螺旋藻多糖對CHB患者PBMC免疫功能的影響

呂小華，陳文青，羅世英，吳 鐵，呂世靜

（廣東醫(yī)學(xué)院1．藥理學(xué)教研室、2．檢驗學(xué)院，廣東湛江 524023）

螺旋藻多糖對CHB患者PBMC免疫功能的影響

呂小華1，陳文青2，羅世英1，吳 鐵1，呂世靜2

（廣東醫(yī)學(xué)院1．藥理學(xué)教研室、2．檢驗學(xué)院，廣東湛江 524023）

中國圖書分類號：R329．24；R392．12；R512．620．3；R977．6；R977．7

摘要：目的 觀察螺旋藻多糖對慢性乙型肝炎患者外周血單個核細(xì)胞免疫功能的影響。方法 運用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分別測定螺旋藻多糖對慢性乙型肝炎患者外周血單個核細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期的影響，采用ELISA法檢測外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4濃度，同時用RT-PCR法檢測外周血單個核細(xì)胞IFN-γ mRNA的表達。結(jié)果 螺旋藻多糖能增強慢性乙型肝炎患者外周血單個核細(xì)胞的增殖能力，能增強慢性乙型肝炎患者外周血單個核細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2，且能降低分泌IL-4。螺旋藻多糖能上調(diào)慢性乙型肝炎患者外周血單個核細(xì)胞IFN-γ mRNA的表達。結(jié)論 螺旋藻多糖對慢性乙型肝炎患者外周血單個核細(xì)胞的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞：螺旋藻多糖；慢性乙型肝炎；外周血單個核細(xì)胞；干擾素；白細(xì)胞介素-2；白細(xì)胞介素-4

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．022．html

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染人體后，機體的免疫反應(yīng)決定疾病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，細(xì)胞免疫功能異常是造成HBV持續(xù)感染的主要原因之一。由于持續(xù)HBV感染及復(fù)制激發(fā)的免疫應(yīng)答失調(diào)與慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者病情遷延不愈密切相關(guān)，而Th1／Th2平衡失調(diào)是其免疫功能紊亂的重要表現(xiàn)之一［1－2］。螺旋藻多糖（polysacchrides of Spirulina platensis，PSP）是從螺旋藻提取分離出來的水溶性多糖，是一類具有促進細(xì)胞生長、抗輻射、抗衰老、降血脂、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性、促進蛋白質(zhì)合成等功能的天然生物活性物質(zhì)［3］。本研究通過觀察PSP對CHB患者外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）免疫功能的影響，探討PSP的免疫調(diào)節(jié)作用，從而為進一步研究PSP的藥物開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1．1研究對象 在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科治療的CHB患者30例，其中CHB輕度、中度、重度患者各10例；其中男24例，女6例，年齡18～59歲。診斷和臨床分型符合2000年聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》慢性乙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。6例正常人均為健康體檢者。所有的標(biāo)本獲取及處理都是經(jīng)過患者的知情同意，經(jīng)所在機構(gòu)的醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1．2藥物與試劑 螺旋藻粉由海南三亞海王海洋生物科技有限公司提供。采用改良的三氯乙酸去蛋白法提取螺旋藻粗多糖，純度達90%以上。RPMI 1640、TRIzol（美國Gibco公司）；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液、MTT（美國Sigma公司）；RT-PCR兩步法試劑盒（美國Promega公司）；ELISA試劑盒（深圳晶美生物工程公司）；PHA（上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司）。

1．3主要儀器 ELx800型酶標(biāo)儀（美國BIO-TEK公司）；Epics-XL型流式細(xì)胞儀（美國COULTER公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Shell／LAB公司）；PCR儀（寶生物工程有限公司）。

1．4PBMC的分離 無菌采集靜脈血3 mL注入抗凝試管中，將血液緩慢加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液（Focill）中，以2 000 r·min－1，離心10 min，分離出PBMC。

1．5PSP對PBMC增殖功能的影響 用含20%新生小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液稀釋PB-MC，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×109·L－1，將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，分別加入10 mg·L－1PHA和25、50、100、200、400、1 000 mg·L－1PSP，同時加入PBS做陰性對照，最后加入RPMI 1640完全培養(yǎng)液補至每孔200 μL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h后，每孔加入5 mg·L－1MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔再加入三聯(lián)液100 μL，混勻，放置過夜，次日用酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度OD570值。

1．6PSP對CHB患者PBMC細(xì)胞周期的影響將細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，分別加入10 mg·L－1PHA和100、200、400 mg·L－1PSP，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，離心收集細(xì)胞，用PBS洗2次，加入70%冷乙醇固定細(xì)胞，4℃放置過夜，1 000 r·min－1，離心5 min，棄乙醇，用PBS洗沉淀2次，再用震蕩器震散細(xì)胞，加入PI染液，混勻，15 min后在流式細(xì)胞儀檢測。

1．7PSP對CHB患者PBMC分泌細(xì)胞因子的影響將細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，分別加入10 mg·L－1植物凝集素（phytohemagglutinin，PHA）和400 mg·L－1PSP，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，1 000 r·min－1離心，收集上清，分別用IFN-γ、IL-2和IL-4 ELISA檢測試劑盒定量上清液中的細(xì)胞因子含量。具體操作按ELISA說明書進行。

1．8PSP對CHB患者PBMC IFN-γ基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 ①引物設(shè)計與合成：β-actin upstream：5′-ACACTGTGCCCATCTACG-3′，downstream：5′-CAGGATTCCATACCCAAG-3′；INF-γ upstream：5′-TGTAGCGGATAATGGAAC-3′，downstream：5′-GTAT-TGCTTTGCGTTGGA-3′。②總RNA的提取：將細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，分別加入10 mg ·L－1PHA和100、200、400 mg·L－1PSP，培養(yǎng)48 h后，按TRIzol說明書提取RNA。③RT-PCR按試劑盒操作。取5 μL PCR產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，然后在紫外透射儀觀察電泳結(jié)果并拍照。圖片用Bandscan 4．3圖像分析軟件進行光密度積分值分析，計算出IFN-γ／β-actin mRNA的光密度積分值之比作為IFN-γ mRNA的相對含量值。

2　結(jié)果

2．1PSP對健康人和CHB患者PBMC增殖功能的影響 如Tab 1所示，在PHA的協(xié)同刺激下，PSP在濃度為50～400 mg·L－1范圍能夠促進PHA對健康人和CHB患者PBMC的增殖作用，且促進作用隨著藥物濃度的增加而增大，但濃度達1 000 mg·L－1時，促進作用有所下降。

2．2PSP對CHB患者PBMC細(xì)胞周期的影響結(jié)果如Tab 2和Fig 1所示，PHA對照組PBMC周期發(fā)生G0／G1期向S期轉(zhuǎn)換，與空白對照組相比，差異具有顯著性（P＜0.01）；低、中、高濃度藥物組PB MCG0／G1期細(xì)胞明顯降低，分別為80.25%、77.03%和75.78%，S期細(xì)胞明顯增加，分別為12.27%、14.45%和17.68%，與PHA對照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05或P＜0．01）。

Tab 1 Effect of PSP on proliferation of PBMC from healthy individuals and patients with chronic hepatitis B virus infection（±s，n＝6）

Tab 1 Effect of PSP on proliferation of PBMC from healthy individuals and patients with chronic hepatitis B virus infection（±s，n＝6）

＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs PHA group

Group　Concentration／mg·L－1　OD570（normal）　OD570（CHB）Control　－　0．180±0．010　0．096±0．008 PHA?。?．250±0．004＃?！?．146±0．004＃＃PSP　25　0．255±0．005　0．150±0．004 50　0．265±0．012*　0．154±0．004*100　0．279±0．008**　0．163±0．003**200　0．291±0．012**　0．174±0．004**400　0．304±0．008**　0．196±0．002**1 000　0．279±0．003**　0．168±0．003**

Tab 2 Effect of PSP on cell cycle of PBMC from patients with chronic hepatitis B virus infection（±s，n＝6）

Tab 2 Effect of PSP on cell cycle of PBMC from patients with chronic hepatitis B virus infection（±s，n＝6）

＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs PHA group

Group　Concentration／mg·L－1　G0／G1／%　S／%　G2／M／% Control?。?0．53±0．44　7．05±0．22　2．42±0．23 PHA　－　81．81±0．41＃＃11．63±0．27＃?！?．45±0．25＃＃PSP　100　80．25±0．48　12．27±0．36*　7．48±0．17*200　77．03±0．27**14．45±0．35**　8．52±0．31**400　75．78±0．21**17．68±0．33**　6．53±0．31**

2．3PSP對CHB不同臨床分型患者PBMC分泌細(xì)胞因子的影響 ELISA檢測結(jié)果見Tab 3。相對于正常對照組，PHA單獨誘導(dǎo)與聯(lián)合PSP誘導(dǎo)相比，聯(lián)合PSP誘導(dǎo)組使得PBMC產(chǎn)生IFN-γ和IL-2水平明顯增高，與PHA單獨誘導(dǎo)組相比差異具有顯著性（P＜0.05）；但PBMC產(chǎn)生IL-4水平差異無顯著性。對于CHB患者，PHA和PSP聯(lián)合誘導(dǎo)后，PBMC產(chǎn)生IFN-γ水平明顯增高，其中慢性中度和重度乙型肝炎患者組最為突出（P＜0.01）；PBMC產(chǎn)生IL-2水平也明顯增高，其中慢性中度乙型肝炎患者組最為突出（P＜0.01）；而PBMC產(chǎn)生IL-4水平有所下降，與PHA單獨誘導(dǎo)組相比，除慢性重度乙型肝炎患者組差異有顯著性外（P＜0.05），其余兩組均無明顯差異。

2．4PSP對CHB患者PBMC IFN-γ mRNA表達的影響 從Tab 4和Fig 2可以看出，PSP組CHB患者PBMC IFN-γ mRNA表達量高于PHA組（P＜0.01）。圖像分析的結(jié)果表明，IFN-γ mRNA／β-actin mRNA灰度積分比值亦呈以上改變。

Fig 1 Effect of PSP on cell cycle of PBMC from patients with chronic hepatitis B virus infection

Tab 3 Effect of PSP on Th1／Th2cytokine concentration in supernatant of PBMC in patients with chronic hepatitis B virus infection（1×10－6mg·L－1，±s，n＝6）

Tab 3 Effect of PSP on Th1／Th2cytokine concentration in supernatant of PBMC in patients with chronic hepatitis B virus infection（1×10－6mg·L－1，±s，n＝6）

A：Normal control group；B：Mide group；C：Moderate group；D：Severe group．＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs normal control；*P＜0.05，**P＜0.01 vs PHA group．

Antigen　Cytokine　A　B　C　D PHA　IFN-γ　4 665．0±164．3　4 347．0±426．0?！? 088．0±216．6＃?！? 841．0±181．2＃＃IL-2　242．4±15．9　124．6±12．7＃＃　141．2±13．8＃?！?53．7±16．7＃＃IL-4　168．2±18．7　213．0±19．3＃?！?68．5±13．2＃＃　317．7±17．7＃＃400 mg·L－1PSP　IFN-γ　4 847．0±188．7*　4 674．0±237．2*　4 416．0±143．1＃＃**　4 800．0±218．5**＋PHA　IL-2　265．3±28．7*　138．6±11．1＃＃*　159．8±13．9＃＃**　168．8±13．1＃＃*IL-4　157．3±16．8　200．8±17．8＃?！?60．7±12．8＃＃　295．8±17．1＃＃*

Tab 4 Effect of PSP on mRNA expression level of IFN-γ in supernatant of PBMC in patients with chronic hepatitis B virus infection

3　討論

Fig 2 Effect of PSP on expression of IFN-γ mRNA in PBMC cul-tural supernatant of patients with chronic hepatitis B virus infection

慢性乙型病毒性肝炎的發(fā)病及轉(zhuǎn)歸機制十分復(fù)雜，與機體的免疫狀態(tài)有關(guān)。免疫中細(xì)胞免疫處于核心地位，其免疫病理主要是由T細(xì)胞免疫應(yīng)答狀態(tài)決定的。在PBMC中富含T細(xì)胞，在機體免疫應(yīng)答中占有重要的地位，同時也是HBV肝外的一個重要靶細(xì)胞［4］。Th細(xì)胞分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞兩種，Th1／Th2細(xì)胞的平衡可能決定HBV感染的清除和病變的程度。如果Th1細(xì)胞占優(yōu)勢與清除病毒有關(guān)，將促進細(xì)胞免疫，傾向于發(fā)生急性或自限性肝炎；而如果Th2細(xì)胞占優(yōu)勢，則將抑制細(xì)胞免疫，發(fā)生持續(xù)性HBV感染［5］。如何增強Th1優(yōu)勢表達，提高細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能是目前治療CHB主要策略之一。所以用藥物刺激機體免疫細(xì)胞Th細(xì)胞，增強Th1型細(xì)胞因子的表達具有重要的意義［6］。

Grzanna等［7］從螺旋藻中提取一種高分子量多糖，能夠增強人Th1型細(xì)胞中的趨化因子如IL-8、單核細(xì)胞炎性蛋白-1α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1等基因的表達水平，同時能夠增強IL-1β、TNF-α和環(huán)氧化酶2的表達水平。Mao等［8］研究發(fā)現(xiàn)，食用以螺旋藻為主的食品添加物能夠抑制IL-4的生成，從而調(diào)節(jié)過敏性鼻炎患者的Th1／Th2細(xì)胞平衡。PSP能增強NK細(xì)胞活性，刺激T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-γ等的分泌［9］。這些研究表明，PSP能夠影響機體的免疫細(xì)胞功能，從而調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)。

螺旋藻在肝腎高脂血癥和氧化損傷中具有保護作用［10］。Moura等［11］通過對糖尿病大鼠模型的研究，發(fā)現(xiàn)運動和食用螺旋藻相結(jié)合可以降低低密度脂蛋白膽固醇和肝脂質(zhì)水平。Cheong等［12］發(fā)現(xiàn)，螺旋藻的攝取能降低高膽固醇血癥大白兔模型動脈粥樣硬化。Pak等［13］發(fā)現(xiàn)，螺旋藻可能通過抗氧化和抗炎癥作用機制降低炎癥反應(yīng)。由此可知，螺旋藻在保護肝臟、抗氧化損傷方面具有重要作用［14］。PSP在HepG2．2．15細(xì)胞培養(yǎng)中，能夠抑制細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg，且對HBV-DNA的抑制作用具有明顯的劑量關(guān)系［15］。PSP在HepG2 2．2．15細(xì)胞培養(yǎng)中可明顯抑制HBsAg、HBeAg的分泌以及HBV-DNA的合成，具有直接抗HBV作用，提示PSP可與其它抗HBV藥物聯(lián)合用于CHB的治療［16］。國內(nèi)外研究表明［17－18］，螺旋藻具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、護肝、抗炎、抗氧化、膜穩(wěn)定性等作用，能夠有效穩(wěn)定慢性肝病患者的病情，在防止慢性肝病患者肝纖維化中起著一定的作用，同時能夠防止慢性肝病患者轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不?/p>

本實驗發(fā)現(xiàn)，無論是健康人還是CHB患者，在PHA的協(xié)同刺激下，PSP在濃度為50～400 mg· L－1范圍能夠促進PHA對人PBMC的增殖作用，且促進作用隨著藥物濃度的增加而增大，但濃度達1 000 mg·L－1時，促進作用有所下降。CHB患者PHA對照組PBMC細(xì)胞周期發(fā)生G0／G1期向S期轉(zhuǎn)換，與空白對照組相比，差異具有顯著性；低、中、高濃度藥物誘導(dǎo)組PBMC G0／G1期細(xì)胞明顯降低，S期細(xì)胞明顯增加，與PHA對照組相比，差異具有顯著性。結(jié)果表明PSP對健康人和CHB患者都具有免疫調(diào)節(jié)作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)，對于正常對照組而言，PHA單獨誘導(dǎo)同聯(lián)合PSP誘導(dǎo)相比，PBMC產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2水平明顯增高，但產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子IL-4水平差異無顯著性。與正常對照組相比，CHB患者血清中Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ水平相對降低，Th2型細(xì)胞因子IL-4水平相對增高，提示患者細(xì)胞免疫功能低下，不能有效清除體內(nèi)的HBV，致使HBV持續(xù)感染形成慢性化。對于不同程度的CHB患者，PHA和PSP聯(lián)合誘導(dǎo)后，PBMC產(chǎn)生IFN-γ水平明顯增高，與正常對照組相比差異具有顯著性；PBMC產(chǎn)生IL-2水平也明顯增高，其中慢性中度乙型肝炎患者組最為突出；而PBMC產(chǎn)生IL-4水平有所下降，與正常對照組相比，除慢性重度乙型肝炎患者組差異有顯著性外，其余兩組均無差異。

本實驗還通過采用RT-PCR檢測PSP與PHA 對CHB患者PBMC細(xì)胞因子IFN-γ mRNA表達的影響，結(jié)果表明，PSP能在轉(zhuǎn)錄水平上提高CHB患者PBMC IFN-γ mRNA的表達水平。由此可見，PSP的免疫調(diào)節(jié)作用與其在轉(zhuǎn)錄水平上促進IFN-γ mR-NA的表達是分不開的，這可能也是PSP發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)與抗病毒作用的重要機制之一。

綜上所述，PSP與PHA一同誘導(dǎo)CHB患者PB-MC時，促進機體免疫細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進程，可使抗原PHA活化PBMC產(chǎn)生IFN-γ和IL-2的水平增高，產(chǎn)生IL-4的水平下降，而且能提高細(xì)胞因子IFN-γ mRNA的表達水平，表明PSP可以增強PHA的Th1細(xì)胞應(yīng)答能力，促進Th0向Th1的轉(zhuǎn)化，同時對Th2的形成有一定的抑制作用，在恢復(fù)Th1／Th2細(xì)胞平衡中起到一定的作用。

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The immunoregulative action of polysacchrides of Spirulina platensis in peripheral blood mononuclear cells in patients with chronic hepatitis B virus infection

LYU Xiao-hua1，CHEN Wen-qing2，LUO Shi-ying1，WU Tie1，LYU Shi-jing2
（1．Dept of Pharmacology，2．Institute of Laboratory Medicine，Guangdong Medical University，Zhanjiang Guangdong 524023，China）

Abstract：Aim To investigate the immunoregulative action of polysacchrides of Spirulina platensis（PSP）on peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）in pa-tients with chronic hepatitis B virus infection．Meth-ods Proliferation and cycle of PBMCs from patients with chronic hepatitis B virus infection were measured by MTT colorimetry and flow cytometry respectively．The concentration of IFN-γ，IL-2，IL-4 in supernatants of PBMCs were examined by ELISA．The mRNA ex-pression of IFN-γ in PBMCs from patients with chronic hepatitis B virus infection was detected by RT-PCR．Results PSP could induce proliferation of PBMCs in patients with chronic hepatitis B virus infection．In ad-dition，PSP could increase the protein expression of IFN-γ and IL-2 in supernatants of PBMCs in patients with chronic hepatitis B virus infection，and PSP could also enhance the mRNA expression of IFN-γ of PBMCs in patients with chronic hepatitis B virus infection．However，PSP inhibited the protein expression of IL-4 of PBMCs in patients with chronic hepatitis B virus in-fection．Conclusion PSP can promote the immune function and plays an important immunoregulation function on patients with chronic hepatitis B virus in-fection．

Key words：polysacchrides of Spirulina platensis；chronic hepatitis B；peripheral blood mononuclear cells；interferon；interleukin-2；interleukin-4

作者簡介：呂小華（1976－），女，碩士，副教授，研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)，Tel：0759-2388588，E-mail：30817916＠qq．com；呂世靜（1949－），男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：免疫學(xué)，通訊作者，E-mail：sjlujyx＠126．com

基金項目：廣東省社會發(fā)展領(lǐng)域科技計劃項目（No 73043）；湛江市財政資金科技專項備用經(jīng)費資助項目（No 2014C01032）；廣東醫(yī)學(xué)院面上項目（No M2012013）

收稿日期：2015－04－07，修回日期：2015－04－27

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1121－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．019