Apelin／APJ系統(tǒng)在脂多糖誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞損傷中的變化及其作用研究

劉煥龍，朱忠寧，江 平，韓 雨，蘇素文，陳雪彥

（1．河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，河北石家莊 050000；2．河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，河北石家莊 050017）

Apelin／APJ系統(tǒng)在脂多糖誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞損傷中的變化及其作用研究

劉煥龍1，朱忠寧2，江 平2，韓 雨2，蘇素文2，陳雪彥2

（1．河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，河北石家莊 050000；2．河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，河北石家莊 050017）

中國圖書分類號：R-332；R322．12；R322．35；R329．24；R392．11；R544.022；R977.6

摘要：目的 探討Apelin／APJ系統(tǒng)在脂多糖誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞（PMVECs）損傷中的變化，并研究Apelin的作用及機制。方法 采用植塊法培養(yǎng)大鼠PMVECs，VIII因子相關(guān)抗原免疫細胞化學(xué)染色進行鑒定。噻唑藍（MTT）比色法測定PMVECs活力；RT-PCR法檢測Apelin、APJ mRNA表達的變化；Western blot法檢測大鼠PMVECs中PCNA蛋白表達及Akt的磷酸化水平。結(jié)果 LPS在短時間內(nèi)能夠使Apelin、APJ mRNA表達水平呈代償性上升（P＜0.01），但隨著作用時間延長，基因表達受到明顯抑制，低于對照組（P＜0.05或P＜0.01），提示Apelin／APJ系統(tǒng)可能參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs損傷。MTT結(jié)果表明，10－9～10－6mol· L－1的Apelin明顯促進了大鼠PMVECs增殖（P＜0.05或P ＜0.01），且具有一定的濃度和時間依賴性。而且，Apelin還不同程度地改善了LPS誘導(dǎo)的PMVECs細胞損傷（P＜0.05 或P＜0.01）。另外，Western blot結(jié)果顯示，Apelin還明顯逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的PCNA蛋白表達和Akt磷酸化水平的降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論 Apelin／APJ系統(tǒng)參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs損傷。Apelin對于維護肺微血管內(nèi)皮細胞功能，干預(yù)LPS誘導(dǎo)的PMVECs損傷起著重要作用，可能與其激活A(yù)kt磷酸化通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：Apelin；APJ；脂多糖；肺微血管內(nèi)皮細胞；增殖；Akt；增殖細胞核抗原（PCNA）

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．028．html

肺動脈高壓因其基礎(chǔ)疾病不同，發(fā)病機制也不盡相同，但卻有相似的組織病理學(xué)變化，如內(nèi)膜纖維化、管壁增厚及局部血栓形成，最終導(dǎo)致肺循環(huán)血流動力學(xué)紊亂，肺動脈壓力增高。目前認為，肺動脈高壓發(fā)病的細胞與分子機制中肺血管內(nèi)皮細胞特別是肺微血管內(nèi)皮細胞（pulmonary microvascular endo-thelial cells，PMVECs）受損起著關(guān)鍵性作用［1］。PM-VECs是肺組織的重要實質(zhì)細胞，在肺損傷過程中，既是首位受損傷的靶細胞，又是活躍的炎癥細胞和效應(yīng)細胞，有著復(fù)雜的代謝功能，對肺循環(huán)相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展起著不可忽視的重要作用［2］。

研究資料表明，多種生物活性物質(zhì)，特別是生物活性小分子的分泌或活性異常參與了急性肺損傷、肺動脈高壓的病理進程［3］。Apelin作為一種新的血管活性多肽，在肺組織中和其受體APJ聯(lián)合表達水平最高［4］。對肺動脈高壓臨床和動物模型的實驗研究也表明Apelin／APJ系統(tǒng)參與了肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展［5］。Apelin除了具有多數(shù)舒血管活性物質(zhì)所具有的功能外，還有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗細菌、抗病毒感染的功能，對內(nèi)皮細胞功能的維護起著重要作用［6］。然而，Apelin在肺損傷中的作用和機制還遠未明了，如Apelin／APJ系統(tǒng)在PMVECs炎性損傷中的動態(tài)變化如何，外源性給予Apelin能否保護PM-VECs，是否可能改善各種肺動脈高壓，從而作為新的治療靶點，都值得進一步的探討。因此，本課題首次從細胞水平出發(fā)，探討了Apelin／APJ系統(tǒng)在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)大鼠PMVECs損傷中的作用及可能機制，為進一步闡明Apelin與肺動脈高壓的關(guān)系及其防治作用提供基礎(chǔ)實驗資料。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1動物 Wistar♂大鼠（100～150 g）用于原代培養(yǎng)PMVECs，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1．1．2藥品與試劑 Apelin購自美國Santa Cruz公司，用無血清DMEM培養(yǎng)液溶解配制成10－3mol ·L－1的母液，－80℃保存，臨用時用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度；LPS（Escherichia coli 055：B5）購自美國Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；MTT、胰蛋白酶購自北京索來寶科技有限公司；PCNA、Akt、p-Akt抗體購自Abcam公司；β-actin抗體購自北京中杉金橋公司；IRDye 800、IRDye 700標記的二抗購自美國Rockland公司；Apelin、APJ上下游引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；TRIzol、M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)購自美國Invitrogen公司；PCR Master Mix（2×）購自美國Thermo公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．1．3實驗儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱、HEALFORCE超凈工作臺，上海力申儀器公司；5412R低溫離心機，德國Eppendorf公司；倒置顯微鏡、光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；Floustar多功能微板分析儀，德國BMG公司；ND-1000紫外／可見光分光光度計，美國NanoDrop公司；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)，Gene Company Limited；DYY-11型多用電泳儀、DYC-Z22A型電泳槽，北京六一儀器廠；凝膠成像儀，美國Thermo Forma公司。

1．2方法

1．2．1PMVECs培養(yǎng)與鑒定 采用組織塊種植法原代培養(yǎng)［7－8］：大鼠腹腔注射3 000 U肝素鈉并麻醉后，無菌環(huán)境下從右心室注入D-Hanks液對心肺進行灌注，取出肺組織，剪去肺表面的臟層胸膜，剪下肺表面1～3 mm深的肺外緣組織，清洗后將其剪成約1 mm3大小的組織塊，均勻接種到25 cm2一次性無菌塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)，加事先配制好的DMEM培養(yǎng)液（含20%胎牛血清、100 kU·L－1青霉素、100 kU ·L－1鏈霉素、50 μg·L－1VEGF、90 kU·L－1肝素鈉）約1.5 mL于培養(yǎng)瓶內(nèi)，以剛好浸沒組織塊為宜，避免組織塊漂浮。于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每天換液1次以去除血細胞。貼壁60 h時，輕輕去除組織塊，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每3 d換液1次，直至瓶底細胞基本匯合后，傳代培養(yǎng)。運用鏡下觀察、機械刮除及差速消化法進行純化，去除成纖維細胞及平滑肌細胞等混雜細胞。VIII因子相關(guān)抗原免疫細胞化學(xué)染色進行鑒定。

1．2．2細胞分組與處理 取對數(shù)生長期的PM-VECs消化分離，并制備合適密度的細胞懸液，接種于96孔板或培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)1～2 d至細胞融合達80%左右時，用含0.1%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h作同步化處理。然后隨機分為LPS（10 mg·L－1）處理不同時間組、Apelin不同濃度組，用于不同指標的檢測。其它實驗中，另取上述同步化的細胞隨機分為對照組、LPS（10 mg·L－1）組、Apelin（10－9、10－8mol·L－1）組：對照組加入等體積的0.1%胎牛血清培養(yǎng)液處理，Apelin組先用不同濃度Apelin預(yù)處理，2 h后加入終濃度為10 mg·L－1的LPS刺激細胞24 h，檢測PMVECs活力、PCNA蛋白表達以及Akt的磷酸化水平。

1．2．3MTT法檢測細胞活力 細胞懸液以適當?shù)拿芏冉臃N于96孔板中，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h使細胞完全貼壁。細胞生長同步化，按“1．2．2”方法分組并接受不同處理，每組設(shè)6個平行孔。①在LPS、Apelin作用不同時間對PMVECs影響的實驗中，將同步化的細胞隨機分為LPS（10 mg·L－1）、Apelin （10－8mol·L－1）處理0、3、6、12、24、48 h組，各處理組在時間點到達后每孔加入20 μL MTT溶液（5 g· L－1），置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸棄各孔上清液終止培養(yǎng)，每孔加入200 μL二甲基亞砜（DMSO）溶液溶解紫色結(jié)晶，室溫條件下輕輕震蕩10 min，置Floustar多功能微板分析儀上，于490 nm波長條件下測定各孔光密度值（OD值）；②在觀察Apelin不同濃度對細胞活力的影響實驗中，各組在加入終濃度為10－10、10－9、10－8、10－7、10－6mol·L－1Apelin后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后按上述方法加入MTT進行測定；③在觀察Apelin對LPS誘導(dǎo)的PMVECs損傷的影響實驗中，同步化的細胞先加入不同濃度的Ape-lin預(yù)處理，2 h后加入終濃度為10 mg·L－1的LPS處理細胞24 h，然后按上述方法加入MTT進行測定。

1．2．4RT-PCR實驗 將生長良好的PMVECs按“1．2．2”方法分組，同步化的細胞經(jīng)LPS處理不同時間后，收集細胞，采用TRIzol一步法抽提細胞總RNA，采用ND-1000紫外／可見光分光光度計進行RNA定量。用M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)試劑盒合成cDNA，產(chǎn)物用PCR Master Mix（2×）系統(tǒng)試劑盒進行PCR擴增。Apelin、APJ以及β-actin的引物序列見Tab 1。PCR反應(yīng)條件為：94℃2 s，94℃15 s，55 ℃30 s，72℃40 s，72℃5 min，共35個循環(huán)。取PCR產(chǎn)物4 μL，直接上樣，進行10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳，100 V恒壓電泳，20～40 min，Gold view顯色，凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增產(chǎn)物條帶的大小及亮度，使用Biocapture系統(tǒng)成像，拍照，Bio1D軟件進行圖像分析，測定產(chǎn)物條帶的灰度值，計算目標產(chǎn)物與β-actin的比值，作為各擴增產(chǎn)物mRNA的相對表達量。

Tab 1 Primers used for PCR analysis

1．2．5免疫印跡實驗 將生長良好的PMVECs按“1．2．2”方法分組，各組經(jīng)LPS處理后，收集細胞，加入RIPA細胞裂解液裂解細胞，提取蛋白，使用ND-1000紫外／可見光分光光度計進行蛋白定量。等量蛋白（40 μg）上樣，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上（4℃，2 h），室溫下含50 g·L－1脫脂奶粉的TBST封閉1 h，加入一抗（β-actin、PCNA、Akt、p-Akt），4℃過夜，次日TBST液洗膜后，加入相應(yīng)二抗（1∶5 000稀釋），37℃，1 h。TBST液洗膜3次，Odyssey 9120雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描PVDF膜并成像保存。PCNA蛋白的相對含量用其灰度值與β-actin的灰度值的比值表示，Akt的磷酸化水平用p-Akt／Akt來表示。

1．2．6統(tǒng)計方法 采用SPSS 15．0軟件進行數(shù)據(jù)分析，Origin 7．5軟件進行圖像處理。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，Dunnet t檢驗進行組間比較。

2　結(jié)果

2．1PMVECs體外培養(yǎng)及鑒定 采用組織貼塊法并加以改良成功培養(yǎng)出大鼠PMVECs，接種后24 h發(fā)現(xiàn)組織塊周圍有較多細胞呈放射狀貼壁生長（Fig 1A）。去除組織塊后，剩下的細胞繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，形成細胞單層，呈梭形或多角形，排列緊密，匯合成片，呈典型的鋪路鵝卵石狀（Fig 1B）。另外，我們采用VIII因子相關(guān)抗原免疫細胞化學(xué)染色進行鑒定，結(jié)果表明，約95%的細胞表現(xiàn)為VIII因子相關(guān)抗原表達陽性，高倍鏡下可見胞質(zhì)呈棕黃色（Fig 1C），結(jié)合我們的取材部位為肺外邊緣組織，可以證實分離培養(yǎng)的細胞為PMVECs。

2．2LPS作用不同時間PMVECs中Apelin、APJ mRNA表達的變化 PCR產(chǎn)物經(jīng)1．0%瓊脂糖凝膠電泳后，可在相應(yīng)位置見到清晰條帶。分析結(jié)果表明，10 mg·L－1LPS作用于PMVECs后，Apelin mR-NA表達升高，在6 h達到高峰（P＜0.01）；6 h后Apelin mRNA的表達呈不同程度地下降，在24 h和48 h Apelin mRNA的表達明顯低于對照組（P＜0.05或P＜0.01，F(xiàn)ig 2A）。另外，APJ mRNA的表達在LPS作用不同時間中也表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。與對照組相比，APJ mRNA表達在6 h即明顯升高（P＜0.01），在12 h達到高峰（P＜0.01），隨后又明顯下降，在48 h時，APJ mRNA的表達也明顯低于對照組（P＜0.05，F(xiàn)ig 2B）。提示Apelin／APJ系統(tǒng)可能參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs損傷。

2．3Apelin對PMVECs增殖的影響 首先觀察了不同濃度Apelin作用24 h對大鼠PMVECs增殖的影響，結(jié)果表明，與對照組相比，10－10mol·L－1Apelin對大鼠PMVECs增殖沒有明顯影響，隨著濃度增加，10－9、10－8、10－7、10－6mol·L－1Apelin明顯促進了大鼠PMVECs增殖（P＜0.05或P＜0.01，F(xiàn)ig 3A）。但Apelin濃度超過10－8mol·L－1并沒有表現(xiàn)出更強的促增殖作用。隨后，我們觀察了10－8mol·L－1Apelin作用不同時間對大鼠PMVECs增殖的影響，結(jié)果表明，與對照組（Apelin 0 h）相比，Apelin作用6～48 h明顯誘導(dǎo)細胞增殖（P＜0.05 或P＜0.01，F(xiàn)ig 3B）。

Fig 1 Morphology and identification of rat PMVECs

Fig 2 Changes of mRNA expression of Apelin and APJ in rat PMVECs after LPS（10 mg·L－1）treatment for indicated durations（±s，n＝3）

2．4Apelin對LPS誘導(dǎo)PMVECs損傷的影響首先觀察了10 mg·L－1LPS作用不同時間對大鼠PMVECs生長的影響，結(jié)果表明，與對照組（LPS 0 h）相比，10 mg·L－1LPS作用12 h即開始明顯抑制細胞生長（P＜0.05），隨著作用時間的延長（24、48 h），細胞生長進一步受到抑制（P＜0.01，F(xiàn)ig 4A）。另外，我們還觀察了Apelin（10－9、10－8mol·L－1）對LPS作用24 h誘導(dǎo)的PMVECs損傷的影響，結(jié)果表明，10－9、10－8mol·L－1Apelin對LPS導(dǎo)致的細胞損傷有不同程度的改善（與LPS組相比，P＜0.05 或P＜0.01，F(xiàn)ig 4B）。

2．5Apelin對LPS誘導(dǎo)PMVECs中PCNA蛋白表達及Akt磷酸化水平的影響 PCNA表達的高低反映了細胞的增殖能力。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS作用24h明顯降低了PMVECs中PCNA蛋白表達（P＜0.01），也明顯抑制了Akt的磷酸化水平（P＜0.01）。而Apelin（10－9、10－8mol· L－1）預(yù)處理均明顯干預(yù)了LPS誘導(dǎo)的PCNA蛋白表達及Akt磷酸化水平的降低（P＜0.05或P＜0.01，F(xiàn)ig 5）。

Fig 3 Effect of Apelin on proliferation of rat PMVECs examined by MTT assay（±s，n＝3）

Fig 4 Injury of LPS on rat PMVECs and intervention effect of Apelin（±s，n＝3）

Fig 5 Effect of LPS on the protein expression of PCNA and the phosphorylation of Akt and the intervention effect of Apelin（±s，n＝3）

3　討論

肺微血管與急性肺損傷、肺動脈高壓等疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)。而構(gòu)成肺微血管的重要細胞PMVECs以緊密連接的方式內(nèi)覆于肺血管腔表面，不僅參與凝血、血管再生以及血管通透性等過程，也是各種細胞因子和炎性因子的作用靶點，在肺損傷相關(guān)疾病的進程中起著關(guān)鍵作用［9］。本實驗中，我們嚴格控制實驗細節(jié)，成功培養(yǎng)大鼠PMVECs，并采用機械刮除法和局部消化法去除雜細胞，獲得了較為理想的細胞來源。

眾所周知，肺臟易受細菌、病毒等感染因素的侵襲，且肺部存在的反復(fù)感染與肺部疾病本身、肺動脈高壓的發(fā)展密切相關(guān)。Apelin作為一種新的血管活性多肽，在肺組織中和APJ聯(lián)合表達水平最高。令人感興趣的是，Apelin除了類似于多數(shù)舒血管活性物質(zhì)所具有的功能外，還有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗炎、抗病毒感染的功能。眾多肺動脈高壓臨床和動物模型實驗研究也表明，Apelin／APJ系統(tǒng)可能參與了肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展。Goetze等［10］也發(fā)現(xiàn)動脈高壓患者血漿Apelin水平明顯低于正常對照組。因此，具有內(nèi)源性保護作用的Apelin生成減少或代謝異常可能是導(dǎo)致肺循環(huán)穩(wěn)態(tài)失衡的重要因素之一。在本實驗中，我們觀察了Apelin對大鼠PMVECs增殖的影響，結(jié)果表明，隨著濃度增加，Apelin明顯促進了大鼠PMVECs增殖。但Apelin濃度超過10－8mol ·L－1并沒有表現(xiàn)出更強的促增殖作用。隨后，我們觀察了10－8mol·L－1Apelin作用不同時間對大鼠PMVECs增殖的影響，發(fā)現(xiàn)Apelin作用6～48 h能明顯誘導(dǎo)大鼠PMVECs增殖。這些結(jié)果表明Apelin對內(nèi)皮細胞功能的維護起著重要作用。

LPS作為革蘭陰性桿菌外膜上的一種糖蛋白，是強烈的炎癥啟動因子，可導(dǎo)致組織細胞發(fā)生功能障礙、結(jié)構(gòu)破壞乃至凋亡壞死等一系列病理改變［11］。LPS可直接或間接損傷PMVECs，形成肺水腫、低氧血癥或肺動脈高壓［12－13］，但涉及的機制仍需進一步闡明。本實驗中我們觀察了LPS作用不同時間PMVECs中Apelin、APJ mRNA表達的變化，發(fā)現(xiàn)二者mRNA的表達在LPS作用不同時間中表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，可能是由于LPS在短時間內(nèi)能夠使Apelin、APJ mRNA表達水平呈代償性上升，但隨著作用時間延長，基因表達受到明顯抑制。提示Apelin／APJ系統(tǒng)可能參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs損傷。接下來的MTT實驗結(jié)果也表明，Apelin還不同程度地改善了LPS誘導(dǎo)的PM-VECs細胞損傷。進一步提示，Apelin／APJ系統(tǒng)對于維護內(nèi)皮細胞功能起著重要作用。

為深入探討Apelin保護PMVECs的作用機制，本實驗還觀察了PCNA蛋白表達以及Akt信號通路在LPS誘導(dǎo)PMVECs損傷中的變化，以及Apelin對此的干預(yù)作用。PCNA是分子質(zhì)量為36 ku的核蛋白，在調(diào)節(jié)DNA合成和細胞增殖方面起重要作用［14］。結(jié)果表明，Apelin對LPS誘導(dǎo)的PCNA蛋白表達的降低有明顯的抑制作用，提示Apelin的PM-VECs保護作用與升高PCNA蛋白表達有關(guān)。另外，Apelin能明顯逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的Akt磷酸化水平的降低，促進Akt磷酸化。據(jù)報道，PI3K／Akt信號通路的激活通過降低促凋亡基因的活性、上調(diào)抗凋亡基因的表達而在維護細胞功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Akt是PI3K下游的直接靶蛋白，其磷酸化參與細胞活動的多種調(diào)節(jié)［15］。因此，Akt磷酸化通路可能是Apelin發(fā)揮微血管內(nèi)皮細胞保護作用的機制之一。

綜上所述，Apelin／APJ系統(tǒng)參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs損傷，Apelin對于維護PMVECs功能，干預(yù)LPS誘導(dǎo)的PMVECs損傷起著重要作用，可能與其激活A(yù)kt磷酸化通路有關(guān)。

（致謝：該實驗主要在河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室完成，感謝該室在實驗技術(shù)和儀器設(shè)備上提供的幫助。）

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The changes and effects of Apelin／APJ system in LPS-induced injury of rat pulmonary microvascular endothelial cells

LIU Huan-long1，ZHU Zhong-ning2，JIANG Ping2，HAN Yu2，SU Su-wen2，CHEN Xue-yan2
（1．the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China；2．Dept of Pharmacology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

Abstract：Aim To explore the changes of Apelin／APJ system in LPS-induced injury of rat pulmonary mi-crovascular endothelial cells（PMVECs），and the effect and mechanism of Apelin．Methods PMVECs were cultured with the explant technique，and the identifica-tion of rat PMVECs was carried out by immunocyto-chemical staining of factorⅧrelated antigen．MTT as-say was used to evaluate the viability of PMVECs．The mRNA expression of Apelin and APJ was detected by RT-PCR．The protein expression of PCNA and the phosphorylation of Akt was analyzed by Western blot．Results The mRNA expression of Apelin and APJ showed a compensatory increase after LPS treatment for a short period of time（P＜0.01），but with the exten-sion of time，which was significantly inhibited，even lower than the control group（P＜0.05 or P＜0.01），suggesting that Apelin／APJ system might be involved in LPS-induced PMVECs injury．MTT results showed that 10－6～10－9mol·L－1Apelin obviously promoted the proliferation of rat PMVECs（P＜0.05 or P＜0.01），and with certain concentration and time de-pendence．Moreover，Apelin also improved the LPS-induced PMVECs injury in different degrees（P＜0.05 or P＜0.01）．In addition，Western blot analysis showed that Apelin significantly reversed the decrease of the protein expression of PCNA and the Akt phos-phorylation level induced by LPS（P＜0.05 or P＜0.01）．Conclusions The Apelin／APJ system is in-volved in LPS-induced PMVECs injury．Apelin plays an important role in protecting the pulmonary microvas-cular endothelial function and reversing the LPS-in-duced PMVECs injury，which might be related to the activation of Akt phosphorylation pathway．

Key words：Apelin；APJ；lipopolysaccharide（LPS）；pulmonary microvascular endothelial cells（PMVECs）；proliferation；Akt；proliferating cell nuclear antigen （PCNA）

作者簡介：劉煥龍（1976－），男，博士，副主任藥師，研究方向：心血管藥理學(xué)，Tel：0311-86261032，E-mail：lhlong1026＠163．com；陳雪彥（1978－），女，博士，副教授，研究方向：心血管藥理學(xué)，通訊作者，Tel：0311-86265644，E-mail：cxylong＠126．com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No 81273600）；河北省自然科學(xué)基金資助項目（No H2013206147）

收稿日期：2015－04－03，修回日期：2015－05－05

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1152－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．025