3，5，2’，4’-四羥基查爾酮對(duì)尿酸誘導(dǎo)高尿酸血癥小鼠尿酸排泄的影響研究

普菁瑩，牛艷芬，高麗輝，林 華，涂彩霞，李 玲

（昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究中心，云南昆明 650500）

3，5，2’，4’-四羥基查爾酮對(duì)尿酸誘導(dǎo)高尿酸血癥小鼠尿酸排泄的影響研究

普菁瑩，牛艷芬，高麗輝，林 華，涂彩霞，李 玲

（昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究中心，云南昆明 650500）

中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)：R-332；R322．61；R446．11；R589.9；R916.4

摘要：目的 研究3，5，2’，4’-四羥基查爾酮（P40）對(duì)尿酸誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠尿酸排泄的影響，以及對(duì)尿酸腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體9（GLUT9）、尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體1（URAT1）的調(diào)控作用。方法 昆明種小鼠60只，隨機(jī)分為正常組、模型組、P40 2．0、4．0、8．0 mg·kg－1組以及陽(yáng)性對(duì)照組，分別灌胃給予受試藥物5次；腹腔注射尿酸（150 mg·kg－1）誘導(dǎo)成高尿酸血癥小鼠，磷鎢酸法測(cè)定血尿酸水平和肝尿酸含量；RT-PCR和Western blot檢測(cè)小鼠腎臟GLUT9、URAT1的表達(dá)。結(jié)果 ①P40（4.0、8.0 mg·kg－1）劑量組明顯降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，0.01）；各實(shí)驗(yàn)組肝尿酸含量降低，與正常組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。②P40各劑量組URAT1基因表達(dá)水平無(wú)明顯變化，蛋白表達(dá)水平有下降趨勢(shì)，但尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。P40（2.0、4.0、8.0 mg· kg－1）組GLUT9基因表達(dá)水平具有下調(diào)趨勢(shì)，但與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；P40（4.0、8.0 mg·kg－1）組GLUT9蛋白表達(dá)水平明顯下降，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 P40具有促進(jìn)高尿酸血癥小鼠尿酸排泄的作用，其機(jī)制與下調(diào)GLUT9的蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：3，5，2’，4’-四羥基查爾酮；高尿酸血癥小鼠；尿酸；GLUT9；URAT1；尿酸排泄

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．016．html

痛風(fēng)（gout）是由于體內(nèi)尿酸結(jié)晶沉積到軟組織，引發(fā)急、慢性炎癥和組織損傷，出現(xiàn)臨床癥狀和體征的一組臨床綜合征。通常認(rèn)為高尿酸血癥是痛風(fēng)最重要的生化基礎(chǔ)，據(jù)統(tǒng)計(jì)有5%～12%的高尿酸血癥最終可發(fā)展為痛風(fēng)［1］。任何原因引起尿酸生成增多和（或）排泄減少均可導(dǎo)致高尿酸血癥，其中尿酸排泄減少約占原發(fā)性高尿酸血癥患者的90%［2］。腎臟在尿酸的排泄中占有重要地位，體內(nèi)2／3的尿酸由腎臟排泄，經(jīng)過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)、腎小管重吸收、再分泌和再吸收而排出體外，其中腎小管對(duì)尿酸的重吸收是影響血尿酸水平的主要環(huán)節(jié)。近年的研究認(rèn)為腎臟的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體URAT1／SLC22A12、GLUT9／SLC2A9參與了尿酸的重吸收。

3，5，2′，4′-四羥基查爾酮（C15H12O5，P40）（Fig 1）是中國(guó)科學(xué)院昆明植物所朱華結(jié)研究員課題組以3，5-二羥基苯甲酸為原料合成的查爾酮類(lèi)化合物［3］。該類(lèi)化合物存在于甘草、啤酒花、鐮形棘豆等藥用植物中，由于其分子結(jié)構(gòu)有較大柔性，能與不同的受體結(jié)合，具有廣泛的生物活性［4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)P40具有較強(qiáng)的降尿酸作用，其機(jī)制與抑制黃嘌呤氧化酶／黃嘌呤脫氫酶（XOD／XDH）的活性有關(guān)［5－6］。然而，P40的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同于上市的黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌醇和非布索坦，很可能存在新的作用機(jī)制和靶點(diǎn)。鑒于腎臟在尿酸排泄中的重要作用，本研究擬從腎臟尿酸排泄角度探討P40的降尿酸作用及其分子機(jī)制，為闡明P40的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

Fig 1 Structure of 3，5，2’，4’-tetrahydroxychalcone

1　材料

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，♂，體質(zhì)量18～22 g，由四川成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：［SCXK（川）2011－24］，自由飲食。

1．2主要材料與試劑 3，5，2’，4’-四羥基查爾酮：由中國(guó)科學(xué)院昆明植物所朱華結(jié)研究員課題組合成并提供，分子質(zhì)量為272．25；苯溴馬?。旱聡?guó)赫曼大藥廠生產(chǎn)，由昆山龍燈瑞迪制藥有限公司分裝；尿酸：購(gòu)于Sigma公司；尿酸測(cè)定試劑盒：南京建成生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；URAT1抗體：購(gòu)于Protein公司；GLUT9抗體：購(gòu)于Sigma公司；β-actin、山羊抗兔IgG／辣根酶標(biāo)記：Abmart公司。

1．3儀器 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：Molecular Devices公司，型號(hào)：SPECTRA MAX190；電熱恒溫水浴箱：北京長(zhǎng)風(fēng)公司，型號(hào)：HH·W21；高速冷凍離心機(jī)：HERM-LE公司，型號(hào)：Z300K；酶標(biāo)板：美國(guó)Costar公司。

2　方法

2．1動(dòng)物分組及給藥 選取標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量（18～22 g）♂昆明小鼠60只，隨機(jī)分為正常組、高尿酸血癥模型組、P40（2.0、4.0、8.0 mg·kg－1）劑量組、苯溴馬隆12.5 mg·kg－1組，各給藥組共灌胃給藥5次，每天兩次；腹腔注射尿酸150 mg·kg－13次誘導(dǎo)形成高尿酸血癥小鼠［7］，正常對(duì)照組則注射等體積溶媒。末次腹腔注射尿酸前40 min灌胃給予各受試藥物，給藥后1 h眶靜脈取血，3 000 r·min－1離心10 min，取血清；斷頸處死小鼠，迅速分離肝臟和腎臟，液氮凍存后于－80℃保存?zhèn)錅y(cè)。磷鎢酸法測(cè)定小鼠血尿酸水平和肝尿酸含量［8］。

2．2RT-PCR檢測(cè)腎臟URAT1、GLUT9基因表達(dá)水平 小鼠URAT1、GLUT9引物采用DNAMAN 6．0設(shè)計(jì)（Tab 1），經(jīng)PubMed BLAST驗(yàn)證后，由上海生工生物工程有限公司合成。每組隨機(jī)選取4例凍存的小鼠腎臟，提取總RNA后，ND-1000定量，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，隨后進(jìn)行擴(kuò)增。URAT1的擴(kuò)增條件為：94℃2 min、94℃30 s、58℃35 s、72℃45 s、72℃10 min、4℃30 cycles，GLUT9的擴(kuò)增條件為：94℃2 min、94℃30 s、57．7℃35 s、72℃45 s、72℃10 min、4℃30 cycles。電泳后的瓊脂糖凝膠用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行凝膠成像，并對(duì)條帶進(jìn)行灰度比值分析。

Tab 1 RT-PCR primer sequence

2．3Western blot檢測(cè)腎臟URAT1、GLUT9蛋白的表達(dá)水平 取凍存的小鼠腎臟，每組4例，組織裂解液提取小鼠腎臟組織總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白與上樣緩沖液的比例為1∶4，混勻后95℃10 min煮沸變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳；濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜；脫脂奶粉37℃搖床封閉膜2 h；4℃過(guò)夜孵育URAT1、GLUT9一抗（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）；TBST洗膜，室溫?fù)u床孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000）1 h；TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光。BIO-RAD系統(tǒng)成像，URAT1、GLUT9蛋白的相對(duì)表達(dá)量用URAT1、GLUT9與β-actin的光密度比值進(jìn)行計(jì)算。

3　結(jié)果

3．1P40對(duì)尿酸誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠血尿酸水平和肝尿酸含量的影響 與正常組比較，模型組小鼠血尿酸水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示模型復(fù)制成功；灌胃給予P40后，P40 （4.0、8.0 mg·kg－1）組及苯溴馬隆組血尿酸水平明顯下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并呈現(xiàn)劑量－效應(yīng)關(guān)系；與正常組比較，模型組及各給藥組肝尿酸水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；各給藥組的肝尿酸水平與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（Tab 2）。

Tab 2 Effects of P40 on uric acid levels in serum and liver in hyperuricemic mice（±s，n＝10）

Tab 2 Effects of P40 on uric acid levels in serum and liver in hyperuricemic mice（±s，n＝10）

＃＃P＜0．01 vs normal；*P＜0.05，**P＜0．01 vs model．

Group Dose／mg·kg－1 Uric acid Serum／μmol·L－1　Liver／μmol·g－1tissue Normal（CMC-Na）?。?86．77±20．52　4．97±0．37 Model（CMC-Na）　－　382．66±68．85＃?！?．85±0．59＃＃P40　2．0　346．31±46．88　4．10±0．46＃＃4．0　319．49±40．04*　4．09±0．82＃＃8．0　261．05±41．92**　3．76±0．26＃＃Benzbromarone　12．5　222．61±16．45**　4．03±0．34＃＃

3．2P40對(duì)尿酸誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠腎臟URAT1基因、蛋白表達(dá)水平的影響 由Fig 2可看出小鼠腎臟URAT1基因表達(dá)水平無(wú)變化。模型組URAT1蛋白表達(dá)上調(diào)，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P40各系列給藥組UART1蛋白表達(dá)均有下調(diào)趨勢(shì)，但與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；苯溴馬隆組下調(diào)URAT1蛋白表達(dá)，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3．3P40對(duì)尿酸誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠腎臟GLUT9基因、蛋白表達(dá)水平的影響 由Fig 3可見(jiàn)，模型組GLUT9基因表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)，但與正常組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P40各給藥組以及苯溴馬隆組其基因表達(dá)有下調(diào)趨勢(shì)，但與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組GLUT9的蛋白表達(dá)上調(diào)，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P40 4.0、8.0 mg· kg－1給藥組GLUT9蛋白表達(dá)下調(diào)，并呈現(xiàn)一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而P40 2.0 mg·kg－1給藥組有下調(diào)GLUT9蛋白表達(dá)的趨勢(shì)，但與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；苯溴馬隆組對(duì)其蛋白表達(dá)沒(méi)有影響。

4 討論

尿酸是人類(lèi)嘌呤代謝的終末產(chǎn)物，由次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成黃嘌呤，再在該酶的作用下進(jìn)一步生成尿酸，而肝臟作為黃嘌呤氧化酶的高表達(dá)器官，是尿酸生成的主要場(chǎng)所，對(duì)機(jī)體尿酸的穩(wěn)態(tài)起著重要的調(diào)節(jié)作用。體內(nèi)生成70%的尿酸經(jīng)由腎臟排泄。因此，增加體內(nèi)尿酸、尿酸前體（次黃嘌呤、黃嘌呤）的量或抑制腎臟尿酸的排泄均可引起血尿酸水平的增高導(dǎo)致高尿酸血癥。本研究采用直接補(bǔ)充大劑量的外源性尿酸誘導(dǎo)形成高尿酸血癥小鼠［7，9］，在不影響小鼠自身尿酸生成的前提下，觀察P40對(duì)尿酸排泄的影響。結(jié)果表明P40劑量依賴(lài)性地降低了高尿酸血癥小鼠的血尿酸水平，與促尿酸排泄藥苯溴馬隆相似，提示P40具有促進(jìn)尿酸排泄的作用。此外，在本實(shí)驗(yàn)條件下，模型組及各用藥組的肝臟尿酸含量均低于正常組，提示大劑量的外源性尿酸進(jìn)入機(jī)體后，有可能抑制了肝尿酸的生成。

Fig 2 Effects of P40 on renal mURAT1 mRNA and protein levels in hyperuricemic mice（±s，n＝4）

Fig 3 Effects of P40 on renal mGLUT9 mRNA and protein levels in hyperuricemic mice（±s，n＝4）

研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞頂端膜和基底膜上的多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與尿酸的重吸收和分泌有關(guān)［10］，其中尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體URAT1／SLC22A12［11］和GLUT9／SLC2A9［12］參與了尿酸的重吸收。URAT1和GLUT9分別表達(dá)于腎近端小管上皮細(xì)胞的頂端膜與基底膜，URAT1將尿酸從小管液中攝入小管細(xì)胞內(nèi)，再經(jīng)GLUT9泵出小管細(xì)胞基底膜，進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì)和外周血管。URAT1基因突變將導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)體功能減退或喪失而表現(xiàn)出腎性低尿酸血癥，提示URAT1是影響血尿酸水平的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［11］。苯溴馬隆即是以URAT1為靶點(diǎn)的促尿酸排泄藥，本實(shí)驗(yàn)條件下也觀察到苯溴馬隆干預(yù)了該轉(zhuǎn)運(yùn)體的蛋白表達(dá)，然而，P40則對(duì)高尿酸血癥小鼠腎臟URAT1的基因、蛋白表達(dá)均無(wú)太大影響，初步提示P40促尿酸排泄作用的靶點(diǎn)并非URAT1。

GLUT9主要表達(dá)于腎臟和肝臟，雖然是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員之一，與GLUTs有相似的氨基酸序列，然而，其轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖和果糖的能力較低［13］。新近研究顯示GLUT9與尿酸的轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，是一種高能尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。該轉(zhuǎn)運(yùn)體以電壓依賴(lài)的方式將尿酸從小管細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞間質(zhì)和外周血管中，它的轉(zhuǎn)運(yùn)功能并不依賴(lài)于Na＋，而當(dāng)細(xì)胞外K＋濃度升高時(shí)，其轉(zhuǎn)運(yùn)功能增強(qiáng)，故又稱(chēng)為電勢(shì)驅(qū)動(dòng)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（voltage driven urate transporter 1，URATv1）［14－15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P40明顯降低高尿酸血癥小鼠腎臟GLUT9蛋白的表達(dá)，而對(duì)GLUT9的mR-NA水平僅有下調(diào)趨勢(shì)，并未達(dá)到顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明P40主要干預(yù)了GLUT9蛋白的合成，而對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程影響不明顯。此外，本研究顯示苯溴馬隆對(duì)GLUT9的mRNA和蛋白表達(dá)均無(wú)明顯影響，提示P40促進(jìn)尿酸排泄的機(jī)制與苯溴馬隆不同，可能是通過(guò)下調(diào)GLUT9蛋白的表達(dá)，減少尿酸的重吸收而起到降尿酸的作用。

綜上所述，P40具有促進(jìn)高尿酸血癥小鼠尿酸排泄的作用，其機(jī)制與下調(diào)GLUT9蛋白的表達(dá)有關(guān)。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)均在昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究中心完成。感謝該實(shí)驗(yàn)室提供優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境以及先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，感謝云南省“孔祥復(fù)院士工作站”團(tuán)隊(duì)給予的指導(dǎo)和幫助，讓該實(shí)驗(yàn)得以順利完成。謝謝！）

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Effects of 3，5，2’，4’-tetrahydroxychalcone on urate excretion in hyperuricemic mice

PU Jing-ying，NIU Yan-fen，GAO Li-hui，LIN Hua，TU Cai-xia，LI Ling
（Biomedical Engineering Research Center，Kunming Medical University，Kunming 650500，China）

Abstract：Aim To investigate the effects of 3，5，2’，4’-tetrahydroxychalcone（P40）on urate excretion，as well as mRNA and protein expressions of renal URAT1 and GLUT9 in hyperuricemic mice．Methods Sixty Kunming mice were randomly divided into six groups：normal control group，hyperuricemic group（model group），P40 2．0，4．0，8．0 mg·kg－1groups and positive control group．All drugs were administered in-tragastrically to mice for 5 doses．Hyperuricemic mice were induced by intraperitoneal injection of uric acid （0．15 g·kg－1body weight）for 3 times．The urate levels were assayed with the phosphotungstic acid method．The mRNA and protein expressions of GLUT9 and URAT1 were determined by RT-PCR and Western blot．Results P40 at a dose of 4．0 and 8．0 mg· kg－1significantly reduced the serum urate levels in a dose-dependent manner，when compared with untreat-ed hyperuricemic mice（P＜0.05 or 0.01）．The he-patic urate contents decreased in untreated-and treated-hyperuricemic mice as compared with normal mice（P ＜0.01）．Furthermore，P40 had no influence on the renal URAT1 mRNA and protein expression levels，while it could down-regulate renal GLUT9 protein ex-pression but not mRNA expression in hyperuricemic mice．Conclusion P40 possesses potent uricosuric effects associated with urate reabsorption by down-regu-lating the protein expression of GLUT9 in kidney．

Key words：3，5，2’，4’-tetrahydroxychalcone；hype-ruricemic mice；uric acid；GLUT9；URAT1；urate ex-cretion

作者簡(jiǎn)介：普菁瑩（1990－），女，碩士生，研究方向：內(nèi)分泌代謝藥理學(xué)，E-mail：381561758＠qq．com；李 玲（1962－），女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：內(nèi)分泌代謝藥理學(xué)，通訊作者，Tel：0871-65922743，E-mail：kmli62＠aliyun．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81260503，81360505）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（No 2012FB020，2013FZ076，2013Z112）

收稿日期：2015－04－20，修回日期：2015－05－27

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）08－1091－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．013