍的單倍群為基礎(chǔ)［24］。

2 線粒體全基因組測序應(yīng)用研究

目前，已有多個實驗室對線粒體全基因組進行深入研究，由此線粒體全基因組數(shù)據(jù)近年飛速增長，僅2014年增加約15%［25］，其應(yīng)用范圍也越來越廣泛，包括法醫(yī)學(xué)中個體識別、親屬關(guān)系鑒定以及嫌疑的排除，臨床醫(yī)學(xué)上相關(guān)疾病的診斷、治療及危險因素的判斷等。在衰老的機制研究中，人們也普遍認為線粒體基因組變異與衰老有關(guān)。

2.1 法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

早在新的測序方法出現(xiàn)前便有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)線粒體的全基因組測序相較于高變區(qū)的測序有更高的識別能力［8］，但由于種種限制使得通過將編碼區(qū)的SNP位點聯(lián)合高變區(qū)測序成為全基因測序的替代［8］，但這始終無法達到全基因組測序的高分辨率。新的技術(shù)出現(xiàn)后，許多學(xué)者便嘗試將其用于法醫(yī)學(xué)的研究，包括Loreille等［26］利用二代測序平臺對高度降解的未知名骨骼樣本進行了線粒體全基因組測序。King等［27］對2014年英國出土的懷疑為理查三世的尸骨進行了鑒定，通過Y染色體、線粒體和表觀遺傳SNP相關(guān)位點的聯(lián)合應(yīng)用確認該遺骨確為理查三世。其中線粒體就是采用DNA雜交捕獲后的長片段擴增，在二代測序平臺上獲得全基因組數(shù)據(jù)，并得到了完美比對結(jié)果。另外，因為對于一些稀有的疑似單倍型的判斷依賴于準確的人群調(diào)查，已有的數(shù)據(jù)大多僅基于非編碼區(qū)的數(shù)據(jù)，而隨著越來越多的認識發(fā)現(xiàn)線粒體全基因組的分析更全面和準確，Just等［28］便用高通量的Sanger測序法對3個民族588個美國個體進行全基因組測序，為將來的全基因組比對提供了更好的基礎(chǔ)支持。除此之外，Bouhlal等［29］通過二代測序的方法輔以一代驗證對一對同卵雙胞胎進行了線粒體全基因組測序，發(fā)現(xiàn)了低頻率的不同的異質(zhì)性位點，但考慮到核DNA的干擾，且該實驗也缺乏不同年齡段的參考數(shù)據(jù)，因此有待進一步研究證實。

2.2 線粒體相關(guān)疾病

由于線粒體在體內(nèi)的主要功能是氧化供能，其變異極有可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。將線粒體單倍群與一些相關(guān)疾病，如白血病、Ⅱ型糖尿?。?0］、老年癡呆癥［31］等進行相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)線粒體全基因組的單倍型類型是疾病發(fā)生的相關(guān)因素。由于全基因組檢測技術(shù)的普及，使得線粒體基因的功能研究能夠進一步深入。Atilano等［32］使用了分子克隆和線粒體全基因測序的方法，確認了不同單倍群對甲基化的差別調(diào)控影響了炎癥反應(yīng)。另外，Zaragoza等［10］利用全測序分析的方法對母系遺傳的心肌病病人進行線粒體測序，發(fā)現(xiàn)了更多與疾病相關(guān)的變異位點。

2.3 衰老機制

氧化應(yīng)激是人體衰老的分子機制之一，當細胞出現(xiàn)氧化劑和抗氧化劑的不平衡時便會導(dǎo)致氧化應(yīng)激的累積?，F(xiàn)在認為在氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的活性氧作為強氧化劑對細胞的老化有重要的作用，線粒體作為細胞內(nèi)重要的產(chǎn)生活性氧的器官便在衰老的過程中起著重要的作用［33，34］。隨著年齡增長，線粒體發(fā)生的變異也明顯增多，目前也尚未明確是由于衰老導(dǎo)致的變異還是由變異造成的衰老，許多實驗也能明顯觀察到隨著年齡增長線粒體基因組的變異也隨之增加［35］。新的技術(shù)為線粒體全基因的變異檢測提供了新的解決方案，為線粒體和核DNA的聯(lián)合分析提供了可能［36］。能否將線粒體全基因的變異與死亡年齡推斷聯(lián)系起來應(yīng)用于法醫(yī)實際應(yīng)用中［37］，有待進一步的研究。

3 展 望

線粒體全基因組測序分析能夠為法醫(yī)學(xué)線粒體DNA鑒定帶來許多極具吸引力的新應(yīng)用。雖然已有不少關(guān)于基于二代測序的線粒體全基因組分析應(yīng)用的嘗試，目前還沒有能夠廣泛適用于法醫(yī)學(xué)微量DNA檢驗的解決方案，既保證測序結(jié)果的準確性，同時兼具高度靈敏性。另外，線粒體的全基因組分析要求對線粒體DNA數(shù)據(jù)庫進行進一步補充和完善，目前一些線粒體單倍型相關(guān)的數(shù)據(jù)庫，如PhyloTree build 16［24］，已經(jīng)進行了全基因組范圍的單倍型的補充，仍有許多相關(guān)的工作需進一步探索和累積。

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引用本文格式：姚嵐， 李萬水， 胡蘭， 等.線粒體全基因組測序在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 ［J］.刑事技術(shù)， 2015，40（5）:368-372.

Whole Genome Sequencing of Mitochondria and Its Application in Forensic Science

YAO Lan1，2， LI Wanshui1， HU Lan1， XU Zhen1，*
（1.Key Laboratory of Forensic Genetics of Ministry of Public Security， Institute of Forensic Science of Ministry of Public Security， Beijing 100038， China； 2.Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）

Compared to nuclear DNA， mitochondrial DNA （mtDNA） has many unique characters， and plays an important role in some specifi c cases.Traditional analysis of mitochondrial DNA is to partially sequence the high variant regions of mitochondrial genome.Presently， with the development of techniques in molecular biology and bioinformatics， the next generation sequencing （NGS） enables the mitochondrial DNA analysis into whole g enome sequencing which provides more comprehensive information and raises the power of discrimination.Furthermore， whole genome analysis of mitochondrial DNA will give extra information assisting in sample source inferring， haplogroup detecting， diseases testing and among others.In this paper， we will review the classic and the newly emerging mitochondrial sequencing strategies including their advantages and disadvantages.Besides， we will give a brief introduction to the new applications of mitochondrial genome sequencing in forensic genetics， mitochondria diseases and aging research， and show the novel findings along with these practices.Finally， we will discuss the prospect of forensic application of mitochondrial whole genome sequencing， as well as the benefi ts and potential problems it may bring together.

forensic genetics； mitochondrial DNA； next generation sequencing

DF795.2

A

1008-3650（2015）05-0368-06

10.16467/j.1008-3650.2015.05.005

公安部科技強警基礎(chǔ)工作專項項目（No.2013GABJC033）

姚 嵐（1985—），女，重慶人，博士研究生，研究方向為法醫(yī)遺傳學(xué)。 Email: 14312423@qq.com

徐 珍，女，主檢法醫(yī)師，博士，研究方向為法醫(yī)遺傳學(xué)。 E-mail: xuzhen@cifs.cifs.gov.cn

2015-07-13