慢病毒介導(dǎo)的干擾ClC-3肝癌穩(wěn)定細胞株的建立及其侵襲和遷移能力的改變

徐 彬，林嘉麟，施靜雯，王施思，余 杰

（1．廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院生物制藥系，2．廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室，廣東廣州 510006）

慢病毒介導(dǎo)的干擾ClC-3肝癌穩(wěn)定細胞株的建立及其侵襲和遷移能力的改變

徐 彬1，2，林嘉麟1，施靜雯1，2，王施思1，余 杰1

（1．廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院生物制藥系，
2．廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室，廣東廣州 510006）

中國圖書分類號：R373．9；R394．2；R73-37；R735．702．2

摘要：目的 建立慢病毒介導(dǎo)的靶向干擾電壓門控氯通道3 （voltage-gated chloride channel 3，ClC-3）的穩(wěn)定肝癌細胞株，并探討其侵襲和遷移能力的改變。方法 構(gòu)建靶向ClC-3 的3個短發(fā)夾狀RNA（short-hairpin RNA，shRNA）慢病毒表達載體，293FT細胞包裝慢病毒并測定滴度。重組慢病毒感染肝癌細胞株MHCC97H，篩選穩(wěn)定干擾細胞株。實時熒光定量PCR和Western blot檢測ClC-3 mRNA和蛋白的表達以確定干擾效率。Transwell小室實驗（含Matrigel和不含Ma-trigel）和細胞劃痕實驗檢測ClC-3基因被抑制后侵襲和遷移能力的改變。結(jié)果 成功獲得4種慢病毒，感染MHCC97細胞后，建立1株陰性對照細胞和3株ClC-3穩(wěn)定干擾細胞（MHCC97H／shClC-3-1、shClC-3-2和shClC-3-3）。3株穩(wěn)定干擾細胞ClC-3 mRNA和蛋白表達水平明顯低于陰性對照細胞（P＜0.01），MHCC97H／shClC-3-2細胞對ClC-3的抑制效果最好。與陰性對照細胞相比，MHCC97H／shClC-3-2細胞侵襲和遷移能力都下降（P＜0.01）。結(jié)論成功建立穩(wěn)定干擾ClC-3基因的肝癌細胞株，ClC-3表達抑制會降低MH-CC97H細胞的侵襲和遷移能力。

關(guān)鍵詞：電壓門控氯通道3；肝癌細胞；慢病毒載體；RNA干擾；穩(wěn)定細胞株；遷移；侵襲

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．018．html

電壓門控性氯通道3（voltage-gated chloride channel 3，ClC-3）是ClC家族成員之一，廣泛分布于腦、腎、肝、骨骼肌、心臟和胰腺等組織器官，主要定位在細胞膜和細胞質(zhì)內(nèi)的囊泡膜，生理功能目前尚未完全清楚，可能通過容積激活性氯電流參與細胞容積的調(diào)節(jié)，從而參與細胞增殖、分化、凋亡和遷移等過程［1］。ClC-3在某些疾病的發(fā)生發(fā)展中也有重要作用，可能通過調(diào)控心肌細胞容積及活性氯電流參與心肌肥大的形成［2］，高表達可能參與了肺動脈高壓和肺動脈炎癥的機體適應(yīng)性反應(yīng)［3］，其缺失可能是腦海馬神經(jīng)元退化的病因［4］。研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌、肺癌、乳腺癌、膀胱移行細胞癌和人膠質(zhì)瘤組織中ClC-3高表達［5－7］，采用氯通道阻斷劑可有效抑制乳腺癌細胞的增殖，應(yīng)用ClC-3反義寡核苷酸可增強其抑制效果［8］。這些都提示ClC-3與腫瘤的關(guān)系非常密切，可能會在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)移是大多數(shù)腫瘤患者死亡的原因，ClC-3是否參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程更加值得研究和探討。本研究利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA技術(shù)，轉(zhuǎn)導(dǎo)人高轉(zhuǎn)移肝癌細胞株MHCC97H，建立穩(wěn)定干擾ClC-3基因的細胞株，并進一步觀察其體外侵襲和遷移能力的改變，為進一步研究ClC-3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，以及以ClC-3為靶點的腫瘤治療的可行性奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1．1材料 高轉(zhuǎn)移人肝癌細胞MHCC97H、人胚腎細胞293FT、大腸桿菌stb13、慢病毒包裝系統(tǒng)PL-LU2G、pLV／helper-SL3、pLV／helper-SL4和pLV／helper-SL5由本實驗室保存，胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，XhoⅠ、HpaⅠ內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自NEB公司，質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和總RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Master Mix和熒光定量PCR試劑盒SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自廣州美津生物技術(shù)有限公司，小鼠抗人GAPDH單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG均購自碧云天生物技術(shù)研究所，兔抗人ClC-3多克隆抗體購自Abcam公司，化學(xué)發(fā)光試劑購自Bio-Rad公司，Matrigel購自BD公司，Transwell小室購自Corning公司。

1．2方法

1．2．1干擾序列設(shè)計 在GenBank檢索出人ClC-3基因核苷酸序列（基因號NM＿001829），設(shè)計針對人ClC-3的3個干擾RNA序列（Tab 1）。正義與反義siRNA之間由6個堿基（CTCGAG）的loop環(huán)連接，上游鏈5′端加上一個T堿基，下游鏈5′端加上Xho I酶切粘端。同時設(shè)計1條無關(guān)序列作為陰性對照，作用序列為5′-GCTCTGGAGCAGTTCCGATAT-3′，通過BLAST驗證該序列對任何基因無干擾效應(yīng)。Oligo DNA由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

Tab 1 shRNA oligo sequences

1．2．2慢病毒表達載體的構(gòu)建及鑒定 空載體PLLU2G含有增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorecence protein，EGFP）序列，用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和HpaⅠ雙酶切空載體，并回收酶切片段。上下游Oligo DNA經(jīng)退火形成雙鏈DNA，然后與線性化后的空載體PLLU2G在T4 DNA連接酶作用下16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞stb13。37℃培養(yǎng)16 h后挑陽性克隆進行菌落PCR鑒定，PCR引物為載體多克隆位點兩端的引物，序列為pLLU2G-flank-F：5′-AGGCTTAATGTGCGATAAAAG AC-3′，pLLU2G-flank-R：5′-GAGCTTATCGATACC GTCGAC-3′，空載體質(zhì)粒會擴增出239 bp的片段，插入shRNA序列的質(zhì)粒會擴增出302 bp的片段。PCR鑒定陽性的菌落接種LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒送測序。經(jīng)測序鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為PLLU2G-shClC-3-1、PLLU2G-shClC-3-2、PLLU2G-shClC-3-3、PLLU2G-shControl。

1．2．3慢病毒包裝 收集對數(shù)生長期的293FT細胞，接種5×106個于10 cm的培養(yǎng)皿中，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。按照說明書用脂質(zhì)體進行共轉(zhuǎn)染：將輔助質(zhì)粒pLV／helper-SL3、pLV／helper-SL4、pLV／helper-SL5和目的質(zhì)粒各4 μg與40 μL Lipofectamine 2000用3 mL的無血清Opti-MEM?I培養(yǎng)液制備成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，滴加到293FT細胞中。分別收集轉(zhuǎn)染后48 h和72 h的上清液，用0.45 μm濾器進行過濾，濾液經(jīng)超速離心后濃縮，分裝，保存于－80℃。PLLU2G-shClC-3-1、PLLU2G-shClC-3-2、PLLU2G-shClC-3-3和PLLU2G-shControl經(jīng)包裝后獲得的慢病毒分別命名為Lenti-shClC-3-1、Lenti-shClC-3-2、Lenti-shClC-3-3和Lenti-shCon-trol。

1．2．4病毒滴度測定 滴度測定采用逐孔稀釋法，測定前1 d將5×107·L－1的293FT細胞按每孔100 μL接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。準(zhǔn)備10個無菌的EP管，每個管中加入90 μL培養(yǎng)基，取病毒原液10 μL加入到第1個管中，混勻后，取10μL加入到第2個管中，如此依次做10∶1倍比稀釋。選取96孔板中所需的細胞孔，吸去90 μL培養(yǎng)基，加入稀釋好的病毒溶液，37℃培養(yǎng)48 h后，加入新鮮培養(yǎng)基100 μL繼續(xù)培養(yǎng)。96 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，計數(shù)孔中熒光細胞數(shù)，結(jié)合稀釋倍數(shù)計算病毒滴度：滴度（TU／ml）＝熒光細胞數(shù)×有效稀釋倍數(shù)。

1．2．5 穩(wěn)定干擾細胞株的建立 感染前1 d取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的MHCC97H細胞按每孔5×105個接種于6孔板。感染時，按照MOI＝100稀釋慢病毒，孔中分別加入含8 mg·L－1聚凝胺的4種稀釋后病毒液1 mL，同時設(shè)定空白的靶細胞作為對照。培養(yǎng)16 h后，更換為新鮮RPMI 1640完全培養(yǎng)基2 mL繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后熒光顯微鏡下觀察感染效率。將感染后的細胞用胰酶消化后制成單細胞懸液，按照每皿1 000個的密度接種于10 cm的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至形成單克隆細胞團，選擇單克隆細胞再一次進行克隆，然后挑取足夠數(shù)量單克隆細胞進行擴增培養(yǎng)，為下一步檢測作準(zhǔn)備。得到的3株穩(wěn)定干擾細胞分別命名為MHCC97H／shClC-3-1、MH-CC97H／shClC-3-2和MHCC97H／shClC-3-3，陰性對照細胞命名為MHCC97H／shControl。

1．2．6定量PCR檢測細胞ClC-3 mRNA干擾效率收集MHCC97H／shClC-3-1、MHCC97H／shClC-3-2、MHCC97H／shClC-3-3和MHCC97H／shControl細胞，按TRIzol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提供的方法提取細胞總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此cDNA為模板，應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒進行PCR擴增，ClC-3和GAPDH基因（內(nèi)參照）引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。ClC-3：5′-GGTTC-CATCAGGCTTGTTCATCC-3′（上游），5′-CCGACCT-CACACCACTCCTTAAAG-3′（下游）；GAPDH：5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′（上游），5′-AC-CACCCTGTTGCTGTAGCC-3′（下游）。PCR反應(yīng)條件：95℃60s；95℃15s、60℃1 min，共40個循環(huán)。以2－ΔΔCt值表示ClC-3基因mRNA的相對表達水平。

1．2．7Western blot檢測細胞ClC-3蛋白干擾效率收集MHCC97H／shClC-3-1、MHCC97H／shClC-3-2、MHCC97H／shClC-3-3和MHCC97H／shControl細胞，加入細胞裂解液冰上裂解10 min，取蛋白上清用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度。取50～80 μg蛋白質(zhì)進行10%SDS-PAGE電泳，分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h；加入1∶1 000稀釋的兔抗人ClC-3多克隆抗體和1∶2 000稀釋的小鼠抗人GAPDH單克隆抗體，4℃反應(yīng)過夜；TBS洗膜后，分別加入1∶2 000稀釋的二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG），室溫反應(yīng)2 h；TBS洗滌后，加入化學(xué)發(fā)光試劑，X線膠片曝光、顯影和定影。掃描膠片，對各蛋白條帶進行灰度值分析，以ClC-3蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示ClC-3蛋白的相對表達水平。

1．2．8Transwell小室實驗檢測細胞侵襲和遷移能力 進行侵襲實驗時，Transwell小室濾膜（孔徑8 μm）外表面涂纖粘連蛋白5 μg，內(nèi)表面涂Matrigel基質(zhì)膠5 μg；24孔板內(nèi)加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，將Transwell小室浸入24孔板中。用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸MH-CC97H／shClC-3-2和MHCC97H／shControl細胞，將1 ×109·L－1的細胞懸液按每小室100 μL加到小室中，孵育6 h。取出Transwell小室，濾膜用甲醇固定1 min，HE染色，擦去濾膜內(nèi)表面未穿過的細胞。于顯微鏡下（200×）計數(shù)穿過濾膜的細胞數(shù)。每膜計數(shù)上下左右中5個隨機不同視野，每組設(shè)4個樣本。細胞遷移實驗與侵襲實驗相似，只是濾膜內(nèi)表面不涂Matrigel。

1．2．9細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 收集MHCC97H／shClC-3-2和MHCC97H／shControl細胞，按5×108·L－1接種2 mL于6孔板中，培養(yǎng)過夜至形成單細胞層。用10 μL吸頭在單細胞層上劃痕，然后用PBS清洗3次去除劃下的細胞。細胞加入無血清，含0.05 mg·L－1表皮細胞生長因子的RP-MI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，在不同時間點下拍照，測量劃痕閉合寬度。

1．2．10統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，兩組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗，多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。

2　結(jié)果

2．1重組慢病毒質(zhì)粒的PCR和測序鑒定 PCR

鑒定重組慢病毒質(zhì)粒時，連接入shRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為302 bp，而空載體克隆PCR片段大小為239 bp。將PCR產(chǎn)物進行電泳，第1對靶點序列結(jié)果顯示2＃、5＃和6＃克隆為陽性克隆，第2對靶點序列結(jié)果顯示1＃、2＃、3＃、4＃、6＃、7＃和8＃為陽性克隆，第3對靶點序列結(jié)果顯示3＃、5＃、6＃、7＃和8＃為陽性克隆（Fig 1）。從每個靶點序列的陽性克隆中各選一個進行測序，結(jié)果顯示序列均正確。

2．2慢病毒包裝、滴度測定和感染后MHCC97H細胞形態(tài)觀察 4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48 h，熒光顯微鏡下觀察到大量的綠色熒光產(chǎn)生，大部分細胞破裂釋放病毒，證實慢病毒包裝成功（Fig 2A）。將病毒進行濃縮后，用逐孔稀釋法測得Lenti-shClC-3-1、Lenti-shClC-3-2、Lenti-shClC-3-3和Lenti-shControl 4種病毒的滴度分別是7.0×1011TU·L－1、6.3×1011TU ·L－1、7．2×1011TU·L－1和8.3×1011TU·L－1。用4種慢病毒分別感染MHCC97H細胞后，都可觀察到綠色熒光，感染率達到100%（Fig 2B）。

Fig 1 Identification of recombinant lentiviral vectors with PCR

Fig 2 Packaging lentiviruses in 293FT cells and MHCC97H cells after infected with the recombinant lentiviruses under fluorescence microscope（200×）

2．3穩(wěn)定干擾細胞株ClC-3 mRNA和蛋白干擾效率檢測 實時熒光定量PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，3株穩(wěn)定干擾細胞ClC-3 mRNA和蛋白的相對表達水平都明顯低于MHCC97H／shControl細胞。MHCC97H／shClC-3-1、MHCC97H／shClC-3-2和MH-CC97H／shClC-3-3的ClC-3 mRNA干擾率分別是（76.70±4.28）%、（89.46±2.37）和（58.12± 5.29）%（Fig 3A），ClC-3蛋白干擾率分別是（81.44 ±5.48）%、（92.14±5.92）%和（70.55±4.85）% （Fig 3B），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。MH-CC97H／shClC-3-2細胞干擾效果最好，后續(xù)實驗選用它作為細胞模型進行功能性研究。

2．4穩(wěn)定干擾細胞株侵襲和遷移能力的改變 采用Transwell小室檢測穩(wěn)定干擾細胞株MHCC97H／shClC-3-2侵襲和遷移能力的變化（Fig 4）。細胞侵襲實驗中，MHCC97H／shControl和MHCC97H／shClC-3-2細胞中穿膜的細胞數(shù)分別為（181±13）和（105±11），MHCC97H／shClC-3-2細胞的穿膜數(shù)明顯減少（P＜0.01）；細胞遷移實驗中，MHCC97H／shControl和MHCC97H／shClC-3-2細胞穿膜的細胞數(shù)分別為（372±19）和（189±14），MHCC97H／shClC-3-2細胞的數(shù)量也同樣明顯減少（P＜0.01）。結(jié)果表明干擾ClC-3可抑制MHCC97H細胞的侵襲和遷移。

Fig 3 Detection of ClC-3 interference efficiency（±s，n＝4）

在細胞劃痕實驗中，細胞劃痕后采用無血清培養(yǎng)基能排除細胞增殖的影響。結(jié)果顯示MH-CC97H／shClC-3-2細胞的遷移能力明顯降低（Fig 5）。劃痕48 h后，MHCC97H／shControl細胞劃痕閉合率為100%，而MHCC97H／shClC-3-2細胞只有（60.35±5.76）%，明顯低于前者（P＜0.01）。

3　討論

Fig 4 Effect of ClC-3 interference on invasion and migration of MHCC97H cells detected by Transwell chamber assay（±s，n＝4）（200×）

Fig 5 Effect of ClC-3 interference on migration of MHCC97H cells detected by cell scratch assay（±s，n＝4）（200×）

ClC-3與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，可能參與了腫瘤細胞增殖、凋亡和耐藥等重要過程［9-11］。腫瘤細胞遷移能力增強通常提示其轉(zhuǎn)移能力增加，我們的前期研究中用反義寡核苷酸抑制鼻咽癌細胞中ClC-3的表達可使細胞遷移率下降［12］，提示ClC-3可能在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用，但在后來的研究中發(fā)現(xiàn)此方法存在脫靶效應(yīng)［13］。為了更深入地研究ClC-3在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，需要更好的細胞模型，而肝癌轉(zhuǎn)移率很高，因此本研究采用人高轉(zhuǎn)移肝癌細胞MHCC97H作為研究細胞。

為了確定ClC-3是否參與了肝癌轉(zhuǎn)移，我們希望抑制MHCC97H細胞內(nèi)源性ClC-3的表達來研究其對腫瘤的作用。目前，RNA干擾技術(shù)已成為研究基因功能的重要工具，但化學(xué)合成的siRNA存在轉(zhuǎn)染效率低、轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)后半衰期短、對靶基因的表達抑制作用只能維持較短時間等缺陷［14］。而將shRNA載體導(dǎo)入細胞后，能在細胞內(nèi)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄，并進一步生成靶基因特異性的siRNA，因此可以長期抑制靶基因表達的作用［15］。但普通shRNA僅可轉(zhuǎn)染分裂期細胞且轉(zhuǎn)染效率低。近年來發(fā)展的慢病毒技術(shù)，其免疫原性低、感染范圍廣，可整合到宿主細胞基因組穩(wěn)定產(chǎn)生siRNA，高效抑制靶基因表達，而且可以濃縮，大大提高其轉(zhuǎn)染效率，使得慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾成為穩(wěn)定基因沉默的最常用選擇［16］。本實驗依據(jù)RNA干擾技術(shù)設(shè)計了特異性靶向ClC-3基因不同位點的3條不同干擾shRNA，通過慢病毒的介導(dǎo)轉(zhuǎn)染MHCC97H細胞，經(jīng)篩選獲得了穩(wěn)定干擾ClC-3基因表達的3株細胞。干擾效率最好的MHCC97H／shCLC-3-2細胞，其ClC-3 mRNA抑制效率為89.46%，ClC-3蛋白抑制效率高達92.14%。我們的前期研究中，利用反義寡核苷酸抑制鼻咽癌細胞CNZ2Z的ClC-3表達，在mRNA和蛋白水平的抑制率最高分別為77.5%和74.1%［12］，這表明采用慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)來抑制ClC-3的表達是一種更好的研究方法。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個非常復(fù)雜的過程，腫瘤細胞獲得侵襲和遷移能力是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一。本研究顯示，MHCC97H／shCLC-3-2細胞的穿膜能力在侵襲和遷移實驗中比MHCC97H／shControl細胞明顯降低，說明抑制ClC-3的表達可抑制肝癌細胞的侵襲和遷移，提示ClC-3在肝癌細胞侵襲和遷移中發(fā)揮了重要作用。細胞劃痕實驗進一步證實，抑制ClC-3的表達可明顯抑制肝癌細胞遷移能力。非特異性ClC抑制劑NPPB可劑量依賴性的抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的侵襲和遷移［17］，用反義寡核苷酸抑制鼻咽癌細胞ClC-3的表達可明顯抑制其遷移能力［12］，因此推測，ClC-3可能在實體瘤中普遍具有促進腫瘤細胞侵襲和遷移的作用。Lui等［18］研究發(fā)現(xiàn)，NPPB可以完全抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲，但單獨使用ClC-3 siRNA和ClC-3抑制劑或聯(lián)合使用上述兩者卻都不能完全抑制細胞的侵襲，可見，可能有其他ClC家族成員在腫瘤細胞侵襲中也發(fā)揮了作用。但ClC-3是否參與了腫瘤的體內(nèi)轉(zhuǎn)移過程以及調(diào)控腫瘤細胞侵襲和遷移的具體機制有哪些，值得進一步的深入研究。

綜上所述，我們應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)成功建立了穩(wěn)定抑制ClC-3基因表達的肝癌細胞株，ClC-3表達抑制明顯降低肝癌細胞MHCC97H的侵襲和遷移能力，但其具體的調(diào)控機制還有待進一步研究。

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Establishment of a hepatic carcinoma cell line with stable ClC-3 silencing by lentivirus-mediated RNA interference and its influence on invasion and migration

XU Bin1，2，LIN Jia-lin1，SHI Jing-wen1，2，WANG Shi-si1，YU Jie1
（1．Dept of Biopharmaceutics，School of Biosciences and Biopharmaceutics，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2．Guangdong Province Key Laboratory for Biotechnology Drug Candidates，Guangzhou 510006，China）

Abstract：Aim To establish a hepatic carcinoma cell line with stable voltage-gated chloride channel 3（ClC-3）gene silencing through the lentivirus-mediated short-hairpin RNA（shRNA）method and investigate the effects of gene silencing on invasion and migration．Methods Three lentiviral vectors coding shRNA tar-geting ClC-3 gene were constructed，the recombinant plasmids were packaged into mature lentivirus by 293FT cells，and then the lentiviruses were harvested，concentrated and titrated．MHCC97H cells were infec-ted with the recombinant lentiviruses and then were se-lected to obtain cell lines stably expressing ClC-3 shR-NA．The efficiency of ClC-3 mRNA and protein ex-pression interference were determined by real-time flu-orescence quantitative PCR and Western blot，respec-tively．The effects of ClC-3 gene interference on inva-sion and migration of MHCC97H cells were performed by Transwell chamber assays with or without Matrigel and cell scratch assay．Results The recombinant lentiviral vectors were successfully constructed and four lentiviruses were acquired after packaged by 293FT cells．One negative control cell line and three cell lines with ClC-3 gene interference（MHCC97H／shClC-3-1，shClC-3-2 and shClC-3-3）were successfully construc-ted after MHCC97H cells were infected with lentivirus-es．The expression level of ClC-3 mRNA and protein in three ClC-3-silenced cells were obviously lower than the negative control cells（P＜0.01），MHCC97H／shClC-3-2 cells showed the greatest inhibition of ClC-3 mRNA and protein expressions．As compared with the negative control cells，the ClC-3 gene interference sig-nificantly decreased invasion and migration of MH-CC97H cells in vitro（P＜0.01）．Conclusion The hepatic carcinoma cell lines with stable ClC-3 gene si-lencing were successfully established and the ClC-3 gene interference could significantly inhibit invasion and migration of MHCC97H cells．

Key words：voltage-gated chloride channel 3；hepatic carcinoma cells；lentiviral vector；RNA interference；stable cell line；migration；invasion

作者簡介：徐 彬（1975－），女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：離子通道蛋白功能及靶向藥物篩選，通訊作者，Tel：020-39352151，E-mail：xubin2003＠163．com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No 31371144，81101666）

收稿日期：2015－05－07，修回日期：2015－06－08

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1101－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．015