PPARα、PPARγ的上調(diào)參與淫羊藿苷對自發(fā)性高血壓大鼠心室重構(gòu)的調(diào)節(jié)

王穎婉，李葉麗，王俊逸，華 亮，楊丹莉

（遵義醫(yī)學院藥理學教研室，基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州遵義 563000）

PPARα、PPARγ的上調(diào)參與淫羊藿苷對
自發(fā)性高血壓大鼠心室重構(gòu)的調(diào)節(jié)

王穎婉，李葉麗，王俊逸，華 亮，楊丹莉

（遵義醫(yī)學院藥理學教研室，基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州遵義 563000）

中國圖書分類號：R-332；R322.11；R331．31；R329．11；R544．1

摘要：目的 觀察淫羊藿苷（icariin，Ica）對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）心室重構(gòu)的作用，并探討其機制。方法 14周齡♂SHR大鼠21只隨機分為模型組，Ica低、高劑量組（20、40 mg·kg－1，ig，bid），14周齡♂WKY大鼠為空白對照組，空白對照組和模型組給予等體積的雙蒸水灌胃。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，連續(xù)灌胃12周后處死全部動物，采用雙抗體夾心法測定左心羥脯氨酸的含量；Masson染色觀察左心室組織病理學變化；real-time RT-PCR、Western blot分別檢測PPARα、PPARγ mRNA和蛋白的表達。結(jié)果 與空白對照組相比，模型組出現(xiàn)心室重構(gòu)，心肌纖維化，心肌組織羥脯氨酸含量明顯上升（P＜0.01），PPARα、PPARγ mRNA和蛋白表達明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組相比，Ica低、高劑量組心肌細胞排列較整齊，心肌纖維化減少，且心肌羥脯氨酸含量降低，PPARα、PPARγ mRNA和蛋白表達升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論 淫羊藿苷具有減輕自發(fā)性高血壓大鼠心室重構(gòu)的作用，其機制可能與上調(diào)PPARα、PPARγ有關(guān)。

關(guān)鍵詞：淫羊藿苷；左心室重構(gòu)；過氧化物酶體增殖物激活受體α；過氧化物酶體增殖物激活受體γ；自發(fā)性高血壓大鼠；蛋白印跡技術(shù)

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．021．html

心室重構(gòu)作為心臟事件的獨立危險因素，與心律失常、心力衰竭和猝死等有密切的關(guān)系［1］，表現(xiàn)為心肌肥厚、心腔擴大、心臟的收縮和舒張功能障礙，是心臟疾病走向終末期的一個必然階段［2］。近年來研究表明，PPARα、PPARγ的激活對心血管具有保護效應(yīng)，且心室重構(gòu)時PPARα、PPARγ被抑制，導致心肌脂質(zhì)和能量代謝紊亂，因此PPARα、PPARγ在心室重構(gòu)的過程中發(fā)揮著重要的作用［3］。

淫羊藿具有“補腎陽，祛風濕，益氣力，強心力”等功效。淫羊藿苷（icariin，Ica）是淫羊藿的主要活性成分之一，具有降血壓、抗腫瘤、增強免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及抗骨質(zhì)疏松等作用［4］。本研究擬進一步確證Ica是否具有抗自發(fā)性高血壓大鼠心室重構(gòu)的作用，及該作用是否與PPARα、PPARγ的表達變化有關(guān)。

1　材料與方法

1．1動物 14周齡♂自發(fā)性高血壓大鼠（SHR），

14周齡同源正常的京都大鼠（WKY），SPF級，體質(zhì)量260～300 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2012－0001。

1．2試劑與儀器 淫羊藿苷（純度≥98%）購于南京澤朗醫(yī)藥有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；PPARα、PPARγ mRNA引物由寶生物工程（大連）有限公司合成；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；PPARα、PPARγ兔抗大鼠抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；real-time RT-PCR擴增儀、i-mark酶標儀、電泳儀、Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)及CCD成像系統(tǒng)均系美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；Leica光學顯微鏡為德國Leica Microsystems Ltd產(chǎn)品。

1．3分組及給藥 21只14周齡♂SHR大鼠隨機分為模型組、Ica低劑量組（20 mg·kg－1）、Ica高劑量組（40 mg·kg－1），7只WKY大鼠為空白對照組。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，Ica低、高劑量組灌胃給藥，每日2次，至26周齡，空白和模型組灌胃給予等體積雙蒸水，實驗結(jié)束后處死全部動物，取標本備用。

1．4觀察指標及檢測

1．4．1心肌中羥脯氨酸（Hyp）含量的檢測 采用ELISA方法檢測大鼠心肌羥脯氨酸含量。稱取50 ～60 mg心肌組織放入1 mL PBS緩沖液中冰浴勻漿，離心后取上清，稀釋標準品、加樣、溫浴、洗滌、加酶、洗滌、顯色、測定。計算大鼠心肌中Hyp含量。膠原相對濃度（mg·g－1）＝Hyp相對濃度×7.46［5］。

1．4．2形態(tài)學觀察 取各組大鼠心臟組織，置于10%福爾馬林固定48 h后，經(jīng)脫水、包埋、切片和Masson染色，Leica光學顯微鏡下觀察心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)，并拍照記錄。

1．4．3心肌組織中PPARα、PPARγ mRNA的表達每組各取心臟標本5例，采用real-time RT-PCR法檢測。PPARα、PPARγ的mRNA引物序列由寶生物工程（大連）有限公司合成，見Tab 1。目的基因表達相對定量法：以PCR擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需的循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct值）為統(tǒng)計參數(shù)，依次計算平均Ct值＝（Ct1＋Ct2）／2（重復(fù)管）；dCt＝平均Ct值－中間值；基因的表達＝2－dCt；相對定量＝目的基因的表達／內(nèi)參基因的表達×100，將空白對照組的mRNA表達量設(shè)定為100。

Tab 1 Primer pair of real time RT-PCR

1．4．4心肌組織中PPARα、PPARγ蛋白的測定Western blot法測定心肌組織中PPARα、PPARγ蛋白含量，每組大鼠取心臟組織，每個樣本加入總蛋白裂解液，在冰塊中操作勻漿，BCA法進行蛋白定量，用酶標儀在波長為560 nm的條件下測得OD值，配成同體積同濃度后，加入上樣緩沖液變性，加樣進行分離膠和濃縮膠板中電泳，取膠放入轉(zhuǎn)印槽中進行轉(zhuǎn)印，取出轉(zhuǎn)印膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST清洗，放入稀釋好的一抗中，PPARα（1∶1 000）、PPARγ （1∶800），4℃過夜。放入稀釋后的二抗中（1∶3 000），加超敏ECL發(fā)光劑進行顯色。采用Quantity One定量分析軟件系統(tǒng)對圖像進行灰度值測定。

1．5統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16．0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)±s表示，組間比較采用方差分析，組內(nèi)比較采用t檢驗。

2　結(jié)果

2．1各組大鼠膠原含量的結(jié)果 與空白組相比，模型組心肌中膠原含量明顯上升（P＜0.01），與模型組相比，Ica低、高劑量組的膠原含量明顯下降（P＜0.01或P＜0.05），見Fig 1。

Fig 1 Effect of Ica on concentration of collagen fiber of left ventricle（±s，n＝5）

2．2形態(tài)學觀察 Masson染色顯示，與空白組相比，模型組心肌細胞肥大、延長，排列紊亂，膠原聚集，血管周圍纖維化和心肌間質(zhì)纖維化明顯增加。與模型組相比，Ica低、高劑量組心肌細胞排列較整齊，血管周圍纖維化及間質(zhì)纖維化均減輕，且高劑量組減輕更為明顯。見Fig 2。

Fig 2 Masson staining of myocardial cells（×400）

2．3心肌組織中PPARα、PPARγ mRNA的表達與空白組相比，模型組PPARα、PPARγ mRNA的表達下調(diào)（P＜0.01或P＜0.05）。與模型組相比，Ica低、高劑量組PPARα、PPARγ mRNA的表達明顯上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），見Fig 3。

2．4心肌組織中PPARα、PPARγ蛋白的表達 與空白組相比，模型組PPARα、PPARγ蛋白含量明顯減少（P＜0.01）。與模型組相比，Ica低、高劑量組PPARα、PPARγ蛋白含量明顯增高（P＜0.01），見Fig 4。

Fig 3 Effect of Ica on the mRNA expression of PPARα，PPARγ in SHR（±s，n＝5）

Fig 4 Effect of Ica on the protein expression of PPARα and PPARγ in SHR（±s，n＝3）

3　討論

SHR大鼠與人類原發(fā)性高血壓的發(fā)病過程和機制非常相似，還能繼發(fā)一系列高血壓性心血管病變。有研究表明，Ica可抑制壓力超負荷所致的大鼠心肌纖維化［5］，且SHR大鼠在24周齡時即可明顯發(fā)生血管周圍纖維化和間質(zhì)纖維化［6］。本研究中，與空白對照組相比較，模型組SHR大鼠Hyp含量明顯上升，心肌細胞排列紊亂，且細胞肥大、延長，血管周圍纖維化和間質(zhì)纖維化，可認為心室重構(gòu)模型成功。而Ica低、高劑量組給藥至26周齡時，心肌細胞排列較模型組整齊，大鼠心肌Hyp較模型組明顯下降，血管周圍纖維化程度及間質(zhì)纖維化減少。故認為，Ica具有抗自發(fā)性高血壓大鼠心室重構(gòu)的作用。

心肌在泵血過程中，處于不間斷的收縮和舒張的狀態(tài)，消耗大量的葡萄糖和脂肪酸。葡萄糖和脂肪酸代謝失衡，脂肪酸氧化分解減少，葡萄糖代謝增加是心臟由代償性肥厚轉(zhuǎn)為充血性心衰的重要機制之一。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，共有3個亞型：PPARα、PPARβ／δ、PPARγ［7］。PPARs具有多種生物效應(yīng)，可促進脂肪細胞的分化，調(diào)節(jié)機體的糖平衡，抑制炎性因子降低炎癥形成，對心血管具有保護作用［8］。研究表明，PPARs通過調(diào)節(jié)心肌細胞的脂肪酸代謝，改變心肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的含量，從而減輕心室重構(gòu)［9，11］。PPARα在心臟內(nèi)的作用主要是調(diào)節(jié)脂肪和能量代謝為心臟提供ATP，起到保護效應(yīng)［10］。已有研究表明，PPARα激動劑可逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導的心肌細胞肥大，并抑制心肌細胞的凋亡［11］。PPARγ除了可調(diào)節(jié)脂肪細胞分化、能量代謝，還在炎癥過程中發(fā)揮著重要的作用［12］。PPARγ激動劑對心肌缺血／再灌注具有保護作用，還可抑制心肌肥厚并改善左心室功能［13］。本實驗研究顯示，與空白對照組相比較，模型組大鼠PPARα、PPARγ mRNA和蛋白的表達明顯降低，而Ica組PPARα、PPARγ mRNA和蛋白的表達與模型組相比明顯上調(diào)，提示PPARα、PPARγ參與Ica對自發(fā)性高血壓大鼠心室重構(gòu)的調(diào)節(jié)，從而減輕心室重構(gòu)。

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Icariin attenuates left ventricular remodeling in SHR by up-regulating PPARα and PPARγ

WANG Ying-wan，LI Ye-li，WANG Jun-yi，HUA Liang，YANG Dan-li
（Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education，Dept of Pharmacology，Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563000，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of Icariin （Ica）on remodeling of left ventricular in SHR and ex-plore the mechanism．Methods Twenty-one male SHR aged 14 weekswere randomly divided into model group（n＝7），low-dose of Ica-treated group（20 mg· kg－1．bid，n＝7），high-dose of Ica-treated group（40 mg·kg－1．bid，n＝7），and WKY as control group（n ＝7）．Low-and high-dose of Ica-treated groups were given Ica from the age of 14 weeks to 26 weeks．The other rats in the model group and control group were given the same amount of double distilled water．Then，the content of hydroxyproline（Hyp）was measured by ELISA．The morphological changes of the left ventricu-lar were observed by Masson staining．The mRNA and the protein expression of PPARα and PPARγ were ex-amined by real time RT-PCR and Western blot tech-nique respectively．Results Compared with the nor- mal control group，interstitium fibrosis and myofibrilla were lined up in disorder；the content of Hyp was in-creased and the mRNA and protein expression of PPARα and PPARγ were down-regulated in model group（P＜0.01）．Compared with the model group，the myocardial cells were arranged less disorderly and the myocardial fibrosis was reduced；the content of Hyp was decreased in low-and high-dose of Ica-treated groups（P＜0.01 or P＜0.05）；the mRNA and protein expression of PPARα and PPARγ were up-regulated in low-and high-dose of Ica-treated groups（P＜0.01 or P＜0.05）．Conclusion Ica may attenuate left ven-tricular remodeling in SHR by up-regulating PPARα and PPARγ．

Key words：icariin；left ventriular remodeling；PPARα；PPARγ；SHR；Western blot

作者簡介：王穎婉（1988－），女，碩士，研究方向：心血管藥理學、抗炎免疫藥理學，E-mail：763595559＠qq．com；楊丹莉（1971－），女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：心血管藥理學、抗炎免疫藥理學，通訊作者，Tel：0852-8609623，E-mail：393707603＠qq．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81241142）

收稿日期：2015－03－14，修回日期：2015－04－15

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1117－04

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．018