低溫和外源NO對(duì)鐵皮石斛原球莖多糖合成的影響

張開(kāi)會(huì)，高素萍，劉柿良，李巧自，張科燕

（1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，成都611130；2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園林研究所，成都611130）

低溫和外源NO對(duì)鐵皮石斛原球莖多糖合成的影響

張開(kāi)會(huì)1，高素萍2＊，劉柿良1，李巧自1，張科燕1

（1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，成都611130；2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園林研究所，成都611130）

以鐵皮石斛（Dendrobium officinale）原球莖為材料，研究了低溫（4℃）、外源NO（NO供體SNP）以及NO清除劑（cPTIO）和一氧化氮合酶抑制劑（PBITU）對(duì)鐵皮石斛原球莖中NO含量、蔗糖合成酶（SS）活性、多糖含量以及蔗糖、果糖、葡萄糖等糖含量的影響，以明確低溫和內(nèi)源NO在多糖合成中的關(guān)系。結(jié)果顯示：（1）4℃低溫處理下，鐵皮石斛原球莖中NO含量顯著上升，SS活性升高，蔗糖、果糖和葡萄糖含量增加，多糖含量也得到提高；SNP（0.5mmol·L－1）處理與4℃低溫處理具有相似的效果；且低溫誘導(dǎo)的鐵皮石斛原球莖中SS活性提高和多糖含量的增加時(shí)期均在NO大量產(chǎn)生之后、蔗糖的積累早于果糖和葡萄糖。（2）4℃低溫＋SNP組合處理能夠顯著提高鐵皮石斛原球莖中SS活性、NO含量以及蔗糖、果糖、葡萄糖和多糖含量，它們分別比對(duì)照組顯著高出了68.04%，96.20%，60.69%、45.64%、66.90%和67.03%，且比低溫和SNP單獨(dú)處理效果都好。（3）PBITU能夠部分抑制低溫誘發(fā)鐵皮石斛原球莖中產(chǎn)生NO，抑制率達(dá)到77.15%；同時(shí)還抑制了低溫對(duì)鐵皮石斛原球莖中SS活性、多糖合成和蔗糖、果糖、葡萄糖積累的促進(jìn)作用。（4）SNP＋cPTIO和4℃＋cPTIO處理組中鐵皮石斛原球莖SS活性和蔗糖、果糖、葡萄糖、多糖含量及NO水平，且與對(duì)照組差異不顯著。研究表明，低溫和外源NO對(duì)鐵皮石斛原球莖多糖的合成均具有促進(jìn)作用，并且低溫可誘導(dǎo)鐵皮石斛原球莖產(chǎn)生NO，SS活性提高和多糖含量增加與NO產(chǎn)生相關(guān)，說(shuō)明NO是誘導(dǎo)鐵皮石斛原球莖多糖合成所必需的信號(hào)分子。

低溫；一氧化氮；鐵皮石斛原球莖；多糖；蔗糖合成酶

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）花型奇特，高雅芳香，是當(dāng)今世界上流行的蘭花之一，也是中國(guó)名貴的中草藥［1］。鐵皮石斛具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等藥理作用［2－3］。由于鐵皮石斛對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻，自然繁殖率低，且多年來(lái)對(duì)其過(guò)度采挖，造成野生鐵皮石斛資源日趨減少［1］。而目前人工栽培技術(shù)不夠完善，試管苗移植成功率不高，多方因素造成了藥材供需緊張。多糖是鐵皮石斛的主要活性成分，有文獻(xiàn)報(bào)道鐵皮石斛原球莖同原藥材多糖含量非常接近［4－5］，且藥理作用相同［6－7］。已有研究表明，影響鐵皮石斛原球莖多糖含量的因素主要包括碳源、氮源的種類和濃度［8－9］，外源激素和有機(jī)物［10］，以及光照強(qiáng)度［11］等。蘇江等［8］發(fā)現(xiàn)添加蔗糖有利于鐵皮石斛原球莖中多糖的積累。孟衡玲等［12］和滕建北等［13］進(jìn)一步證實(shí)，蔗糖合成酶（sucrose synthase，SS）活性、蔗糖含量與鐵皮石斛多糖的合成積累密切相關(guān)。原球莖（protocorm）是離體培養(yǎng)產(chǎn)生的組織，具有增殖效率高、生長(zhǎng)周期短、可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的特點(diǎn)，并具備與原植物同樣的形態(tài)發(fā)育和物質(zhì)代謝潛能［4］。鐵皮石斛原球莖可能部分替代原植物成為藥源，這將對(duì)鐵皮石斛資源的保護(hù)、再生和合理利用具有重要意義。

目前，已有研究發(fā)現(xiàn)低溫可誘發(fā)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，有利于其次生代謝產(chǎn)物的合成。低溫可促進(jìn)金絲桃（Hypericum brasiliense）中樺木酸（betulinic acid）和酚類化合物（phenolic compounds）的合成積累［14］以及睡茄（Withania somnifera）中睡茄素A（withanolide A）的合成［15］。

NO（Nitric oxide）已被證實(shí)是植物中的一種新型信號(hào)分子。近年來(lái)有一些研究報(bào)道NO參與了生物脅迫和非生物脅迫誘導(dǎo)的藥用植物次生代謝產(chǎn)物的合成調(diào)控［16］。Wang等［17］研究表明，真菌誘導(dǎo)子誘發(fā)了紅豆杉懸浮細(xì)胞中NO的產(chǎn)生，同時(shí)促進(jìn)了紫杉醇的生物合成，NO的合成主要是通過(guò)一氧化氮合酶（NOS）途徑產(chǎn)生。Zhang等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，紫外線（UV－B）處理下，垂枝樺（Betula pendula）葉片中硝酸還原酶（NR）活性升高，誘發(fā)了NO產(chǎn)生，并增強(qiáng)了NIA1和NIA2基因的表達(dá)和黃酮類（flavonoid）的合成。NO可能通過(guò)介導(dǎo)生物和非生物誘導(dǎo)子誘發(fā)植物細(xì)胞的防御反應(yīng)，激活細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物的合成代謝途徑。外源NO對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的合成也具有促進(jìn)作用。添加NO供體硝普鈉（SNP）有利于長(zhǎng)春花（Catharanthus roseus）懸浮細(xì)胞中長(zhǎng)春堿（catharanthine）的積累，并且具有劑量依賴性［19］。外源NO還可以通過(guò)提高半夏組培苗體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶（PAL）、谷氨酸合酶（GOGAT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性加速無(wú)機(jī)氮的同化及轉(zhuǎn)化效率，提供更多的代謝前體物質(zhì)以促進(jìn)總生物堿（total alkaloids）及鳥(niǎo)苷（guanosine）積累［20］。近年來(lái)的研究表明，NO、水楊酸（SA）、活性氧（ROS）等植物體內(nèi)的主要信號(hào)分子（途徑）不僅參與植物細(xì)胞次生代謝的信號(hào)調(diào)控，而且不同信號(hào)途徑之間可以通過(guò)共催化、互抑制、共協(xié)調(diào)等作用相互交叉形成復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［21］。從而證實(shí)了NO在植物細(xì)胞次生代謝信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的潛在分子開(kāi)關(guān)作用。

由于鐵皮石斛原球莖多糖合成途徑尙不明確，對(duì)于NO和低溫是否參與原球莖中多糖合成積累及其作用機(jī)制等問(wèn)題有待研究證實(shí)。為此，本試驗(yàn)以外源NO和低溫處理鐵皮石斛原球莖，分別研究了兩者對(duì)原球莖中多糖合成的影響以及低溫與內(nèi)源NO在多糖合成過(guò)程中的關(guān)系。為進(jìn)一步探尋鐵皮石斛原球莖多糖合成途徑提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為利用原球莖直接生產(chǎn)多糖提供新的方法。

1 材料和方法

1.1 鐵皮石斛原球莖的培養(yǎng)

本試驗(yàn)所采用的材料是從云南西雙版納藥用植物研究所引進(jìn)的鐵皮石斛無(wú)菌苗。選取長(zhǎng)勢(shì)健壯，株高在3cm以上的無(wú)菌苗作為試驗(yàn)對(duì)象。在超凈工作臺(tái)上小心剝?nèi)ト~片、切除根部，將莖段切成0.5～1.0cm的帶節(jié)小段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其配方為：MS＋1.0mg·L－16－BA＋0.5mg·L－1NAA。30d后將誘導(dǎo)出的原球莖接種于增殖培養(yǎng)基（MS＋1.0mg·L－16－BA＋0.2mg·L－1NAA）中，繼代培養(yǎng)60d后接種到MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加蔗糖30g·L－1、瓊脂7g·L－1，pH值為5.8。試驗(yàn)所用的鐵皮石斛原球莖已經(jīng)過(guò)30～40次繼代培養(yǎng)（每30d繼代1次），具有穩(wěn)定的形態(tài)特征和生長(zhǎng)速率。試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基，添加物及pH值均同上。培養(yǎng)條件為：無(wú)菌培養(yǎng)室晝／夜溫度為25℃／15℃，光照時(shí)間晝／夜為14 h／10h，光照強(qiáng)度2 000lx。

1.2 試驗(yàn)處理

1.2.1 低溫處理 挑選長(zhǎng)勢(shì)均一、生長(zhǎng)狀態(tài)良好、色澤鮮綠無(wú)分化的鐵皮石斛原球莖接入到組織培養(yǎng)瓶中，每瓶2.0g。試驗(yàn)設(shè)置4℃低溫和對(duì)照（CK）2個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。對(duì)照處理放入無(wú)菌培養(yǎng)室，低溫處理置于人工智能培養(yǎng)箱中，光照條件同無(wú)菌培養(yǎng)室，處理24h后放回?zé)o菌培養(yǎng)室進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。分別于處理0h、4h、8h、12h、24h及恢復(fù)7 d、14d測(cè)定NO、多糖、蔗糖、果糖和葡萄糖等含量及蔗糖合成酶（SS）活性。

1.2.2 外源NO處理 添加NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）0.5mmol／L于組織培養(yǎng)瓶中，對(duì)照（CK）處理加入等體積滅菌后的蒸餾水。SNP溶液經(jīng)0.22μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾滅菌加入到滅菌后的培養(yǎng)基中。將鐵皮石斛原球莖接入到上述處理的培養(yǎng)基中，然后放入無(wú)菌培養(yǎng)室培養(yǎng)。原球莖接種量、試驗(yàn)重復(fù)設(shè)置和指標(biāo)測(cè)定時(shí)間同低溫處理，測(cè)定的指標(biāo)包括多糖、蔗糖、果糖和葡萄糖等含量及SS活性。

1.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)處理 以鐵皮石斛原球莖進(jìn)行SNP、NO清除劑cPTIO（2－4－carboxyphenyl－4，4，5， 5－tetramethylimidazoline－1－oxyl－3－oxide）和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）抑制劑PBITU（S，S′－1，3－phenylene－bis（1，2－ethanediyl）－bis－isothiourea）對(duì)NO釋放、SS活性、多糖合成以及各種糖含量的影響試驗(yàn)。SNP、cPTIO及PBITU溶液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后，按照試驗(yàn)要求向培養(yǎng)基中加入不同體積的上述溶液，對(duì)照組加入等體積滅菌后的蒸餾水。試驗(yàn)包括6個(gè)處理，即CK（蒸餾水）、4℃低溫、0.5mmol·L－1SNP、4℃＋0.5 mmol·L－1SNP、4℃＋0.2mmol·L－1PBITU、4℃＋5mmol·L－1cPTIO、0.5mmol·L－1SNP＋5mmol·L－1cPTIO，每個(gè)處理3次重復(fù)。原球莖的接種量及接種方法同上。處理8h測(cè)定NO含量，24h測(cè)定蔗糖含量，R－7d（恢復(fù)7d）測(cè)定SS活性、多糖、果糖和葡萄糖等含量。試驗(yàn)中所用cPTIO和PBITU均購(gòu)自美國(guó)Sigma－Aldrich公司。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 NO含量 參照李杰等［22］的方法提取鐵皮石斛原球莖中NO，采用NO含量測(cè)定試劑盒（試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所）說(shuō)明書提供的方法測(cè)定NO含量，結(jié)果以μg·g－1表示。

1.3.2 多糖含量 先將各處理的原球莖洗凈培養(yǎng)基，在烘箱中105℃殺青20min后以60℃烘48h至恒重。然后研磨過(guò)40目篩，稱取干品粉末0.1g，參照葉余原等［23］的超聲法提取多糖，稍加改進(jìn)。多糖測(cè)定采用苯酚硫酸法［24］，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝142.94x＋1.166 6（R2＝0.996），以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量，單位為mg·g－1。

1.3.3 蔗糖合成酶活性 依據(jù)滕建北等［13］的方法，測(cè)定SS活性。稱取0.5g原球莖鮮樣，加入5 mL提取介質(zhì)（100mmol·L－1pH 7.2Tris－HCl，10mmol·L－1MgCl2，1mmol·L－1EDTA－Na2，10mmol·L－1DTT，2%乙二醇）于研缽中磨成勻漿后，倒入離心管，在低溫冷凍超速離心機(jī)上12 000 r／min離心10min，取上清液進(jìn)行酶活性測(cè)定。酶活性用每小時(shí)每克鮮重的蔗糖微克數(shù)表示（μg· g－1·h－1）。

1.3.4 糖含量測(cè)定 （1）蔗糖和果糖含量：蔗糖和果糖含量的測(cè)定采用曾儼等［25］的方法，稱取原球莖干品粉末約0.1g放入試管中，加入5mL蒸餾水于沸水中提取，取0.2mL提取液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝475.7x（R2＝0.996），果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝268.2x－2.372（R2＝0.996）。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蔗糖和果糖含量，結(jié)果以mg·g－1表示。所得果糖含量為提取液中總果糖基含量，應(yīng)減去蔗糖中所含果糖量（可由已測(cè)的蔗糖含量推導(dǎo)出來(lái)），即得到實(shí)際果糖含量。（2）葡萄糖含量：采用葡萄糖氧化酶法，根據(jù)葡萄糖測(cè)定試劑盒中的說(shuō)明操作（試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所），結(jié)果以mmol ·L－1表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

試驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行相關(guān)分析并作圖，運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），采用Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（α＝0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對(duì)鐵皮石斛原球莖內(nèi)源NO產(chǎn)生、SS活性和糖類合成積累的誘導(dǎo)

如圖1所示，在低溫刺激下鐵皮石斛原球莖中NO含量先急劇上升，處理8h后達(dá)到最高，并顯著高于對(duì)照水平（圖1，A；P＜0.05），隨后又迅速降低，但始終顯著高于對(duì)照；同時(shí)，原球莖中SS活性在4℃低溫處理8h后開(kāi)始緩慢上升，并在恢復(fù)期持續(xù)升高，恢復(fù)14d的SS活性高出對(duì)照2倍多（圖1，B）；同期原球莖中多糖含量在處理12h后才開(kāi)始增加，并在恢復(fù)期間持續(xù)增加，恢復(fù)14d時(shí)的含量是對(duì)照的3倍（圖1，C）?？梢钥闯?，低溫誘導(dǎo)的鐵皮石斛原球莖中SS活性提高和多糖含量的增加時(shí)期均在NO大量產(chǎn)生之后，NO產(chǎn)生與SS活性提高和多糖含量增加相關(guān)。

另外，由圖2可知，鐵皮石斛原球莖中蔗糖含量在4℃低溫處理4h后緩慢增加，在處理24h后達(dá)到峰值，并顯著高于對(duì)照（圖2，A，P＜0.05）；而其果糖和葡萄糖含量在低溫處理12h后才出現(xiàn)上升趨勢(shì)，且在恢復(fù)期持續(xù)增長(zhǎng)，于恢復(fù)14d后均高出對(duì)照2倍多（圖2，B、C）。說(shuō)明低溫促進(jìn)了鐵皮石斛原球莖中蔗糖、果糖和葡萄糖等糖類物質(zhì)的積累，并且蔗糖的積累早于果糖和葡萄糖。

2.2 外源NO對(duì)鐵皮石斛原球莖中SS活性及糖類合成積累的誘導(dǎo)作用

如圖3所示，以SNP單獨(dú)處理鐵皮石斛原球莖對(duì)其SS活性及多糖的含量都有促進(jìn)作用。其中，在SNP單獨(dú)處理下，鐵皮石斛原球莖中的SS活性漸漸上升，并在恢復(fù)7d后達(dá)到峰值，且顯著高于對(duì)照（圖3，A；P＜0.05）；而其多糖含量的變化趨勢(shì)與SS活性相似，也在恢復(fù)7d后達(dá)到最大值，此時(shí)高出對(duì)照3倍左右（圖3，B）。

同時(shí)，以SNP單獨(dú)處理鐵皮石斛原球莖也有利于蔗糖、果糖和葡萄糖的積累（圖4）。鐵皮石斛原球莖中蔗糖含量在SNP單獨(dú)處理4h后開(kāi)始明顯增加，在處理24h后達(dá)到峰值，此時(shí)約是對(duì)照的2倍，在恢復(fù)期則降低，但仍明顯高于同期對(duì)照（圖4，A）；而其果糖和葡萄糖含量在處理8h后才出現(xiàn)上升趨勢(shì)，在恢復(fù)7d后達(dá)到峰值，并顯著高于對(duì)照水平（圖4，B、C；P＜0.05），而后降低。可見(jiàn)。外源NO處理同樣有利于鐵皮石斛原球莖中SS活性增強(qiáng)和多糖、蔗糖、果糖、葡萄糖的積累。

2.3 cPTIO和PBITU對(duì)低溫和外源NO誘導(dǎo)的抑制作用

為了進(jìn)一步證實(shí)外源NO和低溫在誘導(dǎo)鐵皮石斛原球莖多糖合成中的作用，以及低溫和內(nèi)源NO在多糖合成中的關(guān)系，分別考查了NO清除劑cPTIO和一氧化氮合酶抑制劑PBITU對(duì)低溫和SNP處理下鐵皮石斛原球莖中NO含量、SS活性、多糖含量以及蔗糖、果糖、葡萄糖等糖含量的影響。如表1所示，4℃低溫＋SNP組合處理能夠顯著提高鐵皮石斛原球莖中SS活性、NO含量以及蔗糖、果糖、葡萄糖和多糖含量，它們分別比對(duì)照組顯著高出了68.04%，96.20%，60.69%、45.64%、66.90%和67.03%，且比低溫和SNP單獨(dú)處理效果都好。PBITU能夠部分抑制低溫誘發(fā)鐵皮石斛原球莖中產(chǎn)生NO，抑制率達(dá)到77.15%；同時(shí)還抑制了低溫對(duì)鐵皮石斛原球莖中SS活性、多糖合成和蔗糖、果糖、葡萄糖積累的促進(jìn)作用。SNP＋cPTIO和4℃＋cPTIO處理組中鐵皮石斛原球莖SS活性和蔗糖、果糖、葡萄糖、多糖含量及NO水平與對(duì)照組差異不顯著（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 低溫對(duì)鐵皮石斛原球莖多糖合成的影響

本研究表明，低溫（4℃）處理下，鐵皮石斛原球莖中NO產(chǎn)生、SS活性升高、多糖合成加強(qiáng)以及蔗糖、果糖、葡萄糖增加，且這些反應(yīng)具有先后順序。在低溫處理下，首先是NO含量急劇上升，然后蔗糖含量在低溫處理4h后開(kāi)始增加，隨后SS活性在8 h后持續(xù)升高，而葡萄糖、果糖和多糖含量在12h后才開(kāi)始緩慢增加。表明鐵皮石斛原球莖中NO產(chǎn)生、SS激活、糖積累和多糖合成之間具有因果關(guān)系。鐵皮石斛原球莖多糖主要由葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖等多種單糖組成［4］。蔗糖合成酶是調(diào)控蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一，目前普遍認(rèn)為蔗糖合成酶的主要功能是在蔗糖的降解方向，為多糖的合成提供前體物質(zhì)，催化蔗糖進(jìn)入各種代謝途徑［12］。低溫首先刺激了NO產(chǎn)生，然后促進(jìn)了蔗糖的積累，隨后激活了SS，進(jìn)一步促進(jìn)了蔗糖分解成果糖和葡萄糖，為多糖合成提供了前體物質(zhì)，最終導(dǎo)致多糖的合成。

在驗(yàn)證試驗(yàn)中表明，低溫處理下刺激了鐵皮石斛原球莖中產(chǎn)生NO，PBITU和cPTIO抑制了其產(chǎn)生，同時(shí)還抑制了低溫對(duì)鐵皮石斛原球莖中SS活性、多糖合成和蔗糖、果糖、葡萄糖的促進(jìn)作用。說(shuō)明低溫誘導(dǎo)所產(chǎn)生的NO是其觸發(fā)鐵皮石斛類原球莖SS活性、糖積累和多糖合成所必需的信號(hào)分子。本研究與Zhang等［18］證實(shí)UV－B輻射引起NO含量升高，NO作為信號(hào)分子參與UV－B對(duì)植物細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程等報(bào)道有相似之處。低溫可作為一種外界信號(hào)刺激植物細(xì)胞，然后與胞內(nèi)信使NO結(jié)合，從而引起細(xì)胞膜上和細(xì)胞內(nèi)一系列反應(yīng)，引發(fā)相關(guān)酶活性的變化及基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物的合成和積累［26］。

3.2 外源NO對(duì)鐵皮石斛原球莖多糖合成的影響

在本次研究中還發(fā)現(xiàn)，外源NO（SNP）直接處理也能提高鐵皮石斛原球莖中SS活性，增加蔗糖、果糖、葡萄糖等含量以及促進(jìn)多糖的積累，而這些促進(jìn)作用被cPTIO所阻斷，表明這些作用確實(shí)是由SNP分解出的NO所產(chǎn)生的。并且外源NO觸發(fā)的鐵皮石斛原球莖中SS激活、糖積累和多糖合成的先后順序與低溫處理相同，表明外源NO所誘導(dǎo)的多糖合成途徑與低溫作用相似。王博等［27］研究表明，水楊酸（SA）作為信號(hào)分子能夠促進(jìn)蔗糖的吸收與分解，提高胞內(nèi)果糖和葡萄糖的含量，改善霍山石斛（Dendrobium huoshanense）類原球莖對(duì)碳源的利用，從而促進(jìn)多糖的合成。在鐵皮石斛原球莖多糖合成過(guò)程中，NO作為信號(hào)分子發(fā)揮了和SA相似的作用。另外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，SNP處理下使霍山雜交石斛類原球莖產(chǎn)生防御反應(yīng)，發(fā)生活性氧迸發(fā)，從而促進(jìn)了生物堿的積累［28］。因此，本試驗(yàn)中SNP對(duì)鐵皮石斛原球莖多糖的促進(jìn)作用可部分歸因于SNP促發(fā)了鐵皮石斛原球莖的防御反應(yīng)，使得蔗糖、果糖、葡萄糖等可溶性糖積累，從而有利于多糖的合成。

低溫和SNP組合處理能夠顯著提高鐵皮石斛原球莖中NO含量，增強(qiáng)SS活性，增加蔗糖、果糖、葡萄糖和多糖含量，比低溫和SNP單獨(dú)處理效果好。cPTIO能夠有效清除NO，強(qiáng)烈地抑制了低溫和SNP對(duì)SS活性、糖積累和多糖合成的促進(jìn)作用。推測(cè)可能是低溫誘導(dǎo)的內(nèi)源NO和外源NO產(chǎn)生了協(xié)同作用，使鐵皮石斛原球莖中NO總含量增加，從而使多糖合成加強(qiáng)，其作用效果強(qiáng)于低溫和SNP單獨(dú)處理。在用超聲波誘導(dǎo)紅豆杉（Taxus yunnanensis）細(xì)胞中NO產(chǎn)生和紫杉醇的生物合成的研究中也得到了類似的結(jié)果［29］，但其具體作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，低溫可作為一種外界信號(hào)刺激鐵皮石斛原球莖產(chǎn)生胞內(nèi)信使NO，并與之結(jié)合引發(fā)了SS活性升高，蔗糖、果糖和葡萄糖含量增加，為多糖合成提供前體物質(zhì)，最終導(dǎo)致多糖的合成積累；外源NO一方面可作為信號(hào)分子提高SS活性，促進(jìn)蔗糖的吸收與分解，提高鐵皮石斛原球莖胞內(nèi)果糖和葡萄糖的含量，改善鐵皮石斛原球莖對(duì)碳源的利用，從而促進(jìn)多糖的合成。另一方面還可通過(guò)促發(fā)鐵皮石斛原球莖的防御反應(yīng)，使得蔗糖、果糖、葡萄糖等可溶性糖積累，從而有利于多糖的合成。所以，低溫和外源NO對(duì)鐵皮石斛原球莖多糖的合成均有促進(jìn)作用，并且低溫可誘導(dǎo)鐵皮石斛原球莖產(chǎn)生NO，NO是其誘導(dǎo)多糖合成所必需的信號(hào)分子。本研究豐富了多糖合成的理論基礎(chǔ)，同時(shí)還為有效提高鐵皮石斛原球莖多糖含量提供了重要的技術(shù)參考。

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（編輯：裴阿衛(wèi)）

Effects of Low Temperature and Exogenous Nitric Oxide on Polysaccharide Synthesis in Dendrobium officinale Protocorm

ZHANG Kaihui1，GAO Suping2＊，LIU Shiling1，LI Qiaozi1，ZHANG Keyan1
（1Landscape Architecture College of Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；2Institute of Landscape Architecture of Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China）

In this paper，we used Dendrobium officinale protocorm as materials and studied the impact of low temperature（4℃），exogenous NO（NO donor SNP），NO scavenger（cPTIO）and nitric oxide synthase inhibitors（PBITU）on NO content，the sucrose synthase（SS）activity，and the content of polysaccharide，sucrose，fructose，glucose in D.officinale protocorm to clear the relationship between low temperature and endogenous NO in the course of polysaccharide synthesis.The results showed that：（1）Under the low temperature（4℃）treatment，the NO content significantly increased，the SS activity enhanced and the content of sucrose，fructose，glucose and polysaccharide increased in D.officinale protocorm.SNP（0.5 mmol·L－1）treatment had the similar effect to the low temperature（4℃）treatment；under the low temperature（4℃）treatment，the SS activity and polysaccharide content increased after a lot of NO produced，sucrose accumulated earlier than fructose and glucose.（2）4℃＋SNP treatment could significantly improve the SS activity，and the content of NO，sucrose，fructose，glucose，polysaccharide in D.officinale protocorm.They were significantly higher 68.04%，96.20%，60.69%，45.64%，66.90%and 67.03%than that of control group，and the effect was better than that in low temperature（4℃）or SNP separate treatments.（3）PBITU could partially inhibit NO production in D.officinale protocorm which induced by low temperature（4℃）and the inhibition rate was 77.15%；it also inhibited the promotion of the SS activity，polysaccharide synthesis and the accumulation of sucrose，fructose，glucose in D.officinale protocorm which induced by low temperature（4℃）.（4）Under SNP＋cPTIO and 4℃＋cPTIO treatments，the SS activity and the content of sucrose，fructose，glucose，polysaccharide and NO in D.officinale protocorm had no significant difference with the control group.Studies had shown that the low temperature and exogenous NO could promote polysaccharide synthesis in D.officinale protocorm，and low temperature induced NO production，the SS activity exaltation and polysaccharide content addition were associated with NO production.In D.officinale protocorm，NO is a necessary signal molecule for its polysaccharide synthesis.

low temperature；nitric oxide；Dendrobium officinale protocorm；polysaccharide；sucrose synthase

Q945.78；Q257

A

1000－4025（2015）08－1626－08

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1626

2015－01－23；修改稿收到日期：2015－06－01

四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012FZ0083）；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家級(jí)創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201410626015）

張開(kāi)會(huì)（1989－），女，在讀碩士研究生，主要從事藥用植物次生代謝研究。E－mail：zhangkaihui1989＠126.com

＊通信作者：高素萍，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事生態(tài)學(xué)研究。E－mail：gao＿suping＠yahoo.com